Производные дезокситионуклеотидов как мономеры для синтеза политиодезоксинуклеотидов и способ их получения Советский патент 1982 года по МПК C07H19/04 

I

Изобретение относитсй к новым химическим сбединениям, а именно к производным дезокситионуклеотидов общей формулы

JCH о В

S-CgH CN

U)

где В - остаток тимина, N -анизоилцитозина М -бензоиладенина, или N -изобутирилгуанина; ион NHj, Na. Li, и к способу их получения.

Указанные соединения, их.свойства и способ получения в литературе не Ьписаны.

Производные дезокситионуклеотидов формулы используются в качестве мономеров для ступенчатого синтез.а политионуклеотидов,

Известен ряд производных дезокситионуклеотидов, используемых для олиготионуклеотидного синтеза: 5-О -ToS (толуолсульфонильные) производные тимидин-3-0-2-цианэтилфосфотиоата, 5 N -бензоилдезоксиаденозин-З -0-2. -цианэтилфосфотиоата и N -бензоилдезоксицитидин-З -0-2-цианэтилфосфотиоата, 5-Вг- и 5-С5-производные тимидин-З -0-2-цианэтилфосфо тиоата Il3, 5 -O-ToS-производные тимидин-3-S-2-цианэтилфосфотиоата и N -бензоилдезоксиаденозин-З -S-2-цианэтилфосфотиоата fij.

Наиболее пригодными из них являются производные 2. Наличие электрофильной S O-ToS и нуклеофильной 3-S-2-циаиэтилтиофосфатной групп позволяет использовать такие соединения для ступенчатого наращивания олигонуклеотидной цепи.

Недостатком таких производных является их низкая реакционноспособ- . ность, что приводит к значительному 391 увеличению времени синтеза, образованию побочных продуктов и к низкому выходу олигонуклеотидов. Известный способ получения 5 -0-ToS-производных, содержащих 3 S-2-цианэтилтиофосфатную группу, заключается в конденсации 5-0-ToS-дезоксинуклеозидов с S-2-цианэтилтио фосфатом в пиридине в присутствии триизопропилбензосульфонилхлоридаГ2 Известен также способ конденсации 5 -ацилъных производных дезоксинуклеозидов с 5-2-карбомоилэтилтиофосфатом в смеси гексаметилтрифосфамид-пиридин (1:1) в присутствии дициклогексилкарбодиимида СЗЗ. Способ f3J наиболее пригоден для синтеза соединений с высокореакционноспособными 5 -электрофильными группами, так как содержание в реакционной среде пиридина (50, реагирующего с такими группами, по такому способу меньше, чем по способу . Для конденсации используют двукратный избыток 5-2-карбомоил9тилтиофосфата и четырех.кратнцй избыток дицикл гецсил.карбодиимида. . Ре9)5цию проводят в течение t суток при встряхивании, так как пиридиниевая соль S-2-карбомоилэтилтиофосфата плохо растворима в пиридине. Недостатками этого способа являет ся сравнительно высокое содержание пиридина в реакционной среде, что не позволяет получать высокоактивные 5 -иодпроизводные с высоким выходом и необходимость использования для ускорения реакции большого избытка S-2 -карбомоилэтилтиофосфата. Целью изобретения является получение высокореакционноспособных производных дезокситионуклеотидов, кото рые могут быть использованы в качестве мономеров для ступенчатого си теза политионуклеотидов. Предлагаются производные дезокси тионуклеотидов формулы I -как мономе ры для синтеза политиодезоксинуклеотидов. Предлагается также способ получе ния соединений формулы I, который з ключается в том, что 2 5 -дидезокси -5 -йоднуклеозиды общей формулы JCHg В kf где В имеет приведенные значения, конденсируют с 2-5-кратным избытком S-2-карбомоилэтилтиофосфата в смеси гексаметилтрифосфамида (80-90%) и пиридина (10-201) при помощи 615-кратного избытка дициклогексилкарбодиймида. Указанные производные дезокситионуклеотидов реагируют с дезоксинуклеозид-3 -фосфотиоатами на два порядка быстрее, чем соответствующие тозильные производные. Это трудно было предвидеть,так как для более простых производных наблюдается обратная зависимостъ: алкилирующая способность алкилтозилатов в два раза выше алкилиодидов. Пример 1.5 -Йодтимидин-З 5-2-цианэтилфосфотиоат. Смесь -пиридиниевой соли (1,28 г, ммоль) пропусканием через катионообменную смолу Дауэкс-50 в пиридиниевой форме и 5-йодтимидина (0,35 г, 1 ммоль) высушивают упариванием с сухим пиридином(2 4 мл) на ротационном испарителе о Затем добавляют гексаметилтрифосфамид (k мл), упаривание с пиридином повторяют дважды и добавляют дициклогексилкарбодиимид (2,0 г, 10 ммолъ). Смесь встряхивают в темноте при комнатной температуре в течение 20 ч. Осадок отфильтровывают, фильтрат концентрируют до объема 5 мл, обрабатывают водой (10 мл) и эфиром (5 мл). Эфирный слой отделяют, экстракцию повторяют дважды. Водный слой фильтруют и проду| т выделяют ионообменной хроматографией на диэтиламиноэтилцеллюлозе в градиенте 0-0,1 М бикарбоната аммония. После концентрирования и удаления бикарбоната аммония продукт осаждают из метанола в эфир, сушат в вакууме. Выход аммонийной соли 0,3 г (8П). Вещество гемогенно при тонкослойной хроматографии на силикагеле в системе метанол-хлороформ-1 М ацетат аммония (10:10:1V/V). Уф-максимум в воДе при 2б7 -нм ( 9бОО). ИК-спектр содержит полосу поглощения нитрильной группы при 22002300 см-. Реакция (1) с тимидин-3 -фосфотиоатом протекает на 100% в диметилформамиде при 25°С. Отношение констант скоростей Kj/Kyos реакций первого порядка (t,Kj) и З -тозилтимидин-3 -S-2-цианэтилтиофосфа5та (КГОБ Я тимидин-З -фосфотиоатом равняется 100, Гидролиз цианэтильной защиты в 0,5 Но Li ОН при 20°С протекает наполовину за мин. Пример 2„ 5-йод-М -анизоилдезоксицитидин-3-5-2-цианэтилфосфотиоат. Конденсация 5 -йод-Н -анизоилдезоксицитидина (О, г, 1 ммоль) с пиридиниевой солвю S-2-цианэтилтиофосфата {i ммоль) в условиях, приведенных в примере 1, дает Q,8 г (77%) аммонийной соли. Вещество гомогенно при тонкослой ной хроматографии на силикагеле в указанной выше системе УФ-максимум в воде 302 нм (6 25000). ИК-спектр содержит полосу поглощения нитрильной группы 2200-2300 . Отношение K.j/KjQ2 ДЛЯ (2) равно 100, гидролиз цианзтильной защиты в 0,5 н. Li ОН при. протекает наполовину за k мин. При м. е р 3. 5-йод-М -бензо«л дезоксиаденозин-З -S-2-цианэтилфосфо тиоат. Конденсация 5-йод-М -бензоилдезоксиаденозина (0,6 г, 1 ммоль) с S-2-цианэтилтиофосфатом (k ммоль) в условиях, приведенных в примере 1, дает 0, г. (72) аммонийной соли. Вещество гомогенно при тонкослойной хроматографии на силикагеяе в системе, указанной выше. УФ-максимум в воде 280 нм (Е 20700). В ИК-спектре присутствует полоса нитрильной группы при 2200-2300 см-. K /K-ros для (З) равно 10, гидролиз цианэтиль ной защиты протекает наполовину за i мин в 0,5 н, LIQH при Пример 4. 5-Йoд-N -изoбyтирилдезоксигуанозин-3 -S-2-цианэтил Фосфотиоат р1 - III Конденсация 5 -иод-М -изобутирил/п .г 1 дезоксигуанозина (0,ч5 г, 1 ммоль) с S-2-цианэтилтиофосфатом И ммоль) в условиях примера 1 дает 0,5 г(73 аммонийной соли. Вещество гомогенно при тонкослойной хроматографии на силикагеле в ука занной выше системе. УФ-максимум в воде 280 нм (еП900), плечо 2552бО нм (16200). ИК-спектр содержит полосу нитрильной группы при 22002300 см-. K-y/Ktos (. равно 10, по.лупериод гидролиза цианэтильной защиты в 0,5 н. LiOH при 20°С равен k мин. 50 П р и м е р 5. Натриевая соль 5-йодтимидин-3-5-2-цианэтилфосфотиоата. Раствор аммонийной соли 5 -йодтимидин-3-5-2-цианэтилфосфотиоата(0,53 г, 1 ммоль) в 1 мл воды наносят на колонку (х1 см) с катионообменной смолой Дауэкс-50 в натриевой форме. Вещество элюируют водой, элюат упаривают на ротационном испарителе, осадок сущат в вакууму. Затем растворяют в метаноле (1 мл) и выливают в 50 мл сухого эфира. Осадок отфильтровывают, сушат в вакууме. Выход натриевой соли.0,51 г (95) Использование полученных производных дезокситионуклеотидов для ступенчатого синтеза политионуклеотидов показало их высокую эффективность в такого рода реакциях. Это позволило сократить время, затрачиваемое на одну стадию синтеза, до нескольких часов при выходе олигонуклеотида 95100 и существенно упростить процедуру его выделения и очистки. Предлагаемый способ синтеза таких производных позволяет получить их с выходом 73-81 и с более легкоснимаемой цианэтильной защитой. Пример 6. 2-Дезокси М -изобутирилгуанилилСЗ 5)-5-дезокси-5 тиотимидинЗ-3-S-2-цианэтилфосфотиоат. Ы -Изобутирилдезоксигуанозин-З -фосфотиоат, дилитиевую соль, дигидрат (0, г, 0,1 ммоль) и 5-йодтимидин-3 -S-2-цианэтилфосфотиоат, литиевую соль (0,055 г, 0,105 ммоль) смешивают в 1 мл диметилформамида и смесь выдерживают 1 ч. Конец реакции определяют по исчезновению тиофосфатных групп методом йодометрическо титрования и хроматографией на Диэтиламиноэтилцеллюлозе в градиенте хлористого натрия.после щелочного гидролиза цианэтильной защиты. По „ окончании реакции к реакционной смеи ч си добавляют ацетон (5 Мл), осадо) центрифугируют, промывают ацетоном (3 t мл), сушат в вакууме. Выход целевого продукта в виде дилитиевой соли 0,0о1 г, 95. Вещество может быть дополнительно очищено гель-хроматографией на сефадексе G-25 в 0,25 М бикарбонате аммония в этаноле. УФ-максимум (в воде) 258 нм (20800), К при гель-хроматографии -0,47. Полупериод гидролиза цианэтильной защиты в 0,5 М гидроокиси лития при 20 С k мин. При этом образуется Н изобутирил-2 -дезоксигуанилил-(3 5)-2,5 Дидезокси-5гтиотимидин-3 фocфoт foaт с содержанием концевых тиофосфатных групп близким к 1:1. Аналогичным образом могут быть использованы для синтеза олиготиод рксинуклеотидов и другие предлагае мые соединения. Формула изобретения 1. Производные дезокситионуклео дов общей Формулы 2 Ov к 0 S-C2H4CN где В - остаток тимина, N-анизби цитозина, N -бензоиладени н -изобутирилгуанина; Na-, Li, ион синтеза политиоде как мономеры для оксинуклеотидов. 2. Способ получения соединений h. 1, отличающийся тем 0 что 2 5 -дидезокси-5 -иоднуклеозиды общей формулы где В - имеет приведенные значения, конденсируют с 2-5-кратным избытком S-2-карбомоилэтилтиофосфата в смеси гексаметилтрифосфамида (80-90%) и пиридина (10-20) при помощи 615 кратного избытка дициклогексйлкарбодиимида. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1 , S, ChladekjJl. Nagyvary. Nucleophtlic Reaction of Some Nucleoside Phosphorothjoates -JL. Am. Chem. Soc., 9, 2079, 1972. 2.JZ,. Kresse, K.L. Nagpal.cJ.. Magyvary. The use of S-2-cyanocthyl phosphorothioate in the preparation of S -deoxy-S-thfothythycuidylates Nucleic Acid. Res, 2, i, 1975. 3. A.F. Cook, Nucleoside S-alkyi Phosphorothioates -J.. Am. Chem. Soc., 92, 190, 1970.