Способ получения олигодезокситиотимидилатов Советский патент 1982 года по МПК C07H19/06 

(5) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОЛИГОДЕЗОКСИТИОТИМИДИЛАТОВ

I

Изобретение относится к усовершенствованному способу получения олигоноснг „ Th

Q

где Th

остаток тимина; , R водород, остаток тиофосфата или S-2-цианэтилтиофосфата; 0; 1; 2; 3.

п

дезокситиотимидилатов общей формулы

- СНг о Th

О

Олигодезокситиотимидилаты являютс тиоаналогами природных полидезоксирибонуклеотидов и способны успешно заменять их в ряде важных биохимичес 391 ких систем, например в ферментативных реакциях, катализируемых РНК-зависимой ДНК-полимеразой (ревертазой), полинуклеотидкиназой и различными фосфрдиэстеразами. Известны два способа получения олигодезокситиотимидилатов. Ключевой стадией в них является создание З ,5 -фосфотиодиэфирной связи между ос татками тимйдина, входящими в состав олигомера. Для этого используют мономеры особого типа, содержащие в одной молекуле как электрофильную группу, способную замещаться (трзилат), так и нуклеофильную (тиофосфат), которая способна атаковать освобождающееся место. Образование З ,5 -фосфотиодиэфирной связи происходит в результате реакции замещения тозилата в 5 ToS-тимидин-3 -0-ЦианэтилфосфотиоатахГ1 или в з-ToS-тимидин-З-S-2-цианэтилфосфотиоатах 2 тиофосфатом тимйдина или олиготимидилата. Наиболее эффективным является способ 2. Пентатиотимидилат в ,этом случае получают взаимодействием 1 эквивалента триэтиламмонийной соли тимидин-(или олиготимидилил)-3 -фосфотиоата с 1-5 эквивалентами той же соли - 5 -ToS-тимидин-З -S-цианэтилфосфотиоата в диметилформамиде в присутствии трибутиламина. По окончании реакции проводят щелочной гидролиз цианэтильной защиты. Олигомер выделяют и очищают хроматрграфическими методами. Полученный продукт со свободной.З -фосфотиоатной группой вновь обрабатывают мономером. Таким образом, производят сту пенчатое наращивание олигонуклеотидной цепи. Средний выход на стадию со ставляет 30. время реакции I- суток при 30-37°С, общий выход пентдтиотимидилата в расчете на исходный тимидин-3 -фосфотиоат 0,7%. Использование в этом способе мономеров с S-цианэтилфосфотиоатными группами дает меньше побочных продуктов, чем в случае 0-цианэтилфосфотиоатных про изводных 1 3 , так как нуклеофильност серы понижена настолько, что она не способна участвовать ни во внутримолекулярном взаимодействии с собственной 5 -ToS-группой, ни .8 межмолекулярных реа 5Циях до снятия защиты. Недостатками этого способа являются низкий выход ОЛИгонуклеотида, зарязненность олигонуклеотида предыдущим олигомером и продуктами деградации исходного и образующегося компонентов, длительное время синтеза, а также проведение процессов выделения и очистки на каждой стадии синтезированного ; олигомера . Скорость образования олиготимидилатов в случае применения триэтиламмонийных солей исходного тимидин-3 -фосфотиоата и мономера низка даже при повышенной температуре. Цельюизобретения является упрощение способа получения и повышения вы хода олигодезокситиотимидилатов. Цель достигается тем, что олигодезокситиотимидилаты формулы I получают путем взаимодействия литиевой соли тимидин-(или олиготимидилил)-3| -фосфотиоатов с 2 ,5 -дйдезокси-5 -йод-производными тимйдина о&цей формулы , JCH О Т W. где Th имеет приведенные выше значения;водорЬд, остаток Li-соли S-2-цианэтилфосфотиоата, в диметилформамиде при комнатной температуре с последующими обработкой полученного рлиготимидилата щелочью и взаимодействием с новым мономером. Целевой продукт выделяют известными приемами. Продукт образуется практически q количественным выходом, поэтом|у его не следует подвергать хроматографической очистке и можно использовать на следущей стадии синтеза5910651 HOCHj о. thJCHjQ ThHOC w - о o sHOCHj „ Th k V 0 S CHa Th v 0ч , Th- ocmamoff .

Реакция тимидин-3 -фосфотиоатов с 2 ,5 Дидезоксй-З-йодтимидин-З -S-2-цианэтилфосфотиоатами протекает в два раза быстрее,чем в известном способе для соответствующих толуолсульфонильных производных. Это позволило сократить время реакции, и сни-t зить температуру реакционной смеси , до 18-25°С.

Использование тимидин-З -фосфотиоатов в виде литиевых солей позволило уменьшить разложение реагентов и продуктов. Литиевые соли по сравнению с аммонийными солями и солями щелочных металлов оказались наи15олеё реакционноспособными. Использование почти эквивалентных соотношений ретагентоа ( избыток) при отсутствии побочных продуктов и практически количественном вь1ходе олигрнуклеотида существенно упрощает процесс его выделения. Ионообменную хроматографию применяют только в конце синтеза, а выделение на промежуточ ных стадиях проводят простым ,осаждением продукта ацетоном или при необходимости гель-хроматографией на сефадексах.

гидролиза цианэтильной защиты целесообразно использовать гидроокись лития, так как образующуюся литиев;| ю V0 «-СгН,СК Гсг JCHx ,, ТП x 0 SСОЛЬ ояигонуклеотида можно сразу применять на следующей стадии.

Пример 1. 2-Дезокси-Гтимидилил(3 5)-5-дезокси-5 -тиотимидин1-3-5-2-цианэтилфосфотиоат О).

Тимидин-3 -фосфотиоат(дилитиевая соль, дигидрат, 0,0386 г, 0,1 ммоль) и 2,5-Дидезокси-5-тиотимидин-З-S-цианэтилфосфотиоат {литиевая соль 0,053 г, 0,105 ммоль) смешивают в 1 мл диметилформамида, смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч. Конец реакции определят методом йодометрического титрования тиофосфатных групп и хроматографией на диэтиламиноэтилцеллюлозе вградиенте NaCB после щелочного гидролиза цианэтильной защиты. По окончании реакции к реакционной смеси добавляю ацетон (5 .мл), выпавший осадок центрифугируют,, промывают ацетоном (З мл), сушат в вакууме. Выход соединения 1 в виде дилитиевой соли 0,0685 г (95%). Результаты анализа образца после очистки гель-хроматографией на сефадексе G-25 в 0,02 М приведены в таблице.

Пример 2. 2-Дезокси-Гтимидилил-(3 5 )-дезокси-5 -тиотимидин -З-фосфотиоат (2). 6 g 0 Th , « 0ч .00 S-CgH CN 7 Соединение 1 из примера 1(0,0685 О,-095 ммоль) растворяют в 1 мл 0,5 н гидроокиси лития, выдерживают 1 ч, нейтрализуют избыток щелочи катионообменной смолой Дауэкс-50 в Н-форме до рН 7, смолу отфильтровывают, фильтрат лиофильно высушивают. Выход соединения 2 в виде трилитиевой соли 0,063 г (38%). Пример 3.2 -деэокси - гимидилил-(з 5 )-5 -дезокси-5 -тиотимидилил-(3 5 )5 -дезокси-5 -тиотимидин -3 -фосфотиоат (3). Трилитиевую соль соединения 2 v,0,063 г, 0,095 ммоль) из примера 2 растворяют при встряхивании в 1 мл диметилформамида, прибавляют раствор литиевой соли 2 ,5 Дидезокси-5 -йодтимидин-З -S-2-цианэтилфосфотиоата (0,050 г, 0,099 ммоль) s 1 (лл диметилформамида и выдерживают 1 ч. Продукт выделяют, как в примере 1, используя вдвое большее количество ацетона, Защиту с тиофосфатной группы снимают так же, как в при мере 2. Выход тетралитиевой соли сое динения 3 0,089 г (95). Результаты анализа приведены в таблице. Пример . 2 -Дезокси- тимидилил-(3- 5 )-Ди-(5 -дезокси-5 -тио тимидилил) - (З 5 ) -5 -дезокси-5 -тиртимидин -3-фосфотиоат («). Тетрал71тиевую соль соединения 3 из примера 3 (0,089 г, 0,089 ммоль) растворяют в 2 мл диметилформамида при встряхивании. Прибавляют литиевую соль 2 ,5 Дидезокси-5 -йодтимидин-З -S-2-цианэтилфосфотиоата (0, г, 0,0935 ммоль) и встряхивают 3 ч. Продукт выделяют как в при мере 3- Выход пенталитиевой соли сое динения О,ПО г (93%). Результаты анализа приведены в таблице. Пример 5. 2-Дезокси- тими дилил-(3 5 )-три-(5 -дезокси-5 -тиотимидилил) - (3 1) -5 -дезокси-5-тиотимидин -3 Фосфотиат (5). Это соединение получают, как сое динение t в примере , используя 0,055 г (0, ммоль) пенталитиевой соли соединения и (0,022 г, 0, ммоль) литиевой соли 2 ,5 -дидезокси-5 -йодтимидин-З -S-2-цианэтилфосфотиата. Выход гексалит евой соли соединения 5 0,0б4 г (93% Результаты анализа приведены в табл це. 1В П р и м е р 6. 2-Дезокси- тимидилил.(3 5 )-три-(5 -дезокси-5 -тиотимидилил)-(З- 5 )-5-дезокси-5 -тиотимидин (6). Пенталитиевую соль соединения (пример Ц, 0,055 г, 0, ммоль) и 2,5 -дидезокси-5 -йодтимидин (0,03 г. 0,08 ммоль) растворяют при встряхивании в 1,5 мл диметилформамида. Затем раствор выдерживают еще 6ч, осаждают олигонуклеотид 6 мл ацетона, осадок центрифугируют, промывают ацетоном (315 мл), высушивают в вакууме, растворяют в 1 мл 0,02 н. NH4HCOi3 и наносят на колонку с сефадексом G-25 ( см). Элюцию проводят 0,02 н. NH4HCOJ в 20%-ном этаноле, рН 7,5. После удаления и воды в вакууме продукт лиофильно высушивают. Выход соединения 6 в виде тетрааммонийной соли 0,ОбЗ г (9). Результаты анализа приведены в таблице. Для ферментативного расщепления 0,1 ммоль соединения 6 инкубируют с сырым змеиным ядом (0,05 мг) в 0,05 М трис-НСЕ буфере и 0,01 М MgCfa. при 37°С в течение 10 мин. Раствор концентрируют в вакууме, продукты гидролиза выделяют хроматографией на бумаге в системе изопропанол-вода (бс), элюируя их водой и определяя концентрацию спектрофоТометрически. При Гидролизе образуются 2,5 ДИдезокси-5-тиотимидин-5-фосфат и 2 -дезокситимидин, которые были идентифицированы по УФ-спектрам и сравнением с контрольными образцами соответствующих кислородных соединений. Правильность структуры полученных олигодезокситиотимидилатов (1-6) основывается:на количественном протекании реакции образования З- 5-фос отиодиэфирной связи без каких-либо побочных продуктов; на наблюдении увеличения молекулярного веса и отрицательного заряда, что следует из результатов гель-хроматографии и ионообменной хроматографии;на образовании при неполном фосфодиэстеразном гидролизе набора олигонуклеотидов, число которых соответствует числу мономеров исходного олигонуклеотида, что свидетельствует о природном (З 5) типе связи между ними;

991065110

на полном расщеплении окислителями на соответствии УФ-спектров полуфосфотиодиэфирных связей в исходном чанного олигонуклеотида Уф-спектрам ОЛИгонуклеотиде с образованием набо- соответствующих кислородных рлигонукра окисленных мономеров;леотидов. Гель-хроматография на сефадексе G-25 в 0,02 М бикарбонате аммония в 20%-ном этаноле, колонка см; расчет вели по формуле К Vg-Mg/V/, где Vg - объем выхода вещества с колонки; VQ - свободный объем; V 2,5 колонки. Ионообменная хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе, колонка 0,5 60 см, градиент 0-0,3 М NaCE в 7 М мочевине рН 7,5. Предлагаемый способ полумения оли годезокситиотимидилатов позволяет HOCIbQ Th YY

о, оo -gгде Th - остаток тимина; R - Н, остаток тиофосфата или S-2-цианэтилтиофосфата; . п 0; 1; 2; 3, включающий взаимодействие тимидин -фосфотиоата с нуклёотидными моно- сн Th

п

CHg „ ТН

О сократить затраты времени на одну стадию до 3- ч, довести средний выход на стадию до 95, снизить температуру и за счет применения почти эквивалентных соотношений реагентов и отсутствия побочных продуктов существенно упростить процедуру выделения и очистки продукта. Формула изобретения Способ получения олигодезокситиотимидилатов- общей формулы мерами, содержащими 5 -электроноакцепторную группу и З 5-2-алкилфосфотиоатную группу,, в диметилформамиде и обработку полученного олиготимидилата щелочью с последующим взаимодействием с новым мономером, о т 11910651t2

личающийся тем, что, с где Th имеет приведённое значение; целью упрощения процесса и повышенияR - Н, остаток Li-соли S-2выхода целевого продукта, литиевую-цианэтилфосфотиоата,

соль. Тимидин-(или олиготимидилил)-З-Источники информации,

-фосфотиоатов подвергают вэаимодейст-,.5принятые во внимание при экспертизе ВИЮ с ,5-дидезокси-5-йодпроизвод-1. Stanlslav Chladek and Joseph

ными тимидина общей формулыNagyvary. Nucleophillc Reactions oiF

JCH ThSome Nucleoslde Phosphorothioates(5.

ix- VJAm. Chem. Soc., Э, 2079, 1972. 2.Л . Kresse., K. Nagpal and

1-IЛ. Nagyvary Nucleoc Acid. Kes. 2,

O-R1-9, 1975 (прототип).