Штамм гриба @ @ @ -130-продуцент лимонной кислоты Советский патент 1983 года по МПК C12N15/00 C12P7/48 

а:

00 00 Изобретение относится к микробио логической промышленности и касается нового штамма, используемого для . производства лимонной, кислоты при поверхностном выращивании его на углеводсодержащих средах. Известны различные штаммы-продуценты лимонной кислоты рода Candi da Pichia, Debaryomyces , Brettanomy ces, Brevibacter ium , Corynebact eriu Arthrobacter , Achromobacter, Penici lium, полученные с помощью радиации высокой энергии: УФ-, Со, Х-лучи и др. или путем воздействия химических мутагенов: нитрита натри гидроксиламина, нитроэогуани 1ина, акрифлавина 8-азогуанина и азотисто го пирита Т Известен штамм гриба A.niger Л-1 имеющий высокую продуктивность по о разованиш лимонной кислоты, но отличающийся замедленным ростом на средах из мелассы в течение 12 ч после посева конидий 2j , Цель изобретения - получение про дуцента лимонной кислоты для поверх ностного способа культивирования, быстро растущего на средах из мелас сы, обладающего высокой продуктивностью на мелассах различной ферментации и, одновременно, отличающе гося стабильностью культур при размножении , Штамм получен в результате много ступенчатой селекции музейного штам ма f 130, сохраняемого в коллекции чистых культур микрорганизмов ЛНИИП Первая ступень селекции состояла в искусственном отборе естественновозникающих активных форм (спонтанный отбор), в результате получен вариант № 15, синтезирующий на 13% больше лимонной кислоты по сравнени с исходным штаммом. Дальнейшая селе ция варианта с помощью комби нированной обработки парами этилени мина в течение 1 ч и УФ-лучей в дозе 1 кДж/м позволила получить вариант 130/15-62, превосходящий ки лотообразование исходного штамма 130 на821,5%. Последующий спонтанный отбор дал возможность увеличить активность исходного штамма до 30%. В результате получен вариант 130/15-62/2, который подвергли дальнейшей селекции с помощью комбинированного воздействия парами диэтилсульфаТа (ДЭС ) в течение 3 ч и УФ-лучами -в дозе 1 кДж/м, Выделенный после мутагенной обработки с последующим спонтанным отбором вариант 130/15-62/2-3/5 синтезировал 2100 г лимон ной кислоты с 1 м2 в сутки. Конидии этого активного варианта обрабатыва ли парами этиленимина в течение 15 мин в сочетании с УФ-облучением в дозе 1,-кДж/м. В результате получен вариант 130/15-62/2-5-73, Названный впоследствии Л-130. образующий до 2120 г кислоты с 1 м в сутки, что превысило кислотообразование у исходного родительского штамма 130 на 42,3% (табл. 1). Селекционированный штамм генетически существенно отличается от серии производственных штаммов, применяемых в СССР. Штамм Л-130 имеет следующие отличительные морфологические признаки: стеригмы первого порядка у него длиннее в 2,5 раза, поверхность оболочки конидий покрыта шипами, у производственных штаммов ЭУ-119, Р-1, Л-106 оболочка конидий бугорчатая. Штамм Л-130 образует конидии зеленсйато-черной окраски на длинных конидиеносцах. Конидии у нового штамма начинают прорастать через 5,5 ч, у производственных штаммов Р-1 и Л-106 через 9 ч. Изучение устойчивости штамма Л-130 к бактериям, .сопутствующим производству лимонной кислоты, показало, что новый штамм не уступает производственным штаммам по устойчивости к Б, acrogenes, Е, coli И более устойчив к Вас, mesenteriсив. Исследование продуктивности штамма Л-130 на образцах мелассы средней ферментируемости показало, что на ЭТОЙ мелассе штамм Л-130 сохраняет активность на высоком уровне (1800-2100 г с 1 м в сутки), выход от сахара 74-82%; в то время как производственный штамм Л-106 на данной мелассе синтезирует 1600-1750 г, выход лимонной кислоты от сахара составляет 61-67%. Такие мелассы в настоящее время имеют все большее распространение и применение их на заводах лимонной кислоты приводит к значительному снижению съемов кислоты с единицы оборудования и снижению выхода ее от сахара. Таким образом, штамм Л-130 гарантирует более высокую устойчивость и более высокую продукт ивность биосинтеза лимонной кислоты при культивировании на мелассах, применяемых в производстве по -сравнению со штаммами AspergiUus niger, используемыми в настоящее время в производстве при поверхностном выращивании. Морфолого-физиологическая характеристика штамма. Морфологические свойства щтамма изучали у пятисуточных культур, выращенных при 32С. Новый штамм AspergiI2us niger Л-130 на сусло-агаре образует круглую колонию диаметром 41-43 мм. Субстратный мицелий кремовый, плотный радиально-складчатый. Складчатость более выражена в центре колонии в диаметре 15 мм. Воздушный мицелий создаваемый конидиеносцами) белый, средней оп шенности. Конидиальные головки зеленовато-черноокраииенные, крупные, обильно образуются по всей поверхности колонии. Нарастающий край колонии, лишенный зрелых конидиальных головок, шириной около 1 мм. На среде Чапека колонии диаметром 48-50 мм. Диаметр конидиальной головки 100-128 мкм. Максимальная дли на конидиеносца 4 мм, диаметр сечения пузырька конидиеносца 53-58 мкм Стеригмы двуслойные. Первичные стери мы длиной 24-28 мкм, вторичные 8-10 мкм. На каждой первичной стери ме образуются по две вторичные стеригмы. Конидии шарообразные с-темно окрашенной шиповидной оболочкой диаметром 3,0-3,1 мкм. Такимобразом, основными отличительными морфологическими особенностями нового штамма являются следущие., Стеригмы первого порядка у него в 2,5,раза длиннее, поверхность оболочки конидий покрыта шипами, у производственных штаммов,в том ч сле и у штамма Л-106, оболочка конидий .бугорчатая. Штамм Л-130 образует конидии на длинных конидиеносца конидии обладают более высокой энер гией. прорастания. Штамм Л-130 подавляет развитие бактериальной флоры, сопутствующейпроизводству лимонной кислоты: В.асrogenes, Е. coli, Вас о mesentericus, не уступает производственным штаммапо устойчивости к этой микрофлоре и более, устойчив к Вас mesenter icus. 1 Способность к образованию лимонной кислоты у штамма Л-.130 изучали при культивировании его на поверхнос ти мелассных сред в лабораторных условиях. Среды для ферментации приготавливали из мелассы различной фер ментируемости Гиндецтского и Новопокровского и других сахарных заводов качественно различающейся между собой. Режим культивирования обеспечивал максимальный выход лимонной кислоты от сахара и одновременно наи больший съем лимонной кислоты с 1 единицы площади в сутки. Пример. Испытания прово,дили влабораторных условиях.Посевной материсш конидии грибов 1 выращивали на пивном неохмеленном сусЛе, разбавленном до 7% по сахару. В разбавленное сусло добавляли 2% хлористого натрия, 9Д мочевины, 0,0001% сульфата меди, 2% агара. Конидии гри бов, выращенные на этой среде и сме ушанные с тальком в соотношении 1:2, применяли для посева их мелассные среды. Состав мелассной среды, г/л; Свекловичная меласса (48%-ная по сахару) Гиндештского завода заготовки 1979 г320 Карбонат натрия безводный0,4 Гексацианоферроат калия, гидрат2,1 Дигидроортофосфат калия0,1 Сульфат цинка, гидрат 0,005 рН7,0-7,1 Испытания проводили в химических стаканах с площадью дна 0,41 дм Объем ферментируемой мелассной среды 500 Мл (высота слоя 12 см). На поверхность среды высевали конидии штамма Л-130, Продолжительность ферментации 7 сут., температура .воздуха в термостатной комнате . В тех же условиях выращивали производственный штамм Л-106. По окончании опыта у штамма Л-130 получено 60,8 г кислоты в среднем на 1 стакан, съем лимонной кислоты в пересчете на 1 м в сутки составил 2120 г, выход лимонной кислоты от сахара мелассы 81,7%. У производственного штамма Л-106 получено 53,1 г кислоты, в среднем с 1 м в сутки 1850 г, выход кислоты от сахара 70,7% (табл. 2). Особенность применяемой мелассы дл культивирования штаммов состоит в том, что для ее обработки требуется высокая доза гексацианоферроата калия-2,1 г/л среды вместо 1,21,5. г/л для других образцов меласс. Штамм Л-130 образует практически одну лимонную кислоту t в то время как у сравниваемого производственного штамма Л-106 накапливается до 3% побочной глюконовой кислоты (табл. 3). Среднесуточный съем лимонной кислоты на мелассе Гиндештского завода у штамма Л-130 возра.стает по сравнению со штаммом Л-106 на 14,6%, выход лимонной кислоты от сахара увеличивается на 10%. П р и м е р 2. Испытания проводили в лабораторных условиях. Конидии грибов выращивали на пивном неохмеленном сусле по способу, описанному в примере 1. Собранные конидии применяли для засева бродильной мелассной среды. Состав мелассной среды, г/л: Смесь меласс Новопокровского. Хохольского и Жердевского сахарных заводов заготовки 19CtO г300 Гексацианоферроат калия. гидрат Трилон Б (соль динатриевая зтилендиаминN, N, Nj N -тетрауксуснойкислоты),бигидратДигидроортофосфат калия Сульфат цинка, гидрат рН Режим культивирования такой ж как в примере 1. У штамма Л-130 лучено на стакан в среднем 52,5 лимонной кислоты; съем лимонной лоты в пересчете на 1 м 1830+80 выход лимонной кислоты от сахара 70%, У производственного штамма Р-3 получено 46,8+0,1 г лимонной кислоты,с 1 м в сутки 1630+50 г выход лимонной кислоты от сахара 62 ,4%. Пример 3. Испытания прово в ЦЗЛ Выборгского завода лимонной кислоты. Посевной материал штаммо Р-1 и Р-3 поставлялся Рижским эк риментальным заводом биохимически препаратов, штамм Л-106 Ленинград ким комбинатом по производству лимонной кислоты. Конидии штамма Л-130 выращивали в ЛНИИПП на пивн неохмеленном сусле по способу, оп санному в примере 1. Состав мелассной среды, г/л: Смесь меласс

Сравнение кислотообразующей способности исходного штамм 130 и мутантов, полученных путем селекции НОВОПОКРОБСкого, Хохольского и Жердевского сахарных забодов заготовки 1980 г300 Карбонат натрия 0,05 Гексацианоферроат калия, гидрат- 0,14 Дигидроортофосфат калия0,15 Сульфат цинка, гидрат0,01 рН7,0 Культивирование прово 1или в химических стаканах с площадью дна 0,47 дм. Высота слоя ферментируемой мелассной среды 12 см. Режим культивирования такой же, как в примерах 1 и 2. Результаты опыта отображены в табл. 4. Как показывает таблица, новый штамм Л-130 является более продуктивным, чем другие производственные штаммы и образует на 12,5% больше лимонной кислоты. Таким образом, на основе нового штамма Л-130 производится посевной материал высокого и стабильного качества для ферментации меласс различного состава. При культивировании на этих мелассах новый штамм обеспечивает одновременно высокий съем ли юнной кислоты с единицы площади в сутки и высокий ее выход от сахара. Таблица

1490+ 50

130 исходный

1690+ 80

130/15

1810+ 50

130/15-62

1940+ 20

130/15-62/2

1980+ 20

130/15-62/2-3

130/15-62/2-3/5 2100 + 30

130/15-62/2-3/5-73 2120+ 40 (Л-130)

57+ 2

5,41

65+ 3

6,30

69+ 2

7,2

74,2+0,8

7,3

75,8+ 0,8

7,35

80+ 1.

7,4

81+ 1