Способ получения молокосвертывающей протеиназы @ @ @ 1-8 Советский патент 1984 года по МПК C12N9/58 C12R1/845 

ас

о Изобретение относится к ферментной промышленности и предназначено для получения монофермента кислой термоустойчивой протеиназы, обладаю щей молокосвертывающей активностью. Известен способ получения протеи назы Bacillus thuringiensis var fin tinuis, включающий осаждение проте иназ сульфатом аммония при 0,8-0,9 насыщения с последующим диализом и очисткой целевого продукта на сефадексах Cl1. Однако этот способ характеризует ся недостаточной чистотой фермента, большими примесями пигментов, большой длительностью цикла из-за приме нения нескольких хроматографических методов. Наиболее близким к изобретению по технической сзпцности является сп соб получения молокосвертывающей протеиназы Rhizopus pygmaues p-i-2 предусматривающий экстракцию культуры продуцента водой и осаждение фермента органическими растворителями. В результате получают молокосвертьша щую протеиназу с активностью 500000 ед/г .21. . Однако способ характеризуется не достаточно высокой удельной активнос тью получаемого фермента. Целью изобретения является повыше ние удельной активности целевого продукта. Указанная цель достигается тем, что согласно способу получения молокосвертьшающей протеиназы Rhizopus pygmaues предусматривающему экстракцию культуры продуцента водой и осаждение фермента, осуществляют фракционированное осаждение фермента из экстракта с помощью сульфата аммония, взятого в количестве сначала 0,2-0,3, а затем 0,60-0,85 от степени насьщения, полученный ферментный осадок растворяют в воде и подвергают термообработке при 55-60 С и рН 3,5-4,0 в присутствии ионов Са в количестве 0,20-0,25 г-а./л с последующим диализом, фракционированием на сефадексе G-100 и концентрированием ацетоном в соотношении 1:2. Выход молокосвертьшающего фермента по белку составляет 1,98-2,00%, удельная активность на единицу белка, в пределах 760-800 ед/мг, степень очистки 65-90 раз. 01J Способ получения молокоснертывающей протеиназы заключается в еле- . дующем Воздушно-сухую поверкностную культуру микромицета Rhizopus pygmaues р , известного как активный проду|-f 9 цент кислых протеиназ с молокосвертывающим эффектом, настаивают с дисводой в соотношении тиллированнои 1:10 при 30°С в течейие 1,0-1,5 ч .для экстракции ферментов. Ферментативную вытяжку с содержанием белка 54-56 мг/мл отделяют от нерастворившегося осадка путем фильтрования через складчатый фильтр. Полученную вытяжку ферментов охлаждают до 4-5 С и вносят сульфат аммония в количество 0,2-0,3 насьш1ения, выдерживают при комнатной температуре в течение 20 мин и отделяют неактивный осадок балластных белков центрифугированием при 4,0-4,5 тыс. об/мин. Указанные пределы концентрации добавления сульфата аммония установлены экспериментально и обеспечивают максимальное удаление неактивных белков. При снижении концентрации менее 0,2 насьш1ения не наб.шодается эффекта полного удаления балласта. При увеличении концентрации свьш1е 0,3 наблюдаются значительные потери продукта. В центрифугат снова вносят сульфат аммония в количестве 0,60-0,65 насыщения (до конечной концентрации 0,80-0,85 насыщения). Такие пределы (Концентрирующего агента установлены для данного ферментного комплекса экспериментально.При снижении концент- рации ниже этих пределов значительно уменьшается выход молокосвертьгоающей протеиназы. При повышении концентрации вьппе этих пределов выход целевого продукта не увеличивается, а степень очистки уменьшается, видимо, за счет присутствия большого количества осадителя в активном осадке. Смесь снова вьщерживают в течение 20 мин дпя формирования осадка активных ферментов и отделяют его центрифугированием при 4,0-5,0 тыс. об/мин. Как показали результаты фракционирования полученного препарата методом дискового электрофореза и ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе, в его состав входят 6 белковых фракций, одна из которых обладает молокосвертывающей активностью и интенсивно гидролизует белки в кислой зоне рН. Для быстрой инактивации и удаления 3 сопутствующих ферментов иолучеиньп препарат растворяют в небольшом коли честве днстнллироваипой воды, доводят рН раствора до .3,5-4,0 с помощью НС1, нагревают смесь до 55-60 С и вносят ионы в виде соли CaC в количестве 0,20-0,25 г.-а,/л. При этом степень очистки возрастает в 2-3 раза. Экспериментально ус1;ановле но, что для эффекта полной инактивации всех ферментов, за исключением протеиназ, необходимо обязательное сочетание всех трех факторов физикохимического воздействия. Снижение концентрации ионов указанных пределов приводит к снижению степени очистки и уровня инактивации Увеличение ее не влияет на выход протеолитического комплекса, а степень очистки снижается из-за загряз.нения раствора дополнительно вводимой солью Анализ активности ферментов по- казал, что после внесения ионов Са и повышения температуры до 50°С про теолитическая активность сохранялась на 100% при полной инактивации липазы и других ферментов. Однако в комплексе сохранялась активная глюкоами лаза. Для не инактивации необходимо поддерживать низкий уровень рН в пре делах 3,5-4,0. При этом наблюдается полная инактивация глюкоамилазы при сохранении 90-93% активности протеолитических ферментов. При увеличении температуры выше указанного предела происходит интенсивная денатурация интересующего фермента, при температуре ниже указанного предела не наблюдается эффекта полной инактивации глюкоамилазы. Аналогичное явление наблюдается и при изменении интервала рН. Неактивньй осадок ферментов отде1ляют центрифугированием при 6,7 тыс об/мин. Анализ активности центрифугата методом дискового электрофореза показал, что в нем сохраняются две белковые фракции, которые обе активно гидролизуют субстраты в кислой зоне рН, одна из них обладает молок свертьшающей активностью. Разделение протеолитических фракций производят следующим образом. Центрифугат обессоливают проточ ным диализом в течение су.ток при . Для фракционирования протеиназ используют метод разделения по признаку молекулярного веса на сефа 014 дексе G-100. Элюирование ведут на колонке размером 1 35 см дистиллированной водой. В результате получают две кислые монопротеиназы, одна из которых (по количественному содержанию в 9 раз большая) обладает молокосвертыванием, а также высокими термо- и кислотбустойчивостью. На последнем этапе очистки проводят концентрирование целевого фермента ацетоном в соотношении 1:2. Необходимость разделения протеолитических фракций вызвана тем, что примеси сопутствующих ферментов и, особенно протеолитических, вызьюают неспецифический протеолиз субстрата; кроме того, для глубокого исследования . физико-химических свойств и проведения индентификации с эталоном сравнения необходимо получение монофермента. Пример 1. Юг воздушносухой культуры Rh.pygmaues p-g настаивают в 100 мл дистиллированной воды в течение 1,5ч при 30°С. Смесь фильтруют через складчатьй бумажный фильтр.Фильтрат охлаждают до 4°G и вносят 0,2 насыщения сульфата аммония . Неактивньй осадок балластных белков удалк)т центрифугированием при 4,5 тыс. об/мин. В центрифугат добавляют 0,6 насьщения сульфата аммония (конечное содержание 0,8 насыщения) . Активньй осадок ферментов отделяют центрифугированием при 4,5 тыс. об/мин и растворяют в 5 мл дистиллированной воды. Затем вносят ионы Са в количестве 0,20 г.-а./л (в виде соли CaCI) доводят рН смеси до 4,0 с помощью НС1, нагревают до 60 С и вьщерживают в течение 15 мин. Неактивньй осадок отделяют центрифугированием при 6 тыс. об/мин. Центрифугат обессоливают по известному методу диализа в течение суток при 5°С. Обессоленный раствор собирают количественно и фракционируют объемно по 5 мл на сефалексе G-100. Фракции, обладающие молокосвертьюающей активностью, объединяют и концентрируют ацетоном при соотношении 1:2. Общие данные по результатам получения молокосвертывающей протеиназы представлены в табл. 1. Пример 2. Ферментную вытяжку воздушно-сухой культуры Rh. pygmaues р,8 готовят аналогично примеру 1. В фильтрат вносят 0,3 насыщения сульфата аммония, отделяют неак5

тивиый осадок центрифугированием при 4,5 тыс. об/мии, В центрифугат добавляют 0,55 насыщения сульфата аммония и отделяют активный осадок аналогично призеру 1. Затем его растворяют в 5 мл дистиллированной воды, вносят 0,05 м (в виде соли CaCl2) доводят рН среды до 3,5 с помощью соляной кислоты, нагревают смесь до 55°С и выдерживают 20 мин. Отделение неактивного осадка , обессоливание, фракционирование и концентрирование молокосвертывающей протеиназы производят так же, как и в примере 1. Данные показаны в табл. 2.

Ферментативную активность определяют на натуральном обезжиренном молоке при рН 6,5 и 35 С. При внесении фермента регистрируют время начала образования молочного сгустк визуально.

. За единицу активности принимают количество фермента, обеспечивающее

108016

началообразования сгустка через

АО минпосле его внесения в молоко.

Расчетведут по формуле

5 2 00-50

-f V с где 50 - объем молока, взятый для

анализа, мл;

с - концентраций раствора фер0 мента. Т/100 мл;

V - объем исследуемого раствора фермента, мл{

2400 - сравнительное время образования сгустка, с. 15

Технико-экономическая эффективность изобретения состоит в том, что препарат молокосвертьюающей протеиназы обладает активностью 710000 20 750000 ед/г, что более, чем в 7 раз активнее эталона сычужного фермента, применяемого в сыроделии, молокосвер/тьюающая активность которого 100 000 ед/г.

Таблица 1

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОЛОКОСВЕРТЫВАЮЩЕЙ ПРОТЕИНАЗЫ RHIZOFUS PYGMAUES ff-s , предусматрившощий экстракцию культуры продуцента водой и осаждеS я 3 Щ JiJ ние фермента, отличающийс я тем, что, с целью повышения удельной активности целевого продукта, осуществляют фракционированное осаждение фермента из экстракта с помощью сульфата аммония, взятого в количестве сначала 0,2-0,3, а затем 0,60-0,85 от степени насыщения, получег ный ферментньй осадок растворяют в воде и подвергают термообработке при 55-60с и рН 3,5-4,0 в присутствии ионов в количестве 0,20-0,25 г.-а./л с последующим диализом, фракционированием на сефадексе G-100 и концентрированием ацетоном в соотношении 1:2. с б

54,00 666,6 44,40 2666,6 20,00 2500,6

9,80 1500,0

Диализ

1,60 400,0

0,96 750,0

12,34 0,00 100 100

60,06 Д,88 14,8 70,0

125,03 10,13

25,8 63,0 153,06 12,40 20,23 59,8

250,0 20,25 9,89 47,8

781,2565,841,9829,64 Исходная ферментная вытяжка 54,00 Фракционирование сульфатом аммония 2700,0 61,00 Инактивация и удаление сопутст2502,5 122,6 вующих ферментов 20,5 1500,0 150,6 Диализ10,3 Фракционирование на сефадексе G-1001,65 Концентрирование ацетонст 1,04

Таблица 2 0,00 100,00 100,00 10,05 26,8 64,0 12,52 21,23 59,9