Олигодезокситионуклеотиды,проявляющие матричные свойства в РНК-полимеразной системе из еSснеRIснID coLI Советский патент 1982 года по МПК C07H21/04 

Изобретение относится к новы биологически активным олигодеэо тионуклеотидам общей формулы в Оч„.,8-СН, О о . S-CH2n R О О- /01где В - тимин, цитозин, аденин гуанин; Rj. - Н, остаток тиофосфата -циан(или N,N-дифенйлк моил)этилфосфотиоата; 1,2,3,.., проявляющие матричные свойства полимеразной системе из Tsche Соединения формулы I составл новую группу класса тиоаналогов родных полидезоксирибонуклеотидов, отличаясь от последних типом связи между составляющими их мононуклеотидами,а от известных соединении наличием новых структурных фрагментов остатков гуаниловой и цитиди.г10вой кислот. Известные 2 -дезоксигексатиотимидилаты и олигодезокситионуклеотиды вследствие малой длины и неполного набора составляющих их мономерных нуклеотидов не являются полноценными аналогами ДНК и не проявляют матричные свойства при транскрипции в РНКполи.меразной системе из Escherichla col i 1 и 2. Цель изобретения - получение новых олигодезокситионуклеотидов, близких по своим биологическим свойствам природным ДНК и расширяющих арсенал средств воздействия на живой организм. Поставленная цель достигается но-выми олигодезокситионуклеотидами общей формулы I, проявлякнцими матричные свойства в РНК-полимеразной системе из Escherichia coli. Способ получения новых олигодезокситионуклеотидов основан на реакции получения 2 -дезоксигексатиотимидилатов, исходя из литиевой соли томидил{или олиготимидил)3-фосфотиоатов и 2,5-дидезокси-5-иод производного тимидина, и состоит во взаимодействии производных дезоксинукл рзид-З-фосфотиоатов общей формулы RlpCH O B Оч- -БкГ с 5 -иод-производными тионуклеотидо общей формулы ХН,,о.В где В - тимин; N -анизоилцитозин; Н -изобутирилгуанин; зоиладенин; R - Н, олигодезокситионуклеоти kt - катион натрия или лития; R - Н, остаток Li- или Na-соли S-(-циан {или М,М-дифенилкарбомоил)этилфосфотиоата. Пример 1.2-Дезокси тимиди лил-З ,5 -три-(5-дезокси-5 -тиотим лилил) --з, 5- ( 5-дезокси-5-тиогуанилил -З,5 -дезокси-{з-тиоцитидин) , Tp.TpsTp5QpeCOH (1). Стадия I.2 -Дезокси тимидилил-3/ -три(5-дезокси 5 -тиотимидилил)-з , 5-(5-дезокси-5-тио-N -изобутирилгуанозин)J-3 -фосфотиоат (2). 0,066 г 2-дезокси тимидилил-З ,s -ди- ( 5-дезокси-5 -тиотимидилил) -З, 5 - (5 -дезокси-5 -тиотимидин) -З -фосфотиоат (TpsTpsTpsTps) пенталитиевой соли (0,05 ммоль) и 0,041 литиевой соли 2 , 5-дидезокси-5-иод-и -изобутирилгуанозин-3 -S- f,-(N,N-дифенил)карбомоилэтилфосфотио ата (0,053 ммоль), встряхивают в 2 диметилформамида в течение 4 ч. Конец реакции определяют иодметрическим титрованием свободных тиофосфат ных групп или ионообменной хроматографией. По окончании реакции сме обрабатывают 15 мл ацетона осадок центрИЬугируют, промывают ацетоном v5x5 мл) и сушат в вакууме Получаю 0,095 г осадка, содержащего 0,046 ммоль S-p-(N,М-дифенил)карбомоилэтильного производного (2).Полу ченный осадок растворяют в 2 мл, 0,5 н. гидроокиси лития, выдерживаю 1 ч, экстрагируют толуолом (3x2 мл) и водный слои нейтрализуют катионообменной смолой дауэксом 50 (Н -форма) до рН 7,5. Смолу- отфильтровывают и фильтрат лиофильно высушивают. Получают 0,087 г осадка, содер;: ащего 0,046 ммоль производного (2 ) (92, по результатам микрохром-чтогра фии на аминохроме). Стадия II. 0,043 г продукта стадии, содержащего 0,023 ммоль Li -соли и 0,0217 г 2,5-дидезокси-5-иод-М-анизоилцитидин(0,046 ммоль), встряхивают в 1 мл диметилформамида в течение 4 ч,раствор выдерживают еще 1 ч и продукт осаждают 10 мл ацетона. Осадок про1 ывают ацетоном (3x5 мл) и высущивают в вакууме. Затем его растворяют в 5 мл 25%-ного водного раствора аммиака, выдерживают 4 ч при 50С, упаривают в вакууме и остаток растворяют в 1 мл 0,1 М бикарбоната аммония (рН 7,5), содержащего 10% этанола. Этот раствор наносят на колбнку с сефадексом 6-25 (5x100 см) и элюируют тем же буфером. Первый пик собирают и упаривают в вакууме. Остаток растворяют в 10 мл смеси вода - спирт (1:5) и упаривают досуха. Эту процедуру повторяют еще два раза и затем продукт лиофильно высушивают. Получают 0,04 г (90%) пентааммонийной соли соединения 1 (82,5% в расчете на исходный (Tps)4 Lip) . Пример 2. 2 -Дезокси тимидилил-з,5 -три-(5 -дезокси-5-тиотимидилил)-3, 5 -{5-дeзoкcи-5-тиoгyaнилил)-3 , 5- (5-дезокси-5 -тио-цитидилил)-3-3(5 -дезокси-5 -тиоаденилил)-3 ,5 -(5-дезокси-5-тиоаяенозин)3 Tp9Tp%TpeTpsGp CpsAfBAw(5Стадия 1.2 -Дезокси тимидилил-3, 5 -три-(5 -дезокси-5-тиотимидилил)-з , 5 - (5-дезокси-5 -тио-М -изобутирилгуанилил)-з,5-(5-дезокси-5-тио-М -анизоилцитидин)-з -фосфотиоат (4) . 0,043 г продукта I стадии примера 1, содержащего 0,023 ммоль Life-соли соединения 2 и 0,15 г литиевой соли 2 , 5-дидезокси-5-иод-М -анизоилцитидин-3-5-р-цианэтилфосфотиоата (0,024 «моль) , встряхивают в 1 мл диметилформамида 4 ч, выдерживают еще 1 ч и продукт выделяют как в I стадии примера 1. Защиту с тиофосфатной группы проводят так же, но без экстракции толуолом. Получают 0,05 г осадка, содержащего 0,0215 ммоль Li7-coли соединения 4 (94%), которую очищают хроматографией на аминохроме. Стадия II. 2-Дезокси тимидилил 3 ,5 -три(5-дезокси-5-тиотимидилил )-3, 5- 5-дезокси-5-тио-М -изoбytиpилгyaнилил)-3,5 -(5-дезокси-5 -тио-М -ачизоилцитидилил)-3,5 -(5-дезокси-5 -тио-М -бензоиладенозин)-3-фосфотиоат (5). Продукт 1 стадии, содержащий 0,0215 ммоль Li:J-coли соединения 4 и 0,018 г литиевой соли 2,5-дидезокси-5 -исд-г -бензоиладонозин-З-S-ft-(N,N-дифенил)карбомоилэтилфосф тиоата (0,0227 ммоль), встряхивают в 2 мл диметилформамида, содержащег 2% воды, в течение 5 ч, выдерживают еще 2 ч и продукт выделяют как в 1стадии примера 1, промывая осадок в конце смесью этанол - ацетон (1:1,3 Защиту с тиофосфатной группы снимают как в 1 стадии примера i, использу для экстракции толуол (3x3 мл). По лучают 0,054 г неочищенного продукт содержащего 0,020 ммоль соединения 5 (93%), который очищают ионообменной хроматографией на аминохроме. Стадия III. 0,027 г соединения 5 содержащего 0,01 ммоль Lig-соли сое динения . 5 и О,.01 я 2 ,5-дидеэокси-з-иод-N --бензоиладенозина (0,02 ммоль), встряхивают в 1 мл диметилформамида, содержащего 2% во ды, в течение 5 ч, выдерживают еще 2ч и продукт выделяют как в I стадии примера i,промывая осадок этанолом - спиртом (1:1,1). Снятие защит с оснований нуклеотидов и гель-хромгтографию проводят как во II стади примера 1, используя вместо сефадек G-25 сефадекс G-50 суперфайн. Выхо гептааммонийной соли соединения 3 0,023 г (89% или 72% в расчете на (Tps)4 Lig) Копия радиоавтограммы, полученно при определении первичной структуры приведена на фиг. 1. Пример 3. 2-Дезокси тимидилил-з ,5-три-(5 -дезокси-5-тиотимидилил)-3 ,5- (5-дезокси-5 -тиогуанилил)-3 ,5-(5 -дезокси-5 -тиоцитидилил)-3 ,5-ди-(5-дезокси -5 -тиоаденилил)-3 ,5-(5-дезокси-5 -тиотимидилил) -3 , 5 - (s -дезокси -5 -тиогуанозин) , TpsTpsTpsTps QpsCpe psTpsCioH (fc). Стадия I, 2-Дезокси тимидилил-З,5-три-(5-дезокси-5-тиотимидилил )-3 , 5 - ;5-дезокси-5-тио-Ы -изобутирилгуанилил)-З,5 -(5-дезокси-5 -тио-М -анйзоилцитидилил)-3 ,5-(5 -дезокси-5 -тио-М -бензоиладенилил)-З ,5-(5-дезокси-5-тио-М -бензоиладенозин) -3 -фосфотиоат v7) . 0,027 г неочищенного продукта, п лученного на I I стадии примера 2,содержащего 0,01 ммоль Lig-сбли соеди нения 5 и 0,087 г литиевой соли 2, 5 -дидезокси-5 -иод-Г -бензоиладено зин-3 -S-P -(N,N-дифенил -карбомоилэтилфосфотиоата 0,011 ммоль,встряхи вают в 1 иш диметилформамида , содержащего 2% воды,в течение 4 ч,выдерживают еще 2 ч. Продукт выделяют как в I стадии примера 1, проводя промывку осадка 2 мл смеси этанол - ацетон (1:1). Защиту с тиофосфата снимают так же как примере 1. Получают 0,031 г неочищенного продукта, содержащего 0,0091 мГЮль (91%) соединения 7, который очищают ионообменной хроматографией. Стадия II. 2-Дезокси тимидилил-3 ,5 (5 -дезокси-5-тиотимидилил) -3 ,5 -(5 -дезокси-5-тио-N -изобутирилгуанилил)-3,(5-дезокси-5 -тно-Ы -анизоилцитидилил)-3,5 -ди(5-дезокси-5-тио-N -бензоиладенилил)-3,5-(5-дезокси-5 - -тио-тимидин)3-3 -фосфотиоат (8). 0,031 г соединения 7, содержащего 0,091 мoль его Li -соли и 0,0068 г литиевой соли 2,5 -дидезокси-5 -иод-тимидин-3-5-/ - (N , N-дифенил)карбомоилэтилфосфотиоата (0,01 ммоль), встряхивают в 1 мл диметилформамида, содержащего % воды, 6 ч, раствор затем выдерживают 2 ч и продукт выделяют как в I стадии примера 1, промывая осадок дополнительно этанолом (2x2 мл) . Снят.ие защиты с тиофосфата проводят аналогично I стадии примера 1. Получают 0,031 г неочищенного продукта, содержащего 0,0082 ммоль (90%) соединения 6,который очищают ионообменной хроматографией . Стадия 1М. 0,031 г соедине шя 8, содержащего 0,0082 ммоль его L i -coли и О,0072 г 2 ,5-дидезокси-5 -иод-N -изобутирилгуанозина (О,016 ммоль) , встряхивают в 1 мл диметилформамида, содержащего 3% воды, в течение 6 ч, выдерживают, еще 3 ч и продукт выделяют как в I стадии примера 1,промывая осадок в конце этанолом (2 х 2 мл). После снятия защит с оснований аммиаком продукт выделяют гель-хроматографией как в I М стадии примера 2 . Затем продукт рехроматографируют на аминохроме с-3 (колонка 2,3 х X 25 см в линейном градиенте 0-0,2М бикарбоната аммония, рН 7,0), используя резервуар и смеситель объемом по 1 л, скорость элюции 300 мл/ч. Продукт элюируется 0,18 М бикарбонатом аммония. Пик собирают, упаривают, удаляют бикарбонат аммония упариванием трижды с 30 мл смеси воды спирт (1:5) и продукт лиофильно высушивают. Выход соединения 6 в виде нонааммонийной соли 0,023 г (86%) или 51% в расчете на (Tps)4 Li5). Пример 4.2-Дезокси тимидилил-3,5 -ди-(5 -дезокси-5 -тиотимидилил} -3 , 5 - (5-дезокси-5 -тиоцитидилил) -3 ,5-три-(5-дезокси-5-тиотимидилил)-3 ,5-(5-дезокси-5 -тиоцитидин)3-3 -фосфотиоат, TpuTpsTpsCpsTpsTpeTpsCpe (9). Стадия I. 2.-Дезокси тимидилил-з ,5 -ди- (5-дезокси-5 -тио--имидилил) -З ,5 - (5 -дезокси-5 -тио-М -анизоилцитидин)3-3 -фосфотиоат (10). 0,05 г тетралитиевой соли 2 -дезокси тимидилил-3,5-(5-дезокси-5 -тиотимидилил)-3 ,5-(5-дезокси-5 -тиотимидин)-3-фосфотиоата (0,05 ммоль) и 0,033 г литиевой соли 2 ,5 -дидезокси-5 -иод-М -анизои цитозин-3 -5-/ -цианэтилфосфотиоата (0,0525 ммоль) растворяют при встря хивании в 2 мл диметилформамида и в держивают 2 ч. Затем обрабатывают 10 мл ацетона, осадок центрифугирую промывают ацетоном (5x4 мл) и высу шивают в вакууме. Получают 0,075 г бесцветного порошка, содержащего 0,046 ммоль (92%) цианэтильного про иэводного соединения 10. Этот осадо растворяют в 2 мл 0,5 н. гидроокиси лития, выдерживают 1 ч и нейтрализу ют избыток щелочи катионообменной г смолой дауэкс-50-(Н -форма). Смолу отфильтровывают, а фильтрат лиофиль но высушивают. Получают 0,072 г неочищенного продукта, содержащего 0,046 ммоль (92%) пенталитиевой сол соединения 10, а также следы исходных веществ. Продукт очищают ионооб менной хроматографией на аминохроме с-3. Стадия II. 2-Дезокси тимидилил-3 ,5-ди-(5 -дезокси-5-тиотимидилил)-3 ,5-(5 -дезокси-5 -тио-М -анизоилцитидилил)-3,З-(5 -деэокс -5-тиотимидин)-3 -фосфотиоат (11) 0,072 г соединения 10, содержаще го 0,046 ммоль его Lii-соли и 0,0245 г литиевой соли 2,5-дидезокси-5 -иодтимидин-З -5-р-цианэтил фосфотиоата (0,0485 ммоль), встряхи вают в 2 мл диметилформамида 1 ч, вы держивают раствор еще 1 ч и обрабатывают как в I стадии, дополнительн промывая осадок 2 мл смеси этанол ацетон (1:1) .После аналогичного сняти защиты и высушивания получают 0,082 г неочищенного продукта, содержащего 0,0415 ммоль (90%) гексалитиевой соли соединения 11, котезрую очищают ионообменной хроматографией. Стадия 111. 2-Дeзoкcй тимидилил-3 , 5 -ди-(5-дезокси-5 -тиотимидилил)-3 ,5 - (5 -дезокси-5 -тио-Ы -анизоилцитидилил)-3 J,5-(5-дезокси -5j-тиотИмидилиЛ) -3 ,5.-(5 -дезокси -5 -тиотимидин )-3-фосфотиоат (12) 0,082 г соединения 11, содержащего 0,0415 ммоль его 11|-соли и 0,022 г литиевой соли 2,5-дидеэокси-5 -иодтимидин-З - 5-/3-цианэтил фосфотиоата (0,044 ммоль), в 2 мл диметилформамида, содержащего 1% воды, встряхивают 2 ч, выдерживают еще 2 ч и обрабатывают как на I стадии, промывая оссщок 2 мл этанола. После снятия защиты с тиофосфата и высушивания получают 0,082 г бесцвет ного порошка, содержащего 0,0375 ммоль (91%) гепталитиевой соли соединения 12, которую очищают ионообменной хроматографией. Стадия IV. 2-Дезокси тимидилил-З ,5 -ди-(5-дезокси-5-тиотимидилил)-3 , 5- (5-дезокси-5 -тио-М -анизоилцитидилил)-3 ,5-ди-(5-дезокси-5 -тиотимидилил ;)-3 , 5 - (5 -дезокси-5 -тиотимидин) Ц-З -фосфотиоат (13) . 0,082 г соединения 12, содержащего 0,0375 ммоль 1 : -соЛи 0,02 г литиевой соли и 2,5 -дидезокси-5-иодтимидин-З -S-p-цианэтилфосфотиоата (0,040 ммоль)встряхивают в 3 мл диметилформамида, содержащего 1% воды, 3 ч, выдерживают раствор еще 2 ч и затем обрабатывают как на I стадии, промывая осадок в конце 2 мл этанола. После снятия защиты с фосфотиоатной группы и- высушивания получают 0,082 г порошка, содержащего 0,034 ммоль (91%) окталитиёвой соли соединения 13, которую очищают ионообменной.хроматографией. Стадия V. 0,0-82 г соединения 13, содержащего 0,034 ммоль его Lig-соли и 0,024 г литиевой соли 2,5 -дидезокси-5 -иод-М -анизоилцитидин-3-S-fi-цианэтилфосфотиоата(0,038 мг/1оль)| встряхивают в 3 мл диметилформамида, содержащего 2% воды 3 ч, выдерживают еще 3 ч и обрабатывают как на I стадии. После снятия защиты с тиофосфата осадок обрабатывают аммиаком как во I I стадии примера 1 и выделяют продукт, как в III стадии примера 3 при помощи ионообменной хроматографии на аминохроме, используя градиент 0-0,3 М бикарбоната аммония. Выход моноаммонийной соли соединения 9 85% (0,078 г или 58% и расчете на (Tps)jLi ) . Вещество гомогенно при ионообменной и гель-хроматографии. Пример 5. 2-Дезокси гуанилил-3 ,(5-дезокси-5-тиотимидилил)-3 ,5 -ди-(5 -дезокси-5-тиоцитидилил)-3 ,5 -(5-дезокси-5 -тиоаденилил)-з,5-гекса-(5 -дезокси-5-тиотимидилпл)-З,5-(5-дезокси-5-тиотимидин )-3-фосфотиоат, Gp5TpeCCps)2ApsCTpebЦ4). Стадия I. 2 -Дезокси N -изобутирилгуанилин-3,5-(5-дезокси-5-тиотимидин)-3 -фосфотиоат (15). 0,048 г дигидрата дилитиевой соли 2 -дезокси-М -изобутирилгуанозин-З-фосфотиоата 2dGps( О , 1. ммоль) и 0,0532 г литиевой соли и 2-5-дидезокси-з -иодтимидин-З -S-fi-цианэтилфосфотиоата (0,105 ммоль) растворяют в 2 мл диметилформамида и выдерживают 1 ч при комнатной температуре. К реакционной смеси добавляют 20 мл ацетона, осадок центрифугируют, промывают ацетоном (5 х 10 мл), высушивают в вакууме и снимают защиту с тиофосфата как в I стадии примера 4. Получают 0,08 г бесцветного порошка, содержащего 0,095 ммоль (95%) трилитиевой соли соединения 15, которую очищают ионообменной хроматографией. Стадия JI 2-Дезокси N-изобутирилгуанилил-з , 5 - (5/ -дезокси-5 -тиотимидилил)-3,(5 -дезокси-5-тиo-N -aнизoилцитидин)J-З-фосф тиоат (16). 0,08 г соединения 15, содержащего 0,095 ммоль его L -со,ли и 0,082 г литиевой соли 2, 5 -ди езокси-5 -иод-М -анизоилцитидин-3 -З-р-цианэтилфосфотиоата (0,1 ммоль), встряхивают в 2 мл диметилформамида 0,5 ч, вьщерживают раствор 1 ч и обрабатывают как на I стадии. После снятия запиты с тио фосфата как на I стадии примера 4 получают 0,119 г неочищенно1-о продукта, содержащего 0,089 ммоль (93,5%) тетралитиевой соли соединения 16., Стадия III. 2-ДезоксиГм -изобутирилгуанилил-З ,5-(5-дезокси-5-тиотимидилил) -3 , 5 - ( 5 -дезокси-5 -тио-М -анизоилцитидилил)-з ,5 -(5 -дезокси-5 -тио-М -анизоилцитидин) -з-фосфотиоат (17). 0,119 г очищенного соединения 16 содержащего 0,089 ммоль его Li -coлч и 0,0585 г литиевой соли 2 , Б-дидезокси-5 -иод-Н -анизоилцитидин -З -5-)Ь-цианэтилфосфотиоата (0,0935 ммоль), встряхивают в 2 мл диметилформамида 1 ч. Раствор вьщер живают еще 1 ч и обрабатывают как на I стадии. Защиту с тиофосфата снимают как в I стадии примера 4.По лучают 0,15 г порошка, содержавшего 0,081 ммоль (92%) пенталитиевой соли соединения 17, которую очищают ионообменной хроматографией. Стадия IV. -Дезокси М изобутирил-З ,5 -(5-дезокси-5-тиотимндилил)-3,5 -дезокси-5-тио-Nr -анизоилцитидилил)-3,з -(5-дезокси-5 -тио-1 1 -бензоиладенозин)3 -з-фосфотиоат (18). 0,15 г соединения 17, содержащег 0,081 ммоль его 1 5--соли и 0,53 г литиевой соли 2,5-дидезокси-5 -ио -N-бензоиладенозин-З -S-p-дианэтил фосфотиоата (0,085 ммоль), встряхи вают в 3 мл диметилформамида 1,5 ч, выдерживают раствор 2 ч и обрабатыв ют как на 1 стадии. Снимают защиту тиофосфата как в I стадии примера 4 и получают 0,17 г порошка, содержащего 0,075 ммоль (93%) гексалитиево соли соединения 18. Стадия V. 2 -Дезокси N- -изобутирилгуанилил-З,5-(5 -дезокси-5.-тиотимидилил)-з ,5 -ди-(5 -тио-N -анизоилцитидилил)-3,5 -(5-дез кс -5-тио-М -бензоиладенилил)-з,5 -(5-дезокси-5 -тиотимидин)J-З-фосфотиоат (19). 0,017 г соединения 18, содержаще го 0,075 ммоль его Li -соли и 0,042 г литиевой соли 2 ,5-дидезок си-5 -нодтимидин-З -S-fi-цианэтилфос фотиоата (0,082 ммоль), встряхивают в 3 мл диметилформамида 2 ч, выдерживают еще 1 ч и обрабатывают как на I стадии, промывая дважды осадок 2 мл смеси этанол - ацетон (1:1). Защиту с фосфата снимают как в I стадии npHMeffa 4. Получают 0,179 г осадка, содержащего 0,0685 ммоль (91%) пептсшитиевой соли соединения 19, которую очищают ионообменной хроматографией. Стадия VI. 2 -ДeзoкcиfN -иэобутирилгуанилил-3,5-(5 -дезокси-5-тиотимидилил)-3 ,5 -ди-(5-дезокси-5-тио-М -аиизоилцитидилил)-3 ,5 --(5-дезокси-5 -тиo-N -бeнзoилaдeнилил)-3J,5| -(5/ -дезокси-5-тиотимидилил)-3, ,5 -(Б -дезокси-5. -тиотимидин)-3 -фосфотиоат (20). 0,179 г соединения 19, содержащего 0,0685 ммоль его Li:} -соли и литиевую соль 2,Б-дезокси-Б-иодтимидин-З -S-fi-цианэтилфосфотиоата, встряхивают в 3 мл диметилформамида, содержащего 1% воды, в течение 4 ч, выдерживают 2 ч и обрабатывают как на I стадии, промывая осадок этанолом (2x2 мл). Защиту с фосфата снимают как в I стадии примера 4 и получают 0,188 г осадка, содержащего 0,061 ммоль (89%) окталитиевой соли соединения 20. Стадия VII. 2-Дезокси Н -изобутирилгуанилил-3 ,5-(5 -дезокси-5-тиотимидилил)-з ,Б -ди-(5 -дезокси-5 -тио-Ы -анизоилцитидилил) -3 , 5 -(з -дезокси-5 -тио-М -бензоиладенилил)-3,5 -ди-(5 -дезокси-5-тиотимидилил)-3, 5 -(5-дезокси-Б -тиотимидин)-3-фосфотиоат (21). 0,183 г соединения 20, содержащего 0,061 ммоль его Lig-соли и 0,034 г литиевой соли 2,Б-дидезокси-5 -тиотимидин-3 - S-fi-циан этилфосфотиоата (0,067 ммоль), встряхивают в 3 мл дийетилформамида, содержащего 2% течение 4 ч, вьщерживают еще 2 ч и обрабатывают как на I стадии. Защиту с фосфата снимают как в I стадии примера 4 и получают после высушивания 0,19 г осадка,содержащего 0,055 ммоль (90%) ноналитиевой соли соединения 21, которую очищают ионообменной хроматографией. Стадия VIII. 2 -ДезоксиСм -изобутирилгуанилил-з,5-(5-дезокси-5 -тиотимидилил)-3,5 -ди-(5-дезоксн-5 -тио-М -анизоклцитидилил)-з,5-(5-дезокси-5-тио-М -бензоиладанилия) -з5-три(5-дезокси-5 -тиотимидилил) -3,5-(5 -дезокси-5-тиотимидин)-3 -фосфотиоат (22). 0,19 г соединения 21, содержащего 0,ОББ ммОль его 1 р-соли и 0,031 г литиевой соли 2,5-дидезокси-5 -иодтимидин-3 -S-IV-цианэтилфосфотиоата (0,061 ммоль), встряхивают в 3 мл диметилформамида, содержащего 3% воды, в течение Б ч, выдерживают еще 3 ч и обрабатывают как на I стадни, промывая осадок этанолом (2x2 мл). Защиту с фосфата снимают как в I стадии примера 4 и получают 0,18 г осадка, содержащего 0,0485 ммоль (88%) декалитиевой соли соединения 22, которую очищают ионообменной хроматографией. Стадия IX. 2-ДeзoкcиfN -изoбyтирилгуанилил-З ,5 -(5 -деэокси-5 -тио тимидилил)-3,(5 -дезокси-5-тио-N -анизоилцитидилил)-з , 5 - (5-дезокси-5 -тио-Н -бензоиладенилил) -З ,5 -тетра-(5 -дезокси-5 -тиотимидилил),5-(5 -дезокси-5 -тиотимидин)3-3 -фосфотиоат (23). 0,18 г порошка неочищенного соеди нения 22, содержащего 0,0485 Ммоль его L i -соли и 0,028 г,литиевой соли 2 , fj-дидезокси-5 -иодтимидин-3 - -5-|.-цианэтилфосфотиоата (0,053 ммол встряхивают в 3 мл диметилформамида, содержащего 4% воды, в течение 6 ч, выдерживают раствор еще 4 ч и обраба тывают как описано в I стадии, промы вают осадок в конце этанолом (2 х 2 мл Снятие защиты с фосфата проводят как в I стадии примера 4. Получают 0,178 г бесцветного порошка, содержа щего 0,0435 ммоль (90%) ундекалитиевой соли соединения 23, которую очищают ионообменной хроматографией. Стадия X. 2-Дезокси N -изобутирилгуанилил-З ,5-(5 -дезокси-5-тиотимидилил)-3,5-ди-(5 -дезокси-5 -тио-И-анизоилдитйдилил)-з ,5 -(5 -дсзокси-5 -тио-Н -бензоиладенилил) -з , 5 -пента- ( 5 -яезокси-5 -тиотимидилил)-з , 5- (5 -дезокси-5 -тиотимидии) -з -фосфотиоат (24). 0,178 г порошка соединения 23, содержащего 0,0435 ммоль его L i -coли и 2,5-дидезокси-5 -иодтимидин-З -S-f -цианэтилфосфотиоата (0,0479 ммоль), встряхивают в диметилформамиде, содержащем 4% воды, в течение 7 ч, выдерживают еще 4 ч и обрабатывают как на 1 стадии, промывая осадок в конце этанолом (2x2 мл) Снятие защиты с фосфата проводят как в I стадии примера 4. Получают 0,182 г осалка,содержащего 0,0388 ммоль (88%) дедекалитиевой соли соединения 24, которую очищают ионообменной хроматографией. Стадия XI. 0,182 г соединения 24, содержащего 0,0388 ммоль его L i -coли и 0,0395 литиевой соли 2 ,5 -диде зокси-5 -иодтимидин-3 -S- -цианэт.илфосфотиоата (0,078 ftюль), встряхивают в 3 мл диметилформамида, содержа1цего 4% воды, в течение 8 ч, выдерживают 2 ч и обрабатывают как на Iстадии. Защиту с фосфата снимают как в I стадии примера 4, а защиты с оснований нуклеотидов - как во IIстадии примера 1 и продукт выделя ют при помощи ионообменной хроматографии на аминохроме как в Ml стадии примера 3, используя градиент 0-0,3 бикарбоната аммония. Выход тридекааммонийной соли соединения 14 86% (о, 137 г или 31,6% в расчете на Gps-Li HjO) . Пример 6.2 -Дезокси Ы -изобутирилгуанилил-3 ,5-(5 -дезокси-5 -тиотимидин) -3 -фосфотиоат (25). 0,051 г дигидрата динатриевой соли 2 -дезокси-М -изобутирилгуанозин-3 -фосфотиоата (0,1 ммоль) и 0,055г натриевой соли 2,5-дидезокси-5-иодтимидин-З-S-p-дианэтилфосфотиоата (0,105 ммоль) растворяют в 2 мл диметилформамида и выдерживают 1,5 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь обрабатывают так xte как в t стадии примера 5. Получают 0,083 г бесцветного порошка, содержащего 0,094 ммоль (94%) тринатриевой соли соединения 25, которую очищают ионообменной хроматографией. Характеристики образцов соединений, полученных в примерах 1-6, приведены в таблице. Правильность структуры полученных олигодезокситионуклеотидов основывается на: а)количественном протекании реакции образования З,5-фосфотиодиэфирной связи; б)наблюдении молекулярного веса и отрицательного заряда, что следует из данных гель- и ионообменной хроматографии; в)образовании при неполном фосфодиэстеразном гидролизе набора олигонуклеотидов, число которых соответствует числу мономерных звеньев в исходном олитонуклеотиде, что свидетельствует о природном (3, 5 )типе связей между ними,, г)полном расщеплении окислителями фосфотиодиэфирных связей с образованием набора окисленных мономеров, д)соответствии УФ-спектров полученных олигодезокситионуклеотидов расчетным данным. Пример 7. Определение матричной активности октануклеотида 14. Реакционную смесь (0,5 мл), содержаццую 0,16 мкмоль ГТФ; 0,16 мкмоль С-АТФ. (удельная радиоактивность 0, УМКМОЛЬ) ; 0,01 моль меркаптозтанола, 0,04 моль трис-НС) (рН 7,9); 0,01 моль MgCl.; 436 мкг/мл РНК-полимеразы Escherichia coli; октануклеотид - 2о.е./мл и г() - 2,7 о.е./мл инкубируют при 20С, отбирая аликвоты по 0,05 мл. Нх помещают на ватман 3 мм, высушивают, отмывают 5%-ной рихлоруксусной кислотой, содержащей 0,05 моль пирофосфата натрия, (3-х X 5 мл) при ОС, затем этанолом, высушивают и определяют радиоактивность на счетчике Маг К Ш. По полученным данным строят график зависимости количсства продукта транскрипции от времени (фиг. 1).

Пример 8. Определение матричной активности додекануклеотида 15.

Реакционную смесь, содержащую 0,16 мкмоль ГТФ; 0,48 мкмоль С-АТФ (удельная радиоактивность 0,84 УМКМОЛЪ ; 0,84 моль трис.-НС1 (рН 7,9); 0,01 моль меркаптоэтанола/ 0,01 моль MgClg, 262 мкг/мл РНК-полимеразы Escherichia со 1 i , додекануклеотид - 2о.е. и статистический тририбонуклеотид - 7,2 о.е., инкубируют 60 мин при , отбирая аликвоты по 0,05 Вьщеление продукта проводят как в примере 7. Данные представлены на фиг. 2.

Таким образом, иcпытye IЫfi соединения 14 и 15 проявляют матричные свойства в РНК-полимераэной системе изEscherichia coli и, следовательно, являются биологически активными соединениями.

Продолукение таблицы

3766 267 183,4) 234 (33,7) 0,163 4092 267 (91,2) 234 (35,0) 0,175 4115 267 (97,8) 234 (36,8) 0,190 П

Формула изобретения

Олигодезокситионуклеотиды общей ормулы

Г;.5....СН./Ох6„н

Vr

0.S-OH.

О

OR;

где В - тимин, цитозин, аденин,

гуанин; R - Н, остаток тиофосфата

S-p-циан (или-N , N-дифенил-

карбомоил)этилфосфотиоата

,2,3...,

проявляющие матричные свойства в РНК-полимеразной системе из Escherich i а со 1 i.

Источники информации, принятые во внимание при зкспертизе

кл. С 07 Н 19/06, 28.06.77.

f ис 1 еор h i 1 i с reaction of some nucleoside Dhosphorothioates - I. Am.Che Soc. , 1972, 24, p. 2079. а) Соединения 2,5,8,14 и 15 - аммонийные соли, остальные - в виде литиевых солей, в) После снятия защит с аминогрупп оснований нуклеотидов концентрированным аммиаком при 50°С в течение 4ч. c)Ионообменная хроматография нааминохроме С-3колонка 40 мкл, градиент 0,25 М , в 7 М мочевине (РН.7). d)Гель-хроматография на сефадексе 6-50 в 0,1 М бикарбонате аммония в 10%-ном этаноле. Колонка (0,49 X 30 cM),Kd , где Vg - объем выхода вещества с колонки; VQ (свободный объег.1) 4 мл; V , 5 мл. e) иодометрического титрования раствором иода в метаьоле. 0,32 98. 0,27 97 0,23 97

I

tJW

(

5

Е

§ Ж(7

5

ч d

IX.

150 t, мин

90 т

60

время

.1

I

ei.SW

|«ш

I

I

I

/flffff

W W SO SO t.MUH Время Фиг.2