Йодпроизводные дезокситионуклеотидов,как мономеры для синтеза олигодезокситионуклеотидов Советский патент 1982 года по МПК C07H19/04 C07H21/04 

(5) ЙОДПРОИЗВОДНЫЕ ДЕЗОКСИТИОНУКЛЕОТИДОВ КАК МОНОМЕРЫ ДЛЯ СИНТЕЗА ОЛИГОДЕЗОКСИТИОНУКЛЕОТИДОВ

Изобретение относится к новым химическим веществам, конкретно к йодпроизводным дезокситионуклеотидов, которые могут быть использованы в ка честве мономеров для синтеза олигодезокситионуклеотидов. Известны 5-йодпроизводные дезокситионуклеотидов, используемые в качест ве мономеров для синтеза олигодезокси тионуклеотидов общей формулы р.. о SCettiCN где В - тимин, анизоилцитозин, N - бензоиладенин, N - изобутирилгу анин; К - катион лития или натрия. Характерной особенностью таких соединений , обусловливающей их применение, является наличие в их структуре двух функциональных групп: 3-5-| -циа этилфосфотиоатной группы и 5- атома йода. Замещение атома йода на остаток 2-дезокси-М-ацилнуклеозид (или олиготйонуклеотидил)3 -фосфотиоата приводит к образованию олигодезокситионуклеотидра, содержащих на З-конце 5-| -цианэТилфосфотиоатную группу.После щелочного гидролиза |) -цианэтильной защиты фосфотиоатная группа освобождается и реакция замещения повторяется с новым мономером. СкорЬсть взаимодействия таких мономеров сильно зависит от длины фосфотиоатного компонента 2 -дезокси-Н-ацилнуклеозид (или олигодезокситионуклеотидил)-3-фосфотиоата и уменьшается с увеличением длины последнего 1 }ЙШ Недостатками известных соединений являются: недостаточно высокая ско-; pocTb взаимодействия с литиевыми солями 2 -дезокси-Н-ацилнуклеозид . (или олигОдезЬкситионуклеотидил)-3 -фосфотиоатоа в диметилформамиде; уменычение скорости реакции таких соединений с олигодезокситионуклеотидил-3 Фосфотиоатами при увеличении длины последних, уменьшение скорости реакции таких мономеров с солями 2 -дезокси-М-ацилнуклёозид-З -фосфотио атов при замене в них катио1 ов лития на катионы тетра-н-бутиламмония, хотя использование последних необходимо для улучшения растворимости реагенто в диметилформамиде и повышения их реакционной способности. Последние недостатка делают практически нереальным синтез олигодезокситионуклеотидов, содержащих более 12 нуклеотидных остатка. Целью изобретения является новые 5 -йодпроизводные дезокситионуклеоти дов, которые по сравнению с известны ми представителями этого ряда при использовании в качестве мономеров для синтеза олигодезокситионуклео- тидов проявляют наибольшую реакционну способность, не снижающуюся при увеличении длины реагирующих с ними солей 2 -дезокси-М-ацилолиготионуклеотидил-3 фосфотиоатов или при замене в них катионов лития на катионы тетра-И-бутиламмония. Цель достигается свойствами новых йодпроизводных дезокситионуклеотидов общей формулыI CHj-V -С/ S - С О где В - тимин, нА анизоилцитозин, бензоиладенин, N - изобутирилгуанин. Отличие настоящих соединений от известных заключается в наличии поло «ительно заряженного структурного фрагмента, а именно N, N, N,N -диэтилметилариламиногруппы, что придае им новые свойства. В результате взаимодействия с собственным отрицатель но заряженным остатком фосфотиоата они образуют нейтральные внутренние соли не сорбирующиеся ни катионо-, ни анионо-обменниками. Наличие нового структурного фрагмента резко повышает реакционную спо собность предлагаемых соединений при получении олигодезокситионуклеотидов при этом происходит увеличение скорости реакции как с литиевыми, так и с тетра-М-бутиламмонийными солями 2 -дезокси- -ацилнуклеозид-3-фосфотиоатов. Скорость реакции соединений общей формулы II с увеличением длины реагирующих с ними олигодезокситионуклеотидами ,с 3 -фосфотиоатной группой остается постоянной при увеличении длины последних. Синтез соединений общей формулы 11 основан на известной реакции алкилирования f2 и заключается в алкилировании Дилитиевых солей 2-дезокси-М-ацилнуклеозид-З-фосфотиоатов йодидом 2-бром- М-(и -диэтилметиламино -фенил пропионамида в диметилформамиде с последующим йодированием образующегося продукта йодидом метилтрифеноксифосфония и выделением известными методами. . Пример 1. 2 ,5 -Дидезокси-5 -йодтимидин-3-5-2-С 1 -(.и-диэтилметиламино)-фенилЗкарбомоилэтилфосфотиоат (11 а) . К раствору тимидин-3 -фосфотиоата, дилитиевой соли, дигидрата (0,336 г, 1 ммоль) в 2 мл диметил(юрмамида прибавляют йодид 2-бром м Ч -диэтилметиламино -Ленил пропионамида (0,53 г„ 1 ,2 ммоль). После растврр.ения последнего выдерживают еще 2 мин, упаривают в вакууме с пиридином (3x10 мл), один раз с толуолом (10 мл). Масло обрабатывают 1 Н раствором йодида трифенокс1иметилфосфония (1,2 мл), выдерживают 10 мин и продукт осаждают 50 мл ацетона, осадок отфильтровывают, промывают ацетоном (ЗхЮ мл) и высушивают. Получают 0, г (11 а)(95) хроматографически гомогенного продукта.ТСХ на силуфоле в системе хлороформ -метанол - 0,5 М ацетата аммония 10:20:2 (А). Кинетически чистый продукт получают пропусканием раствора продукта в спирте через колонку, содержащую 5 мл дауэкс 50 (Li-форма) и 5 мл дауэкс 1 (СТ-форма), элюцией спиртдм, упариванием элюата до объема 0,5 мл и нанесением на колонку, содержащую 1 л сефадекса 6-15 файн. После элюции водои получают 12200 о.е. приЯ „о 2б7 нм. После упаривания в вакууме и .осаждения из метанола (2 мл) в эфир (100 мл) с последующим центрифугированием осадка, получают 0,5 г (80) продукта. УФ-максимум в воде 252 нм у, 21000), УФ-минимум - 227 нм

(уг11 г 8500). Реакция двукратного избытка 11а с ди- Ви П -солью тимидин-З-фосфотиоата при 20 С в диметилформамиде заканчивается Менее, чем за 1 мин. Защита с тиофосфатной труп- $ пы отщепляется в 1 М гидроокиси лития при полностью за 25 мин, при этом образуется 2,5-дидезокси-5-йодтимидин-3 -фосфотиоат и N-(nдиэтилметиламино)-фенилакриламид.

Пример 2. 2,5-Дидезокси-5 -йод-N -анизоилцитидин-3-5-2-ГМ-(У1-диэтилметиламино)фенилЗкарбомоилэтилфосфотиоат С 11 61. д

Алкилирование 2-дезокси-Н -ани- зoиJг цитидин-3 -фосфотиоата, дилитиевой соли, дигидрата (0,505 г, 1 ммол ) в диметилформамиде (2 мл) йодидом 2-6poM- N- п-диэтилметиламино) фенил пропионамида (0,53 г, 1,2 ммоль) с 20 последующим йодированием йодидом трифеноксиметилфосфония (1,2 ммоль) в условиях примера 1 дает после гельхроматографии на 1 мл сефадекса G-15 в спирте 0,65 г (82%) внутрен-г ней соли 11 б, гомосенной при ТСХ в системе А. УФ-максимум в воде 302 нм (301 25000 и 252 HMUM2 28900 , УФ-минимум - 235 нм Сс 21500) и 280 нм (Е. 20800 Л Так же как и 30 (11 а), 11 б реагирует с ди-Виц N солью тимидин-З-фосфотиоата менее, чем за 1 мин, гидролиз защиты с фосфотиоатной группы также заканчивается за 25 мин, давая 2,5 -дидезокси- 35 -5 -йод-N анизаилцитидин-З-фосфотиоат и N-(и-диэтилметиламино)-фенилакриламид.

Пример 3. 2,5-Дйдезокси-5-йод-М -бензоиладенозин-3-$-2- 40 СМ-(Ц-диэтилметиламино)фенилЗ-карбомоилэтилфосфотиоат Д11 в). i

Алкилирование 2-дезокси-N-бензоиладенозин-з -фосфотиоата, дилитиевой соли, дигидрата (0, г, 1 Ммоль)|5 в диметилформамиде (3 мл) йодидом 2-бром- - -(И-диэтилметиламинс1 фенил пропионамида (0,53 г, 1,2 ммоль) с последующим йодированием йодидом трифеноксиметилфосфония (1,2 ммоль) в .„ условиях примера 1 дает после гельхроматографии на 1 л сефадексаG-t5 в спирте и осаждения из метанола (3 мл) в эфир (200 мл) 0,6 г (7б%) внутренней соли 11 в, гомогенной при ТСХ в системе А.

УО-максимум в воде 252 нм ( 29500) и 280 нм ( 20900), УЛ-ми.нимум-227 нм ( 20300) и 272 нм(

20500). Реакция с дитетрабутиламмонийной солью тимидин-З фосфотиоата заканчивается за 5 мин в условиях примера 1, щелочной гидролиз протекает с такой же скоростью, что и для llq , давая 2,5-дидезокси-5-йод-N -бензоиладенозин-З-фосфотиоат и 1НЧи -диэтилметиламино)фенилакриламид.

Пример Ц. 2 ,5-Дидезокси-5-йод-Ы -изобутирилгуанозин-З -$-2- Н -(и -диэтилметиламино)фенил карбомоилэтилйюсфотиоат ( 11t) .

Алкилирование 2-дезокси-W -изобутирилгуанозин-З -фосфотиоата j дилитиевой соли, дигидрата (0,481 г, .1 ммоль) в диметилформамиде, (З мл) йодидом 2-бром CW- ( -диэтилмети-ламино ) фенил пропионамида (0,53 г, 1,2 ммоль) с последующим йодированием трифеноксиметилфосфоний йодидом (1,2 ммоль) в условиях примера 1 дает после гельхроматографии на 1 л сефадекса G-15 в спирте и осаждения из метанола (2 мл) в эфир (100 мл), 0,61 г (79) внутренней соли (111) , гомогенной в системе А.

У Ь-максимум в воде 255 нм ( ) и плечо 280 нм ( t 12бООО), УФ-минин м - 226 нм ( 10700). Реакция 11L и дитетрабутиламмонийной

соли тимидин-З -фосфотиоата в условиях примера 1 заканчивается за мин, щелочной гидролиз протекает с такой же скоростью, что и для На давая 2 ,5 -дидезокси-5-йод-Н -изобутирилгуанозин-3-фосфотиоат и N(-n -диэтилметиламино) фенилакриламид .

Мономеры общей формулы 11 были использованы для синтеза гексадекадезокситионуклеотида А состава 2- сЗ-ПСрз)

Aps Тр5-(Ср) (Тр5)з (Ср9)гЛ«(Тр 5 Выход А составил 17 мг (1б в расчете на исходный мономер или 89% на стадию) после выделения ионообменной хроматографией и Очистки гель-хроматографией. Хроматографические хэрвк геристики соответствовали 15-зарядному веществу. При неполном ФДЭ-гидролизе был получен набор олигомеров, число которых -соответствовало длине А, а при исчерпывающем гидролизе ФДЭ были получены продукты, по подвижности соответствующие мономерам.(А ) количественно фосфорилировался при обработке полинуклеотидкиназои фага Т. и-у З риАТФ. Анализ фДЭ-гидрОлизата А модифицированным методом Сэнжера дает структуру, совпадающую со структурой А. 7960 Полученный гексадекатиоиуклеотид по структуре является частью гена ан-гиотензинэ 1 и сшивается полинуклеотидлигазой фага Тд на кислородной матрице с соответствующим кислородным блоком. Использование соединений общей формулы 11 для синтеза олигодезокситио нуклеотидов показало, что они являются более эффективными мономерами, чем ранее известные и обладают .следующими преимуществами: увеличение скорости взаимодействия с литиевыми солями 2-дезокси-Ы-ацилнуклеозид ( или олигодезокситионуклеотидил -3 -фосфотиоатов в i раза, а с тетрабутиламПримечание. Формула изобретения йодпроизводные дезокситионук дов общей формулы сн, Т. ОхрхО Tg О (l)Tps(R) - 2,5 Дидезокси-5 -йодтимидин-3 - 5-2-цианэтилФосфотиоат; , , (3)bzAps(R) - 2,5-дидезокси-М-бензоил-5 йодаденозин-З-5 2-иианэтилфосфотиоат;(D)T- 2 7,5 -дидезокси-5 йодтимидин. монийными - в 20 раз в сравнении с известными соединениями; независимость скорости взаимодействия предлагаемых соединений от длины реагирующих с ними солей 2-дезокси-М-ацил-олиготионуклеотидил-з фосфотиоатов, что практически снимает ограничение длины целевых олигодезокситионуклеотидов, синтезируемых при помощи таких мономеров. Данные, полученные при использовании соединений общей формулы 11 в синтезе олигодезокситионуклеотидов, в сравнении с известными соединениями сведены в таблицу. где В - тимин, - анизоилцитозин, бензоиладенин, N - изобутирилгуа нин, как чрномеры для синтеза олигодезокситионуклеотидов. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1.Авторское свидетельство СССР по заявке № 2«0585б/23-0. 1976. 2.Coda A.F. Синтез нуклеозидов. I. Amer. Chem. Soc., m. 92, с. 190 ,1970. . ,.