Производные дезокситионуклеотидов,как мономеры для синтеза дезоксиполинуклеотидов, и способ их получения Советский патент 1982 года по МПК C07H19/00 C07H21/04 

бгГвляют диметилформамид (10 мл) и йодистый метил (0,5 мл), мерез 5-10 мин реакционную смесь упаривают в вакууме. Остаток растворяют в хлороформе (10 мл), промывают водой (5 мл2) , сушат безводным сульфатом натрия и упаривают в ваку уме. Остаток растворяют в 20 мЛ трет-бутанола и подвергают лиофильной сушке. Выход 0,651 г (90%). Вещество гомогенно при тонкослой ной хрбматографии на силикагеле в системе хлороформ:метанол (9.И V/V) (А). УФ-максимум в этаноле при 270 нм ( Е 11500) Содержание диметокситритильных групп, определенное спектрофотометрически при 500 нм (Е 72000) в смеси HCtO -CjHjOH (1:1 V/V), равяо 99%. Гидролиз цианэтиль ной группы 1 М триэтиламином в мета ноле при 20°С протекает полностью за 1 ч, а гидролиз 0,05 М при - за 1 мин. Гидролиз диметокси тритильной защиты 1%-ным раствором толуолсульфокислоты (TosOH) в.смеси хлороформ:метанол (7:3V/V)(B) прот кает полностью за 20 мин при 0°С, Это подтверждает структуру соединения lit . П р и м е р 2. 5-0-диметокситри тил-Н -анизоил-дезоксицитиди1|1-3-0-3-Цианэтил-$-метилтиофосфат tV , Фосфорилирование 5-0-диметокситритил-М -анизоилцитидина (0,633 г, 1 ммоль) тиохлорокисью фосфата, цианэтилирование, гидролиз и алкилирование йодистым метилом в условиях, приведенных в примере 1, дает 0,75 г(91%)лиофильно высушенного из бензола вещества (tV). Вещество IV гомогенно при тонкослойной хроматографии на силикагеле в указанной системе А,, УФ-максимум в этаноле 302 нм(25000 ). Содержание диметокситритильных групп 98%. Гидролиз цианэтильной защиты 1 М триэтиламином в метаноле при 20°С или 0,05 М ИОН в метаноле при 209С протекает соответственно за 1 м и за 1 мин. Гидролиз диметок ситритильной защиты 1%-ным раствором толуолсульфокислоты в указанной смеси В проходит полностью за 15 ми Это подтреридает структуру соединения IV. Пример 3. 5 -й-Диметокситри тил-Ы -изобутирил-дезоксигуан.озин-3 -0-2-циaнэтил-S-мeтилтиoфocфaт(Vl 7 Фосфорилироаание 5-0-Аиметокси-N -изобутирилдезоксигуанозина(0,639 г, 1 ммоль) тиохлорокисью фосфора, цианэтилирование, гидролиз и алкилирование йодистым метилом в условиях, приведенных в примере 1, дает 0,671 г 182% веществаV . Вещество V гомогенно при тонкослойной хроматографии на силикаге- ле в указанной системе А, УФ-максимум в этаноле 2б9 нм (Е 11бОО), содержание диметокситритильных групп 98%. Гидролиз цианэтил1 ной защиты 1 М триэтиламином в метаноле при 20С или 0,05 М LiON в метаноле при протекает соответственно за 60 мин и 1 мин. Гидролиз диметркситритильной защиты 1%-ным раствором толуолсульфокислоты в указанной системе Б проходит полностью за 3 при . Это подтверждает структуру соединения V . П р и м е р 4. 5-0-Диметокситригил-N -бензоилдезоксиаденозин-3-0-2-цианэтил-5-метилтиофосфат (VI). Фосфорилирование 5-0-диметокситритил-Н-бензоилдезоксиаденозина(о,657 г, 1 ммоль) тиохлорокисью фрсфора, цианэтилирование, гидролиз и алкилирование йодистым метилом в условиях, приведенных в примере 1, дает О,.665 г (80%) лиофильно высушенного из бензола вещества Vt . Вещество гомогенно при тонкослойной хроматографии на силикагеле а указанной системе А. УФ-максимум в этаноле 280 нм (Е 20700), содержание диметокситритильных групп 98%. Гидролиз диметокситритильных групп 1%.-ным раствором в указанной системе Б проходит полностью за 3 мин при 0°С. Гидролиз цианэтильной защиты 1-М триэтиламином в метаноле при или 0,05 М ИОН в метаноле при протекает полностью соответственно за 60 мин и 1 мин. Это подтверждает структуру соединенияУ. П р и м е р 5. Тимидин-з-0-2-цианэтил-5-метилтиофосфат (/| |).. К охлажденному до раствору 5 -О-димето.кситритилтимидин-З -0-2-цианэтил-5-метилтиофосфата(0,72 г, 1 ммоль) в 10 мл смеси хлорофор-м: метанол (7:3 V/V) добавляют 10 мл охлажденного до 2%j;; Horo раствора TosOH в такой же смеси. Черея 20 мМн добавляют пиридин (Ю мп) и воду (10 мл). Водный. 7y слой отделяют, органический слой промывают.5 мл-воды, сушат безводным NajSO и упаривают в вакууме досуха. Остаток растворяют в хлороформе (5 мл, наносят на колонку с 59мл силикагеля и хроматографируют в градиенте хлороформ - 5 метанол в хлороформе (250 мл хлороформа в резервуаре и 250 мл 5% метанола в хлороформе в смесителе). После удаления растворителя и высушивания в вакууме получают 0,01 г (95) вещества VII . Вещество Y1I гомогенно при тонкослойной хроматографии на силикагеле в системе хлороформ - метанол (Эг V/V). УФ-максимум в воде при 2б7 нм (). Гидролиз, цианэтильной защиты в 1 М триэтиламине в метаноле при 20 С протекает полностью за 60мин, при этом образующийся тимидин-3-5-метилтиофосфат идентичен пр УФ-спектру и хроматографической под вижности при тонкослойной хроматографии на силикагеле в системе метаНОЛ - хлороформ - 1 М ацетат аммони (10:10:1 V/V) заведомому образцу. Это подтверждает структуру соединенияVlI.2 . (1 р и М е р 6, N -изобутирил-дезоксигуанозин-3-0-2-дианэтил%-метитиофосфат (VJII). 2 Гидролиз 5 0-диметокситритилN-йзобутирил-дезоксигуанозин-з 0-2-цианэтил-5-метилтиофосфата(0,818 .г, 1 ммоль) Д-ным раствором TosOH в течение 2 мин в условиях пр мера 5 дает О,боб г (95о) целевого продукта VIII . Вещество гомогенно при тонкослой ной хроматографии на силикагеле в системе хлороформ - метанол. (9:1 V/ УФ-максимум в воде при 280 нм (Е 11900), плечо при 255-260 нм (Е 16200). Гидролиз цианэтильной защи ты дает вещество, идентичное по УФспектру , хроматографической подвижности на силикагеле (N -изобутирилдезоксигуанозин-3-5-метилтиофосфатуЭто подтверждает структуру соедине. нияVIII. П р и М е р 7. N-Анизоилдёзокси цитидин-з -0-2-цианэтил-5-метилтиофос0ат(1У). Гидролиз 5 -0-диметокситритил-N -анизоилдезоксицитидин- З-0-2-цианэтил-5-метилтиофосфата (0,812 г 1 ммоль) 1%-ным раствором TosOH в условиях примера 5, дает Q,k8k г (95) веществаIX . Вещество гомогенно при тонкослойной хроматографии на силикагеле в системе хлороформ - метанол (9:1 V/V). УФ-максимум в воде 302 ни (). Гидролиз цианэтильной защиты дает вещество IX , идентичное по УФ-спектру и хроматографической подвижности заведомому образцу. Это подтверждает структуру соединения IX, П р и М е р В. N -бензоилдезоксиаденозин-3 -0-2-цианэтил-5-метилтиофосфат. (X) , Гидролиз 5-0-диметокситритил-N -бензоил-дезоксиаденозин-3-0-2-цианэтил-5-метилтиофосфата (0,867 г, 1 ммоль) в условиях, приведенных в примере 6, дае.т 0,513 г (962;) вещества X . Вещество X гомогенно при тонкослойной хроматографии на силикагеле в системе хлороформ - метанол (9:1 V/V). УФ-максимум в воде при 280 нм (Е 27РО)о После снятия цианэтильной защиты образуется вещество, идентичное по УФ-спектру и хроматографической подвижности N -бензоилдезоксиаденозин-3-5-метилтиофосфату. П р и М е р 9. 5-Диметокситритилтимидин-3 -S-метилтиофосфат ()(() 5 -0-Диметокситритилтимидин-З -0-2-цианэтил-5-метилтиофосфат (71 мг, 1 ммоль) обрабатывают смесью этанола (.20 мл) с триэтиламином (Ю мл) в течение 1 ч при комнатной температуре, упаривают в вакууме. Остаток растворяют в хлороформе (10 мл), промывают водой (5 мл-2) сушат с сульфатом натрия и упаривают в вакууме. Получают 668 мг (981) соединениях . Соединение XI гомогенно при тонкослойной хроматографии на силикагеле в систем :СНС1з 1:1) (система В). УФ-максимум в этаноле при 270 нм (Е 115Пр). Содержание диметокситритильных групп, определенное спектрофотометрически при SOD нм ( Е 72000) в смеси iCjHjOH (1:1 V/V), равно 99. Это подтверждает структуру соединения XI. П р и М е р 10. 50-Диметокситритил-N-аниозоил-дезоксицитидин-3 -S-метилтиофосфат (XII). 5 -0-Диметокситритил-м-анизоил-дезоксицитидин-з -0-2-ци.анэтилметилтиофосфат (771 мг, 1 ммоль) обрабатывают в условиях примеру 10. Получают б9б мг () соединенияX1L. Соединение ХП гомогенно при тонкослойной хроматографии на силикагеле 9 системе В. УФ-максимум в этано ле -при 302 нм (t 25000). Содержание диметокситритильных групп, определенное спектрофотометрически при 500 нм (Е 72000) в смеси HClO rCjHjO (1:1 V/V), равно 8%. Это подтвержда ет структуру соединения XII . р им ер 11. 5 -0-Диметокситритил-N -изобутирил-дезоксигуанозин-3-5-метил-тиофосфат(ХШ|. 5-О-Диметокситритил-N -изобутирил-дезоксигуанозин-3-0 -2-цианэтил -S-метилтиофосфат ( мг, 1 ммоль) обрабатывают в условиях примера 9. Получают S7 мг (98%) соединенияХШ СоединениеХШгомогенно при тонкосло ной хроматографии на силикагеле в системе В. УФ-максимум в этаноле при 2б9 нм (Е 11бОр), Содержание ди метокситритильных групп, определенное спектрофотометрически при 500 нм (Е 72000) в смеси HClO.tCjHyOH (1:1 V/V), равно 98%., Пример 12. 5 -Диметокситритил-М -бензоилдезоксиаденозин-З-S-метилтиофосфат(XIV) . 5-Диметокситритил-Н -бензоилдезоксиаденозин-З-0-2-цианэтил-5метилтиофосфат (837 мг, 1 ммоль) обрабатывают в условиях примера 9Получают 7бО мг (97%) соединенияXIV Соединение XJV гомогенно при тонкослойной хроматографии на силикагеле в системе В. УФ-максимум в этаноле при 280 нм (Е 2П700). Содержание ди метокситритильных групп, определенное спектрофотометрически при 500 нм (Е 72000) в смеси HC104:C2HjOH (1:1 V/V), равно 99%. Это подтверждает , структуру соединения XIV . 5 -ДиметокситриП р И м е р 13 -изобутирилдезоксигуанилил-(3 -S-метилтио 1)-Н -изобутирилдезоксигуанилил-(3 5-метилтио 5)-N -бензоилдезоксиаденозил-(3-S-метилтио. 5) -тимидин -з -0-2-цианэтил-S-метилтиофосфат (XV) . 5 -Диметокситри.тил-Ы -изобутирил дезоксигуанозин-З-S-метилтиофосфат (76,5 мг 0,1 ммоль) и N-изобутирил дезоксигуанозин-З-0-2-цианэтил-5-метилтиофосфат (6 мг, 0,1 ммоль) растворяют в сухом пиридине (10 мл) и упаривают в вакууме на ротационном испарителе до 1- мл. Добавляют (so, мг, 0,2 ммоль) мезитиленсульфо 9 хлорида и оставляют при на t .м. К реакционной снбси прибавляют 0 мл смеси ацетсжитрил - триэтил - амин (1:1 V/V) и нагревают 10 мин .прн 50°С. Упаривают в вакууме досуха, остаток растворяют в хлороформе (10 нл), хлороформенный раствор про- мывают водой (5 ) затем фильтруют через безводный сульфат натрия и упаривают досуха. Получают 5 диметокситрйтил- (М -иэобутир.илдезоксигуанилил-(3 -S-метилтио 5J-N -йзобубути рил гуанозин)-3-S-мeтилтиoфocфaт(XIV) о,е. ( при 260 нм. 5-Диметокситритил-Н бензоилдезоксилденозик (8Ц мг, 0,1 ммоль) и тимидин-3-0-2-цианэтил-5-метилтиофосфат((2 мг, 0,1 ммоль) растворяют в сухом пиридине (10 мл) и упаривают в вакууме до 0,5 мл. Добавляют мезитиленсульфотетразолидС 50,t мг, 0,2 ммоль) и выдерживают при в течение 1 ч. Упаривают с толуолом (10 мл-2) досуха и растворяют в хлороформе (10 мл). К охлажденному до раствору приливают охлаищенный до 2%-ный раствор TosOH (10 мл) в смеси метанол - хлороформ (3:7). Через 2 мин нейтрализуют водным раствором бикарбоната натрия, водный слой отделяют. Органический i слой промывают через безводный NaiSOd и упаривает досуха. Лрлучают j-бeнзoилдeзoкcиaдeнoзил-(3 -S-метилтио-5)-тимидин-3 -0-2-цианэтил-S-мeтилтИoфocфaт(XVIl)2250 о.е. (98%) при 2бО нн. Вещество ХУМи вещество ХУЦрастворяют в сухом пиридине (15 мл) и упаривают в вакууме до 1 мл. Добавляют мезитилеисульфотетразолид ( 50, мг, 0,2 ммоль} и выдерживают Ь течение 1 ч при 20 С. Добавляют воду (0,1 мл, выдерживают 1 мин и растворяют в хлороформе (10 мл).. Хлороформ промывают водой 15 мл2) фильтруют через безводный сульфат натрия, упаривают в вакууме, затем снова упаривают с толуолом (10 мл). Сухой остаток растворяют в хлороформе (5 мл и наносят на колонку с силикагелем ( мл), Элюируют ы градиенте концентрации метанола в хлороформе (150 мл хлороформа в резервуаре и 150. мл 5% метанола в хлороформе в смесителе). Получают вещество XV (.5600 о.е., 90%). BeiuecTBoXV гомо-. генно при хроматографии в тонком слое на силикагеле в системе хлороформ метанол (9:1 V/V). УФ-максимум при

260 нм . Отношение количества веществах, измеренное по поглощению при 2бО нт и 500 нм ( характерное поглощение диметокситритиных групп), равно . Эта характеристика, определяющая количество полученного вещества двумя независимыми измерениями (при 2бО нм и 500 нм) и в пределе равная 1, доказывает состав тетрануклеотида XV . Соединение XV нагревают в концентрированном аммиаке 30 мл) 6 ч при . После удаления аммиака на ротационном испарителе и упаривания отатка с уксусной кислотой и водой получают дезоксигуанилил () дезоксигуанилил ()-дезоксиаденоЗИЛ- З Б)-дезокситимидин.

Полученные новые производные дезоксинуклеотидов в качестве мономеров для синтеза олигодезоксинуклеотидов обладают по сравнению-с другими аналогичными соединениями следующими преимуществами: производные дезокситионуклеотидов получают с выходом 80 - 90, как видно из примеров 1 - 8 . Известные же производные дезокситионуклеотидов формулы I получают с выходом 70-80%

Полученные в примерах 1 - 8 производные дезокситионуклеотидЬв были использованы в синтезе олигодезоксинуклеотидов триэфирным методом (пример 13). В таблице приводятся пуриновые олигодезоксинуклеотйды, наиболее сложные для получения, а также сравнительные данные по выходу олигодезоксинуклеотидов,

Полученные мономеры были использованы для синтеза полидезоксинуклео тидов: GGATGGATRTAA, TGAATTCA, TGGACCGTGTTTACAT, CCATfCTTTCCATTTG, CAAATGGAAA, ACACGGTCCA, ACTTAAGT. Выход на каждой стадии при получении полидезоксинуклеотидов составляет 50-96/0, конечный выход в рас чете на мономер 10-50.Полученные полимеры гомогенны при тонкослойной хро тографии на селикагеле в системе хлоро форм: метанол (9:1 V/V). Отношение из меренных суммарных плотностей полидезоксинуклеотидов при 2бО нм и 500 нм 0,96-1),99. . После снятия защитных групп {диметокситритильной, амино- и оксигрупп) с полидезоксинуклеотидов и очистки их ионнообменной хроматографией проводили гидролиз фосфодиэстеразой змеиного яда (ФДЭ); Полученные таким образом полидезоксинуклеотиды имели хроматическую подвижность на ионнообменной хроматографии, соответствующую их зарядам. При неполном, гидролизе ФДЭ были получены олигомеры, число которых соответствовало длине анализируемых полидезоксинуклеотидов. При исчерпывающем гидролизе ФДЭ этих полидезоксинуклеотидов получены продукты, по подвижности соответствующие мономерам.. Полученные полидезоксинуклеотиды количественно фосфорилировались при обработке полинуклеотидкиназой фага J-k и| г%-АТФ. 13 Полученные полидеэоксинуклеотид были использованы для ферментативн го синтеза двухцепочечного полидез синуклеотида I , кодирущегр структ ную часть гена гормона антиотензина I . Г TGAATTCATGGACCG TfiTTTACATpCATCtTTTCCATTTG ACTTAAGTACCTGGCACAAATGTAGGTAGGAAAGGTAAAC. Формула изобретения 1.Производные дезокситионуклеотидов общей формулы крсНй о В )Uo где В - осадок тимина, анизоилцитозина, бензоиладенина и изобутирил гуанина, R«H, п,п-диметокситритил; 2-цианэтил, как мономеры для синтеза дезоксиполинуклеотидов. 2. Способ получения производных дезокситионуклеотидов общей формулыRiOCHo ,0 В кГ 7 где В - остаток тимина, N - анизоицитозина, N°- бензоиладенина и N изобутирилгуанина;, п,п-диметокситритилi , 2-цианэтил, отличающийся тем, что 5 -0-диметокситритилнуклеозиды общей формулы oCHs НзО-/ где В - имеет указанные значения, фосфорилируют 5-15-кратным избытком тиохлорокиси фосфора в течение 2-А ч при в пиридине, реакционную смесь обрабатывают пиридиновым раствором этиленциангидрина в течение 1-2 ч при комнатной температуре, полученное дицианэтильное производное гидролизуют триэтиламином в спирте, полученное моноцианэтильнов производное алкилируют йодистым метилом в диметилформамиде с последующей обработкой продукта алкилирования толуолсульфокислотой и/или триэтиламином в спирте. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Sekine М., Hata Т. Phenyltio group as protecting group of phosphates in oligonucleotide synthesis via phosphotriestef approach. Tetrahedron letfers, 1711 (1975).