Способ выделения @ -зависимой супероксиддисмутазы из печени крысы Советский патент 1982 года по МПК C12N9/02 

Изобретение относится к химической энэимологии и может быть использовано в медицинской промышленности и в лабораторной практике для получения фермента Zn, Cu-зaвиcи юй супероксиддисмутаэы (1.15.1.1) из печени крысы, которая может найти применение в различных отраслях народного хоэ.яйства.

Супёроксиддисмутаза может найти применение для защиты от проникающей радиации, от токсичности высокого уровня кислорода в газовой смеси для дыхания, в качестве антимутагенного фактора, в онкологии, геронтологии, пищевой промышленности.

фермент специфичен к субстрату oj и катализирует следующую реакодпо:

Oj + О,+ .На02 + Oj,

реакцию спонтанной дисмутации супероксида .

Известно, что в активный центр супероксиддисмутаз входят многие металлы. Так, в клетках печени крысы найдено два типа супероксиддисмутаз: Zn, Си-зависимая (в цито3ОЛЬной фракции) и Мп-зависимая (в митохондриях).

Известен способ выделения Zn, Сизависимой супероксиддисмутазы из . печени крь:сы, включающий гомогенизирование сырья в экстрагирующем растворе, центрифугированием при 13000 g для отделения супернатОнта, обработку супернатанта, содержащего Нп-зависимую и Zn, Си- зависимую супероксиддисмутазы, смесью этанол-хлороформ (0,25V:0,15V) для уничтожения Мп-зависимой локализующейся в МИТОХОНДРИЯХ супероксиддисмутазы с последующим центрифугированием смеси при 13000 gfl.

В полученный раствор добавляют К2НРО4 для-высаливания примесей, осадок отделяют и осаждают из надоеадочной жидкости белки ацетоном (2V), Ацетоновый осадок растворяют в К-фосфатном буфере (рН 7,8) и диализуют в течение 15 ч. Затем проводят хроматографию при рН 7,8 на колонке, заполненной сефадексом G-75. Фракции, :содержащие супероксидцисмутазу, диализуют и разделяют с помощью ионообменной хроматографии на ДЭАЭцеллюлозе с элюцией линейным градиентом NaCl от 0-0,2 М. Активные фракции концентрируют на мембране Am Icon UM-10 до содержания 3-5 мг белка/мл. При использовании этого метода степень частоты равна 118, длительность фракционирования составляет примерно 80 ч 1. Такая многоступенчатая очистка приводит к частичной денатурации фермента, во-первых, за счет применения органических растворителей и во-вторых, из-за длительности процедуры фрактдионирования. Однако данный способ характеризуется недостаточно высокой степень чистоты целевого продукта и сложнос тью процесса выделения. Цель изобретения - повышение сте пени чистоты фермента СОД и упрощение способа его выделения. Поставленная цель достигается тем, что. согласно способу выделения Zn, Си-зависимой супероксиддисмутазы из печени крысы, заключающимися в- гомогенизировании сырья и экстрак ции фермента, удалении Мп-зависимой супероксиддисмутазы и осаждении выд ляемого фермента ацетоном с последу щей хроматографией на полисахаридно сорбенте при рН 7,8 с элюцией буфером, содержащим NaCl, удаление Мпзависимой супероксиддисмутазы осуществляют центрифугированием гомогената при 105-110000 д, ацетон для осаждениЯ in, Си-зависимой супероксиддисм тазы из полученной после высокоскоростного центрифугирования цитозольной фракции используют в объемном соотношении 1:(1,5-1,7), а хроматографию проводят на диэтилами ноэтил-сефадексе. с элюцией ступенчатым градиентом NaCl 0,05-0,1 М, п чем стадию хроматографии прово.дят дважды. Предлагаемый способ позволяет повысить степень очистки до 250 раз сократить длительность процесса выделения на 20 ч и значительно упростить сам процесс. Пример. Охлажденную печень крыс гомогенизируют при в растворе, содержащем 0,25 М сахарозы, 1 мм ЭДТА, рН 7,4, из расчета ни 1 ткани 10 мл раствора. Гомогенат центрифугируют при 105000 g в течение 60 мин. к надосадочной жидкос ти (цитозольной фракции) добавляют при перемешивании 1,5 объема охлажденного ацетона и полученный осадок отделяют центрифугированием в течение 20 мин при 1000 g. Затем осажденную ацетоном фракцию суспендируют в минимальном объеме 5 мМ фосфатного буфера, рН 7,8 и диалиэуют 5 ч против 100 объемов этого же буфера. Дёшьнейшую очистку проводят на колонке размером 400i 25 мм, заполненной ДЭАЭ-сефадексом А-50 и уравновешенной 5 мМ фосфатным буфером, рН 7,8. Белки сорбируют при пропускании через колонку 5 мм фосфатного буфера, рН 7,8, а затем элюируют, используя ступенчатый градиент хлорида натрия: первоначально промывают колонку 5 мМ фосфатным буфером, рН 7,8, содержагцим 0,05 М NaCJ, а затем этот буфер заменяют на 5 мМ фосфатный буфер, рН 7,8, содержащий 0,1 М NaCl, Фракции с максимальной активностью энзима собирают и диализуют против 5 мМ фосфатного буфера, рН 7,8 в течение 3 ч. Затем рехроматографируют их на колонке размером 150x10 гусм, заполненной ДЭАЭ-сефадексом А-50. Сорбцию и элюцию проводят при тех же условиях: энзиматически активные фракции выходят при вымыван.ии белка 0,1 М MaCl. При таком способе выделения степень чистоты фермента составляет 250, а продолжительность фракционирования около 60 ч. Конечную чистоту препарата определяют методом электрофореза в 7%-ном полиакриламидном геле (электрофоретическое разделениепроводят в трисглициновом буфере, рН 8,3, при силе тока 5 мА на один столбик геля, продолжительность процедуры 2,5 ч). Для выявления зон, содержащих активность СОД, гели окрашивают специфическими для данного фермента реактивами. В результате всем полученным белковым зонам при окрашивании амидовым черным соответствуют зоны активности СОД. Удельная активность гомогенного препарата (45t3) 000 ед/мг. В таблице приводятся сравнительные данные известного и предлагаемого способов выделения и очистки фермента СОД из цитозола печени крыс.

Известный

а)этанол

б)хлороформ

в)ацетон

ПредлагаемыйТехнико-экономическая эффективность предлагаемого способа эаклю чается в том, что он позволяет срав нительно быстро, получать фермент СОД с большей степенью, чистоты в на тинном состоянии без значительного ингибирования его активности. Способ может быть использован в промы ленных целях для получения СОД. Формула изобретения Способ выделения Zn, Cu-завнсимой супероксиддисмутазы из печени крысы, включающий гомогенизирование сырья и экстракцию фермента, удаление Мп-зависимой супероксиддисмутазы, осаждение выделяемого фермента ацетоном с последующей хроматографией на полисахаридном сорбенте Tiptr. с элюцией буфером, соПродолжение таблицы

д) ДЭАЭ

целлюлоза

а)ацетон

б)ДЭАЭсефадексА-50 держащ(;-5 fi а С I, отличающийс я xei.if что, с целью повыиенкя сгепеки чистоты целевого продукта и упрощения процесса, удаление Ипзависимой суперскскдцис /тазы осуществляют центрифугированием гомогената при 105-11.0000 д, ацетон для осаждения Zn, Си-завнскмой супероксиддисмутазы из полученной цитозольной фракции используют в объемном соотношении 1:(1,5-1,7), хроматографию проводят на диэтилa raнoэтилсефадексе с элюцией ступенчатым, градиентом NaCI от 0,05 до 0,1 М, причем хроматографию проводят дважды. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Reiss и. Gershon D. Rat Itver superoxide ;di3mu tase. Purification and age-related modifications, Fur, J. Biochem, 1976, vol. 63, 617-623.