Способ получения полидезоксинуклеотидов Советский патент 1982 года по МПК C07H21/04 A61K49/00 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИДЕЗОКСИНУКЛЕОТИДОВ

I

Изобретение относится к усов шенсгрвованному способу получения полиаезок- синуклеотидов, используемых в биохимии и генетике.

Известен способ получения полидезоксинуклеотидов путем конденсации в пиридине нуклеозидного (нуклеозид-3 хлорфенил-О-2-цианэтилфосфата) и нуклеогвдного (5 -О-диметокситритил-З -Охлорфенилфосфата нуклеотида) компонентов в присутствии арилсульфотетразолидов (например, толуолсульфотетразолида)

,и обработки продукта реакции кислотой (rv-толуолсульфокислотой) или триэтиламином или последовательной обработки кислотой и триэтиламином. Выход поди- деаоксинуклеотидов в расчете на исходный мономер составляет 3%. Вьщеление промежуточных и целевого щзодуктов осуществляют хроматографией 1.

Недостатками известного-, способа получения являются низкий вькод целевого продукта и необходимость вьзделения

хфомежуточных и целевого 1фодуктов хроматографией, что усложняет 1цюцесс.

Цель изобретения - увеличение выхода целевого продукта и упрощение щ}оцесса.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения полидеэоксинуклеотвдов путем конденсации в пиридине нуклеозидного и нуклеотидного компонеигов в врисутствин арилсульфотетразолидов и обработки щхадукта конденсации кислотой или триэтиламином или последовательной обработки кислотой и триэтиламином с последующим выделением церевого продукта в качестве нуклеозидного и нуклеотидного компо нентов в реакции конденсации используют 2 1езоксинуклеотвды общей формулы RjOCHzxOvB

О

о I

CHjS- Р о ORa где В - остаток тимина, W - анизоилцитоаина, № - бензоиладенина, N изобутирилгуанина;Н, ПрП - диметокситритил; Н, 2-цианэтил, до обработки продукта конденсации кислотой или триэтиламином тфодукт конденсации выделяют экстракцией хлороформом или смесью хпсроформ-метанол (7:3 с последующим снятием тиометильной защиты концентрированным аммиаком при .SO-6Cf С в течение 4-6 ч. Выход целевого гдаодукта 36%. П р и м е р 1. S -Диметокситритип -иаобутирилдезокситуанияил-Сз -.5 метилтир-. 5 ) - )(/2- - иаобутирилдеаоксигуанози11-3- S -метилтиофосфат I. 5 -Диметокситритил- N -изобутирил деаоксигуанозин-3 г- S -метилтиофосфат (153 мг, 0,2 ммоль) и М -изобупфилдезоксй уаноэнн-а -0 2 цианэт8л- -Г метилтиофосфат (128 мг, 0,2 ммоль) растворяют в сухом пиридине (2О мл) и упаривают в вакууме на ротационном испарителе до 2 мл. Добавляют 1ОО,8 м (О,4 ммоль) мезитиленсульфотетразилидв и оставляют лрн 20 С на 1 ч. К реакционной смеси 15 ибавляют 2О мл смеси ацетонитрил-трнэтиламин (1: i / V ) и нагревают 10 мин . Упарнвают в вакууме д х:уха, остаток pdctsopsuoT в хлороформе (2О мл), хлороформный раствор иромывают всщой (1О мл ХЗ), затем фильтруют безводный суль фат натрия и упаривают досуха. Получают вещество 1. В«дество гомогенно гри тонкослойной хроматографии в составе хлорофсрм: метанол (SilVv) (систе ма А). Измеренная суммарная плотность вещества I (ID260 ) РИ 26О нм 6850 оптических единиц (о.ед,), количество fUM. г |m вещества 1 Mj Oi6Q.дЬчио 0,190 (ммоль). Количество вещества 1 по поглощению диметокситоруильной Жз-ао . -iio группы М 500 0,195 (ммольУ. Отношение количества вещества I, измеренного по поглощению.при 260 нм и 500 нм М Р.97 Эта характеристика (М), р1чэёделяюшая количество полученного вещества двумя независимыми измерениями ( и ) и в гфеделе равная 1, дока зывает состав динуклеотида 1. Выход вещества 1 246мг; 0,19 ммол 97%. 9 44 Пример 2. Ц8-Бензоиладенозил-(з - Ь -метилтио б )-тимидин)3 -0-2-цианэтил- Л -метилтяофосфат (0). 5-Диметокситритил- № -бензоилдезоксиаденозин-3 - S -метилтиофосфат (168 мг, О,2 ммоль) и тимидин-а -О-2цианэтил-Ь-метилтиофосфат (84 мг, 0,2 ммоль) растворяют в сухом пиридине (20 мл) и упаривают в вакууме до I мл. Добавляют мезитилен сульфотетразолид (1ОО, 8 мг, 0,4 ммоль) и вьщерживают гри 2О С в течение 1 ч. Упаривают с толуолом (2О мл 2; досуха и растворяют в хлороформе (20 мл). К охлажденному до ДО раствору 1филивают охлажденный до 2%-ный pateTBop толуопсулъфокислоты (2О мл) в смеси метанол-хлороформ (3:7). Через 2 мин нейтрализуют.5%tObiM водным раствором бикарбоната ватрия, водный слой отделяют, органический слой промывают водой (10 млх2), фильтруют через безводный сульфат натрия и упаривают досуха. Получают соединение И (384О о.е., 222 мг, 0,191 ммоль, 98%).-&г50 196О. Вещество гомогенно 1фи тонкослойной хроматографии в системе А. Это подтверждает состав соедяненнга IL Пример 3. 5-Диметоксатритил fi -изобутирил-дезоксигуанилил-( -S метилтио о )- N -изобутирилдезоксингуанилил-(3 -3 -метклтио - 5 )- М бензоилдезоксиаденоэнл-(3 -5 -метилтио5 -тимидицl-3 -0-2-цианэтил-S -. метилтиофосфат (Jl). Соединение 1 (685О о.ед., О,19 ммоль) и соединение (П) (384Оо.ед.; 0,19 ммоль) растворяют в сухом пиридине (ЗО мл) и упаривают в- вакууме до 2 мл. Добавляют мезитиленсульфатетразолид (1ОО,8 мг, О,4 ммоль) и вьздерживают 1 ч. при Добавляют воду (0,2мл), вьщерживают 1 мин и растворяют в хлороформе (20мл). Хлороформный раствор промывают водой (1О мл X 3, фильтруют через безводный сульфат натрия, упаривают в вакууме, затем снова упаривают с толуолом (2Омл). Сухой остаток растворяют в хлорофсфме (1О мл) и наносят на колонку с силикагелем (V ЗОмл). Элюируют в градиенте концентрации метано,ла в хлороформе (300 мл хлороформа в резерву е и ЗОО мл 5%-ного-метанола в хлчэофсфме в смесителе) Получают соединение Ш (9350 о.ед. 38О мг, 0,18 ммоль, 90%), SiSO 5500. Вещество гомсйенно при тонкослойной хроматографии на силикагеле в системе А. Огнощение количеств вещества Я1, измеренных при 260 нм и 5ОО нм, М О,95. Это подтверждает состав соединення Ш.

Пример 4. N -Бензоилдезокснаденозил-{з- S-метилтио- 5 )-3-днбензоилдезоксиадеиозин (1У).

Конденсация 5 -О-днметокситритнлМ -бензоил-дезоксиаденозин 3 - S -меТ1штиофосфата (78,4 мг, 0,1 ммоль) с

i, З-дибензошщезоксиаденозином (44,7 мг, О,1 ммоль) и обработка реакционной смеси в условиях геймера 2 дает вещество IV (2130 о.ед,, 1О1 мг, 0,96 ммоль, ) Вещество IV гомо генно при тонкослойной хроматопзафии на силикагеле в системе А.

Saeo « 222,0 аед. Э-го iдоказывает, состав соединения IT.

Пример 5. 5 -О-Диметокситритилтимидилш1-(3| - $-метилтио - зЧ-И изобутирйлдезоксигуанознн-З - Ь-метилтиофосфат (у).

Конденсация 5-О-диметокситритилтимйдин-3 -S-метилтиофосфата (б6,1мг 0,1 ммоль) с Н -изобутирилдезокснгуа- нознн-3-О,2-4ХиавэтШ1- $-метилтиофосфатом (63,8 мг, 0,1 ммоль) и обработка реакционной смеси в условиях 1фимера 2 дает вещество (256О о.ед., 1О4 мг, 0,94 ммоль, 94%). ВеществоV гомогенно при тонкослойной зфоматографии на сипиказгеле в спгтемё А. Отношение количеств вещества V, измеренных Щ)И 26О нм и 50О нм, М О,97. 260 27 2О. Это подтверждает. состав соединения у.

Пример 6. 5 -О-Диметоксвпритил-тимвдилш1-(3- &-метилтио- 57t N изобутирилдеаоксигуашшил-СЗ - Sметилтио - 5 )- -бензоилдезоксиадё- нозил-(3- е-метилтио- б )- М, Зднбензоилдезоксиаденозин (Vl).

Конденсация соединенвя IV (213Оо. ед., 0,О96 ммоль) и соединения (V) (2560 о.ед., 0,О94 ммоль) и обработка реакционной смеси в условиях 1фимера 3 дает соединение У1 {455ОО.ед., О,О86 ммоль, 92%). Соединение У1 го могеняо при тошсослоййой яроматографии на силикагеле в системе А. Отношение количеств вещества Yi, найденных юри 26О нм и 5ОО нм, М 0,95. &2В( 494О. Это подтверждает состав соединения VI.

Пример 7. 5 -диметокситритилМ (-иэобутирилдезоксигуапаилия- -.S метилти9 - 5 )- К назобутщэилдеёокскгуанилил-(3 - S-метилтио б )- W бензбилдезсксиаденозил-(3 - 3-метялпю r5 )-тимидлл-(3 - -метилтио- б )-Н

иаобутирнлдезоксигуанил1т-(3 -5 -метвлтио - N -изобут15)Ш1Двзоксигуанилил-(з- S-метилтио- 5 )- №-бензою1дезоксиаденозил-( з - S -метилтио )тимидинТ-й -О-2-41паютил 5-метилтиофосфат (yil).

Вещество Ш (4675 аед., 0,О9 ммоль обрабатывают Ю мл смеси ацетонитрилтриэтиламин ( } к нагревают 10 мин при 50С. Уп|фают в вакууме досуха, остаток растворяют в хлорофс ме (1О мл), хлороформный раствор i oмывают водой (5 млх-з) затем фильт руют через безвсщш ( сульфат натрия и упаривают досуха. Получают 5 нзиметокситрятЕЛ- tM -иаобут1фнлдезокси гуанил1ш-(3 - S-метнотио- 5 )- Н изобутирилдезсжсигуаналил-(3 -S-метилтио-v 5)-М®- бекз6нлдез(жсиаденозип--) (З - 5-метилтио-- 5 )-тимидш11 метилтиофосфат (ШЯ).

Вещество (Щ) (4675 о.ед., О,09 ммо растворяют в хлороформе (1О мл).К охлажденному до хлороформному раствору 1фш1ивают охлажденный до О°С 2%ный раствсф тояуолсупьфокислоты (1О мл в смеси MeTaHQii-xnopc qpM ( ). Через 2 мин нейтрализуют 5%-ным водным раствором бикарбоната натрия, водный слой отделя1бт, с ганвческий слой Щ)омывают водой (5 мл ч2), фильтруют через безводный сульфат натрия и упаривают досуха. Получают М -изобутщзнлдеэоксигуанилил-(з - S-метилтио- 5 )- N изобутирш1дезоксигуанилил-(з - S -метилтио- 5 )- N -бензоилдезоксиаденозил(3 - S-метилтио- 5 )-тимидин-3 -О-2цианэтил-5-метилтиофосфат (). Конденсация вещества VJjl с веществом 1Х и обработка реакционной смеси в условиях гфимера 3 дает соединение STl (7 560 о. ед., О.ОбЗ ммоль, 7О%). гбО ЮБОО. Вещество гомогенно при тонкослойной хроматографии на силнжагеле в системе А. Отношение количеств вещества 1, найденных при 260 нм и 50О нм, М 0,95. Это подтверждает состав соединения УИ.

Пример 8-5 -ДиметокситритилiV -изобутирилдезоксигуанилил-(3 -S метилтио- -5 )- N -нзобутирилдезоксигуанилил-(3-S -метилтио- -б /-м-бензоилдезоксиаденозил-(з - S -метилтио 5 )-тимид1ш-(3 - 5-метилтио- 5 )- Н изобутирилдезсжсигуанилил-(3 - S -метилтис- 5 )- М -изобутирилдезоксигуаии1( -S -метилтио-.5 )- -бензоиллилдезоксиаденозил-( з - &-метилтно- 5 )тимидилил-( З - S -метилтно )-изобути рилдезоксигуанилил-(з -S метилтио- 5 Iтимидилил-( 3 -S-метилтио-J-S - N бензош1дезоксиадрнозил-(3 - 5-метнлтио- -5)-К -бензоилдезоксиаденозил-(3 S-метилтио- -5)- N , з -дибензоилдезоксиаденозин {X}. Соединение Ш (259 мг, О,О63 ммоль обрабатывают 1О мл смеси ацетонитрилтриэтиламин (1 : iVv ) и нагревают 10 мин при . Упаривают в вакууме досуха, остаток растворяют в хлороформе (10 мл), хлороформный раствор промывают водой (5 млxЗ, затем фильтруют через безводный сульфат натрия и упаривают досуха. Получают 5 -диметокситритил- N -изобутирилдеэоксигуанилнлСЗ - S -мeтилтиo- 5)-N -йаобутгфилдез оксигуанилил-(3 - 5-метилтио- 5 )- - бензоилдезоксиаденозил-( З - S -метиптио )-тимидилил-(3 - S-метилтио-.5 )М -изобутирилдезоксигуанйлил-( метилтио- 5 )- Ц -изобутириядеаоксигуа нилил-(о - S -метилтио- -5 )-Н -бенаоип дезоксиаденозил-(3 - S-метилтио- б)- тимидин-3 - § -метилтиофосфа (XI) (249 мг, 0,063 ммояь). Соединение 71 (172 мг, О,О86 ммоль растворяют в хлороформе (1О мл). К охлажденному до СР С хлороформному раствору приливают Ю мл охлажденного до оС 2%-ного раствора толуопсульфокислоты в смеси метанол-хлсфоформ ( Через 2 мни нейтрализуют 2%-ным раствором бикарбоната натрия, водный слой отделяют, органический слой промывают водой (5 ), фильтруют через безводный сульфат натрия, упаривают досуха. Получают тймидипил- ( - -метклтио- 5 )- N -изобутярилдез оксигуанилил-(3 -S -метилтио- -5 )-Н бензоилдезоксиадрнозил-(3 -S -метилтно -б )- N® , 3 -дибензоилдезоксиаденозил (ХП) (154 мг, О,О86 ммоль). Конденсация соединения Х1 (259 мг, 0,О63 ммоль) и соединения XII (172 мг 0,086 ммоль) и обработка реакционной смеси в условиях /прим.ера 2 дает веществ X (22О мг, 0,О38 ммоль, 60%). 1554О. Вещество гомогенно при тонкослойной хроматографии на силикагеле в системе А. Отношение количеств вещества X, найденных при26О нм и 5ООн М 0,96. Соединение X нагревают в концентрир ванном аммиаке (20 мл) 6 ч при 5О С. Получают 5 -диметокситритил-дезоксигуа нилил-(3 - 5 )-дезоксигуанш1ил-(3 б )-аденозил-( )-тимидил-( )гуанилил-(з 5 )-гуанилил-( )5 ) тимидилил-( аденозил (З тимидилил-( J- 5 }-тимидилил (згуанилил-( з- 5 )-аденозил-(3 )дезоксиаденозин (Xlll). Аммиак упаривают на ротационном испарителе, до- бавляЪт к остатку 8О%-ную уксусную кислоту (10 мл) и сразу же упаривают, затем к остатку добавляют воду (1О мл) и опять упаривает, олучают соединение ХТу. Соединение XIV хроматографируют на колонке с аминохромом (V 200 мл). Элюцию проводят в градиенте , (рН 7) в 7М мочевине при 40С. Обессоливание 1чэоводят на колонке с сефадексом О-1О ( V 50О мл). Применение предложенного способа позволяет увеличить выход целевого продукта до 36% а исключить из процесса трудоемкую стадию хроматографической очистки. Формула изобретения Способ получения полидезоксинуклеотидов путем кондексации в пиридине нуклеозидного я вуклеотидЕЮГо компонентов в присутствия арилсупьфотетрааолидов и офвботки 1фодукта коцденсации кнслотой вли трвэтиламином или последовательной обработки кислотой и триэтиламином с последующим вьшелением целевого Щ)0дукта, отличающийся тем, что, с иелью угрощения прсщЕжса и повышения выхода целевого 1фодукта,в качестве нуклеозидного и нуклеотвдного компонентов в реакции конденсации исполь.зуют 2-дезоксинуклеотиды общей форму Т о вкр С Нз8-Р 0 I / I где В - остаток тимина, М -анизоилцитозина, N -бензоиладенина, М -изобутирилгуанина;R - Н, п, п-диметокситритил; R2 - Н, 2-цианэтил, до обработки продукта конденсации кислотой или триэтиламином гцзодукт конденсации вьщеляют экстракцией хлороформом или смесью хлороформ-метанол (7:3) с последующим снятием тиометильной защи&926964.10

ты конце грирова шым аммиаком щт 50-I.R. Ство et at,,.Chemicot ц

вО«С в течение 4-6 ч. -o genea foriKuWn insutm . I

Hct04HHKH информации,. Sci. US/k, 1978.75. ,

i4JHHHTbte eo ввиманве при экспертизе5765-5769 (хфототип).