СТИМУЛЯТОР РОСТА ЛАКТОБАЦИЛЛ, КИШЕЧНЫХ ПАЛОЧЕК, БИФИДОБАКТЕРИЙ Российский патент 1996 года по МПК C12N1/38 C12N1/20 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано в промышленной микробиологии для получения биомассы бактерий.

Резидентная микрофлора кишечника человека, тесно связанная со слизистой оболочкой, принимает участие в колонизационной резистентности, препятствуя внедрению условнопатогенных и патогенных бактерий. Кроме того, она выполняет целый ряд других физиологических функций пищеварительную, иммуногенную, дезинтоксикационную и др. Одними из важных представителей резидентной микрофлоры являются бифидобактерии, лактобациллы, кишечные палочки. Их стимуляция может быть использована при производстве препаратов-эубиотиков, в основе которых применяются штаммы из представителей нормальной микрофлоры.

Известные препараты, стимулирующие рост лактобацилл лактулоза, 6-галактозид-фруктоза-левулоза (1,2).

Описан ряд бифидогенных факторов, к которым относятся различные олигосахариды-фруктоолигосахариды, изомальтоолигосахарид, трансгалактозилолигосахарид (3,4,5). Все они избирательно стимулируют бифидобактерии.

Недостатком этих препаратов является то, что каждый из них может стимулировать только один из наиболее важных представителей резидентной микрофлоры.

Известен препарат, состоящий из фруктоолигосахарида, изомальтоолигосахарида и пектина тыквы (6). Он добавляется в плотную питательную среду для культивирования бифидобактерий в концентрациях 0,1, 0,5 и 1% а также назначается в виде порошков в дозе 2 г в течение 7 дней и гранулах по 4 г в течение 7 дней. Однако и этот препарат стимулирует преимущественно бифидобактерии, причем в довольно высоких дозах.

Целью настоящего изобретения является разработка способа усиления роста нескольких представителей резидентной микрофлоры, относящихся к различным родам микроорганизмов.

Поставленная цель достигается использованием химического препарата памба ингибитора протеолитических ферментов, применяющегося для лечения панкреатитов и как кровоостанавливающее средство (7,8). Синонимы памба - парааминометилбензойная кислота, амбен. Блокируя активаторы плазминогена и угнетая действие плазмина, памба оказывает специфическое кровоостанавливающее действие при кровотечениях, связанных с повышением фибринолизина. Установлена способность памба ингибировать протеолитическую активность трипсина и хемотрипсина, процесс активации трипсиногена энтерокиназой. Отмечена наивысшая активность препарата в отношении угнетения процессов активации плазминогена и протеолитического действия плазмина, пепсина, карбоксипептидазы.

Пример 1.

Пример осуществления способа стимуляции роста штаммов Escherichia coli M17, E.coli K12 H_b 101.

Для определения влияния памба на различные штаммы кишечной палочки препарат вносили перед началом культивирования в жидкую питательную среду (бульон Хоттингера) в 2-х различных концентрациях 0,02 и 0,2 мг/мл. Микробную взвесь инокулировали в объеме 10% от общего объема среды с конечной концентрацией 1•10⁷ микробных клеток в 1 мл. В контрольную пробирку препарат не вносили. Культивирование осуществляли в аэробных условиях при 37^oC. Концентрацию микробных клеток определяли через 3, 5 и 7 ч. путем высева на плотную питательную среду (мясо-пептонный агар) серийных разведений. Прирост биомассы по сравнению с контролем выражали в (стимуляция или ее отсутствие).

Результаты представлены в табл.1 (через 5 ч культивирования).

На дозу препарата 0,02 мг/мл через 5 ч культивирования отмечена наибольшая стимуляция: штамма М17 на 22,2% и штамма Hb101 на 34,2% Кроме того, эта концентрация памба способствовала более быстрому выходу штамма М17 на стационарную фазу роста по сравнению с контролем (фиг.1).

Пример 2.

Для определения влияния памба на рост лактобацилл использовали штаммы L. fermentum 2953, L.plantarum 37, применив автоматическую систему "Avantage". К культурам, выращенным на среде МРС-4 и доведенным до конечной концентрации 1•10⁸ микробных клеток/мл, добавляли памба в концентрации 1 мг/мл и культивировали в анаэробных условиях. О скорости роста микробов судили по оптической плотности, сравнивая опытные и контрольные (без памба) культуры.

Как видно из фиг.2 и 3, памба в дозе 1 мг/мл стимулировала рост L.fermentum 2953 на 42,9% через 10,5 ч культивирования, а L.plantarum 37 через этот же срок на 28,6%
Пример 3.

Для выявления ростстимулирующей активности памба на бифидобактерии использовали штамм B.bifidum ЛБА-3. Смытую с плотной питательной среды Блаурокка взвесь доводили до концентрации 1•10⁸ микробных клеток/мл, добавляли памба в концентрации 1 мг/мл и культивировали в жидкой питательной среде в анаэробных условиях в системе "Avantage".

Как видно из фиг. 4, через 18 ч культивирования отмечается стимуляция штамма B.bifidum ЛБА-3 на 40,3% при концентрации препарата 1 мг/мл.

Пример 4.

Исследования были проведены на группе из 15 добровольцев (мужчин и женщин) в возрасте от 25 до 35 лет без клинических признаков нарушения пищеварительной системы и без приема антибиотиков в анамнезе. Добровольцы были разделены на 2 группы. 1 группа из 10 человек ("опытная") получала памба в порошкообразной форме в суточной дозе 0,75 г в течение 7 дней. II группа из 5 человек ("контрольная") принимала плацебо-порошок Sacchari albi. В течение 7 дней в той же дозировке. Количественный учет бифидобактерий, лактобацилл, кишечных палочек в фекалиях осуществляли до назначения препаратов и по окончании курса.

В табл. 2 и 3 приведены данные микробиологического исследования у добровольцев I и II групп.

Как видно из таблиц, после приема препарата произошло увеличение количества всех 3-х исследованных представителей резидентной микрофлоры кишечника. Наиболее значительно выросло содержание лактобацилл на 2,4 lg КОЕ/г и эшерихии на 1,2 lg КОЕ/г. Во II группе ("контрольной") значимых различий в уровне бифидобактерий, лактобацилл и кишечных палочек до и после приема плацебо не отмечено.

Пример 5.

В табл. 4 приведены сравнительные данные по исследованию количественного уровня бифидобактерий, лактобацилл, кишечных палочек в микрофлоре фекалий добровольцев, принимавших памба и комбинированный препарат, основными компонентами которого являются фруктоолигосахарид, изомальтосахарид, пептин тыквы (6). Комбинированный препарат назначали в порошкообразной форме в суточной дозе 2 г в течение 7 дней.

У добровольцев, получавших комбинированный препарат, наблюдалось десятикратное увеличение количества бифидобактерий в фекалиях; в то же время содержание лактобацилл и колиформных бактерий практически не менялось. Через 7 дней после приема памба среднее количество бифидобактерий нарастало в 26 раз, лактобацилл в 230 раз и эшерихий в 15 раз по сравнению с исходным числом этих представителей резидентной микрофлоры у добровольцев.

Литература
1. Amer. J. Clin. Nutr. 1970, V. 23, N 12, P.1588-1594.

2. Применение препарата нормазе в педиатрии. М. 1992, с. 1-9.

3. Патент Японии N J 86046479, 1986.

4. Европейский патент ЕПВ (EP) N 0242459, 1986.

5. Bifidobacteria and Microflora. 1983, V. 2, P. 17-24.

6. Патент EP 0295794 А1, 1988.

7. Машковский М.Д. Лекарственные средства. Кишинев, 1984, ч. 2, с. 65.

8. Пелькис П.С. Шевченко Л.И. Лозинский М.О. и др. Синтетические ингибиторы фибринолизина. Киев: Наукова думка, 1986. ТТТ1 ТТТ2 ТТТ3 ЫЫЫ2

Использование: биотехнология и медицинская микробиология, может быть использовано для получения биомассы бактерий. Сущность изобретения: для стимуляции роста бифидобактерий, лактобацилл, кишечных палочек используют ингибитор протеолитических ферментов-парааминометилбензойной кислоты (памба) в дозе 0,02-1 мг/мл ин витро и в суточной дозе 0,75 г в течение 7 дней ин виво. 4 табл., 4 ил.

Применение парааминометилбензойной кислоты в качестве стимулятора роста лактобацилл, кишечных палочек, бифидобактерий.