Штамм бактерий ВRеVIвастеRIUм FLаVUм продуцент L - серина Советский патент 1991 года по МПК C12N1/20 C12P13/06 C12N1/20 C12R1/13 

(46) 07,12.91. Бюл. № 45 1

(21)4094083/13

(22)18,07.86

(7) Всесоюзный иаучно-исследователь- екий институт генетики и селекции промьшшенных -микроорганизмов (72) Э.А. Буриков, Н,И. Щданова, В.Г« Ясиновский, Л.Ф. Козырева, А.К. Соколов, Н.В. Алафаева,

А.Ф. цева (53) (56)

Юолни, Н.Г, Демина и Н.Ф. Румян663.15(088.8)

Патент Англии № 1226786, кп. С 2 Р 13/06, 1971.

Патент США 3843441, 14л. С 12 Р 13/06, 1974.

(54)ШТАММ БАКТЕРИЙ BREVIBACTERIUM FLAVUM-ПРОДУЦЕНТ L-СЕРИНА (57) Изобретение относится к микробиологической промьшшенности и касается нового штамма - продуцента аминокислоты L-серина, который может быть использован как пишевая добавка, компонент питательных смесей леди- цинского назначения, а также в фарма) цевтической и косметической промьшлен- HocTti. Цель изобрете шя - огтамм бактерий - продуцент L-серина,обладающий способностью к более высокому накопле- Kvao аминокислоты в культуральной жидкости. Штамм Brevibacterium flawun ВКПМ В-3559 получен путем селекции с использованием К-метил-Н-нитро-Н- иитрЪэогуанидина, а в качестве селек-. тивных факторов 1,5 мг/мл 8-азаадени- на, 15 1Г/мл « -метий-серинаи 20МГ/МП д 0-метилсерина. Штамм после 72 ч ферментации способен накапливать в культуральной жидкости до 15 г/л L-серн- на. 1 табл.

«

СП

Изобретение отиоснтсп к микробио логической промышленности и касается нового штамма - продуцента амииокис лоты L-сернпа, который может быть нспользопап как пищевая добавка, компонент питательных смесей медицине- кого и азиаченпя, .а также в фармацев тнческсй и косметической ироньштенHOCTIS,

Цель изобретепия - бактс рий - продуцент L--cepHiia, обладающий способностьн} к более накоплению аминокислоты в культуральной жидкости.

Штамм получен из штамма дикого типа Brevibacterium flavura АТСС 14067 в результате ступенчатой селекции е использованием- в качестве t-гутагенно

15 Рост на МПА -ши агаре Хоттингара; через 3-5 суток роста прк 30°С образуют колонии диаметром f-iM,кремовые,, поверхность гладкая, юрма выпуклая, край ровный, структура одно25

го фактора к-мет-.ш-М-нитро-Ы-нитрозо- 20 родная. При iiocese штрихом через 3-е

гуанидина (-НГ), а в качестве селек

тивных факторов - аналогов пуринов .,

и серина: 8-азааденипа, й-метип-се-

рина и 0-матнлсернна в концентрациях

1,5 мг/мл, 15 мг/мл и 20 мг/мл соот- ветстаенно. На четвертом этапе селекции клетки родительского штамма,, обработан ша НГ, выселнь на минимальную среду с повышенным содержанием . фосфата (KHjPO), содержащую аланин

н качестве источника углерода. На.

этом этапе вьиепен штамм 15604 и и

дальнейшем его естестренпый вариант

1560А-15 (схема селекции).

Схема селекции ггродуцентов

рина;

30

35

суток рост умеранный край гладкий, поверкность матовая плотная,, и.зет желто 2;ремовый. При посеве уколом рост в глубине агара слабый, яа поверхности умеренный,

Рост на минеральной среде с глюкозой биотиног и через 3-е сугок пря 30 С обрпэушгся округльчв KoiiO i5-iH диаметром 2 ;-ff-i, край ровный структура однородная, консистенция гестообра .-uan,, полерк-- ность ггадкйл, цвет ло.пзний желто-- креповый. Рост штриха через 2-е суток умкркм Пз1Й5 поверхносг:;- матовая, желто-кремоного цвета,

Физнолого-биохими ескне признаки.

лзб -

НГ

fri метнл серин j 15 мг/мл

-9606

НГ О-метил- серин,

20 МГ/МПг

П351

...ЛЕ™. а.паннн в качестве нс- точнкка уг- лерода. по вышенн ое содержаниефосфата

...-J ISSOA

- без мутагена

15604-15.

Щтамм хранят и столбиках полужидкого (0,7%) агара под слоем назепн- новогл масла nin; температуре 2-4 С или в лиоф1шьном состоянии в запаян- ных ампулах при комнатной температуре .

Штагда В. flavinTi генетика 1560 -15 депонирован Всесоюзной коллекцией проьтышленньк микроорган-измов под номером СКГШ В-3559 и имеет следующую культура л ь 0-морфологическую и физиолого-биохимическую характеристику .

Культурально-корфологические прк-знаки.

Морфология клеток : гслеткк оваль ные раамером 1,0-1,8 х 0,5-0,,8 мк, неподв1ет.11ые, грамположнтельные, спор не образуют.

Рост на МПА -ши агаре Хоттингара; через 3-5 суток роста прк 30°С образуют колонии диаметром f-iM,кремовые,, поверхность гладкая, юрма выпуклая, край ровный, структура однородная. При iiocese штрихом через 3-е

5

0

5

0

0

. при

суток рост умеранный край гладкий, поверкность матовая плотная,, и.зет желто 2;ремовый. При посеве уколом рост в глубине агара слабый, яа поверхности умеренный,

Рост на минеральной среде с глюкозой биотиног и через 3-е сугок пря 30 С обрпэушгся округльчв KoiiO i5-iH диаметром 2 ;-ff-i, край ровный структура однородная, консистенция гестообра .-uan,, полерк-- ность ггадкйл, цвет ло.пзний желто-- креповый. Рост штриха через 2-е суток умкркм Пз1Й5 поверхносг:;- матовая, желто-кремоного цвета,

Физнолого-биохими ескне признаки.

Отношение к источ1;икам углерода: хорошо растет на глюкозеs мальтозе, сахарозе, рамнозе, фруктозе, ; 5акките5 сорбите; не растет па арабинозе, лактозе .

Отношение к КСТОЧНИКБМ азота: ycвaивae азот акц-.спкГ ньт с полей м Ш ЧРЕины, гйту не ра; ;к1теает.

Рост в жидкой среда с глюкозой в присутствии 8-аззаден:.ша (см, таблицу) ,

Аэроб

Растет npv: тетжературе 37 С и ни;9:е

Оптимальная гемпеоатура роста 28-30 С,

растет при рИ в д/лап л оне ч,

Практткеское нопользовапп-в лагаемого штаклз-продуцента 1,серина осуществляют следук|;дям обраг-юм.

Кзшьтуру В- flavutn BKIIfi, B-355S выратщшают в тече.ииз 24-36 ч

на «гариэова} нои преде

3I

тингера, затем высеивают в предварительно простерилизованние вместе с посевной средой колбы для выращивани посевного материала. После засева культуры колбы устанавливают на круговую качалку и культивируют при 220 240 об/мин при 28-30°С.

Готовьй посевной материал вносят в колбы с ферментационной средой, со }1ержащей источники углерода (сахар иЛ1 сахарозу), азота, ростовых факторов, минеральные соли и витамины (биотин, дестиобиотин, тиамин).

Бее компоненты среды стерилизуют под давлением, рН среды доводят до заданного уровня до и после стерилизации.

Ферментацию проводят на круговой качалке (Z20-2AO об/мин) при 28-32 С

Содержание L-серина в культураль- ной жидкости определяют методом тонкслойной хрс матогряфии на пластинах Silufol в системе растворителей: ацетон, изопроланол, 25% аммиак, вод (,2:0,8) li методом бумажной хромато графии в системе; бутанол, уксусная кислота, вода (4:1:1).

После отделения биомассы нативнын раствор пропускают через сульфокати онит, на котором наряду с серином сорбируются и сопутствующие аминокислоты, которые при последующем элго ировании аммиачным раствором также переходят в элюат.

С целью отделения конечного про,- дукта от глутаминовой кислоты фракции злюата, содержащие серин и сопутствующие аминокислоты, пропускают через колонку с анионитом ЭДЭ-10П в ацетатной форме (предварительно обработанный уксусной кислотой).

Достигаемый при этом положитель- , ный эффект обуслоЕшен селективной сорбцией глутаминовой кислоты на анионите ЭДЭ-10П и ацетатной форме. Известные в практике ионные формы анионита, применяемые для разделения нейтральных и кислых аминокислот, не позволяют решить поставленную задачу отделения серина от глутаминовой кислоты, так как анионит в ОН-форме сорбирует все находящиеся в растворе аминокислоты, а анионит в СI-форме или с анионами друт их минеральньтх кис лот их вообще не сорбирует.

Для отделения серина от нейтраль- аминокислот, Т.ЧКИХ как аланин.

JQ

J5

20

25

ЗО 35

Q

45

0

5

глицин, применяется I cpeкpиcT nлl1:. l- ция из 20-30%-ного растрора этанола ,

Выход кристаллического сермтта и ) ферментационного раствора составляет 30-65%, чистота конечного продукта не менее 991,

Пример 1. Культуру штамма В, flavum ВКГШ В 3559 выращивают 24 ч на агаризованной среде Хоттин- гера, затем петлей высевают в колбы е 1Костью 250 мл, содержащие 15-30 мл посевной среды. В качестве посевной среды используют бульон Хоттингера, содержащий 0,3% сахарозы.

После засева культуры колбы устанавливают на круговую качалку и ры- рашивают посевной материал при 220 240 об/мин в течение 24 ч при . Готовый посетзной материал в количестве 10% (по объему) вносят в колбы емкостью 250 мл, содержащие 15 мл ферментационной среды следующего состава, г/л: сахароза - 120; (NH)SO - 25; КНеРО - 0,4; - 0,4; мел - 35,0; кукурузный экстракт - 4,0; биотин или дестиобиотин - 150 мкг/л; тиамин - 100 мкг/л; водопроводная вода - остальное. Все компоненты среды стерилизуют вместе при 0,5 атм в течение 30 мин. Ферментацию проводят на указанной вьше качалке при 28°С. После 96 ч культивирования в культуральной жидкости образуется 14,5 г/л L-серина, а также ала- нип, глицин и глутаминовая кислота. Выделе1П-1е кристаллического L-серина проводят следующим образом: 380 МП культуральной жидкости с концентрацией серина 14,5 г/л, содержащей также 6,3 г/л глутаминовой кислоты, 2,6 г/л аланина и 1 г/л глицина, после отделения биомассы пропускают через колонку с сульфокатионитом . КУ-2-8 в Н-форме. Сорбированные аминокислоты после промывки катионита водой элюируют 2н раствором аммиака. Затем элюат пропускают через колонку с анионитом ЭДЭ-10П в ацетатной форме для отделения тлутаминовой кислоты. Раствор, пропущенный через анионит, выпаривают под вакуумом. К упа- ренному раствору добавляют при перемешивании 1 объем этанола. Выпавшие кристаллы отделяют фильтрованием и промывают спиртом. Затем проводят перекристаллизацию из расттзора полученных кристаллов в 24%-ном растворе этанола. В результате получают 3,6 г

кристгитпчпског о пеществг с содержа- ием серииа не метгее. 99,0%.

П р и м ер 2. Посевной материал культуры шташ- а В. flavuui выращипа от Кик D ггрлмкрц I;, но ВКПМ В-3559 на посевной среде следующего состава, г/л: сахароза - 20,0; ( 7, кукуруз шй экстракт - 30,0; HgSO,j| х X 7НО-- 3,0; МИЛ - 5;.0; дестибнотии 50 ь;кг/л; .водопроводная яода - ос- тпльпое. pii сред ь до стерилизации ,пспод 7т раствором NaOll до 8.,0-0,2. Бее К(3мпоие1 ты среды стериализуют «мосте при 0,8 Rm г- тегченна 30 мни. ГотоЕыГг посенг{ой материал вносят в кол5-р1 1 ствс 0/1 (по объеь у) в колбы снкость о 750 tu 5 содержапше 20 кл фермк 1тац1 011 Шй среды следующего со

2288

дуюш,его состава

г/л: сахар 00;

кукурузный экстракт 5; (N11)504. 13| 0,5; ligSO 0,5; тиамин i,5. дестиобиотии 3, пеногаснтель 1; мел 30J вода остальное,

рН срсгды перед дойайле 1нем мела доподят NaOH до 7,6-7,8. Ферментацию проводят п фермелгтере с рабочим об-ье10 мои л. Реж1Ш ферментации; аэрирование культуральной жидкости Of5.sj/мин при постолином персие1, {твани-и 800 об/г.ин и температуре 30 32 С. рН статкрова- SSHH к первые 40 ч культивирования

J5 па уровне 6,5-7jO осуществляют путем подачи в культуральиую жидкость подпитки п видя смеся сахара ц аммиач- Юй воды ггри коице 5трацш1 Е смеси 420 г/л и массовом соотношении

ставй, г/nl сахар-сырец кубичский им-20 сахар;азот - ., Прь- этом потрейля1Юрт)1ЫЙ - 130J ( 30 30sO; KIljPO - 0,51 MsSD -7HjO - 0,5; кукурузный экстракт - 5jO; мел - 4,05 дестиобиотии - 200 мкг/л; тиамип -. 100 нкг/л; иодопросрдняя вода - ос- 25 талыгое.

Dee KO№ Oiis;i r ji среды с терилиэуют кмЕСта при 0,5 атм в течение 30 мин. Фе D ip тт Vit o ;гроводят isa качалке пр:- :10 , ;. ч: в примере 1. После 72 ч в кульууральиой жидкости накапливается 1 5 5-0 с ерика , ,

Бищелепкп кристаллического L-серн- на гфонодят,, как j-s в примере 1 из 380 м культуральной жи/ах ости с центрацие1г серина 5,0 г/л, содержащей такжр 12 f/.JT 1 лутамииозой кислоты, 5 J, 3 г/л аланипа и 1 г/л глицина. В ре- г ультате получают 2,8 г кристалличес30

35

ется т-ш поднитки. После ДО ч фepмe Iтaди ; подлитку отключают и далее р1 -статирование на уровне 5,0- 6,5 осуществляют за счет имеющегося в среде мела. Фермента закакч;ша- ют через 73 ч лосле тасева аппарата, когда коицентраиик сахара в культу- ральлой снижается до нуля, . Концентрация L-сйркна в культураль- ной Ж1ЩКОСТИ достигает 4,5 г/л.

Выделение Ъ серина нрозодпт из 380 f-U7 культур:и;ьной ;;;вдкости с концентрацией серии . 4,5 г/л, содержащей также {0,5 г/л глутаминовой кислоты, 8 г/л a.v fi niaa и S г/л глицина. Выделение серинз до стадии перекрис- таллизац:п прово;,ЯТ5 как описано в примере 1. Перекристаллизацию серина проводят из 30%--ного раствора этанола. Б результате получает 1,7 г кристаллов с содержанием L-серина ке менее 99%.

ьсого пещастяа мрпеи 99,0%.

:одержаииеь- н

8-3539

13 npUMi

нроду- , цыращи ре S .

П р « м е iisirra И-. i iavs an вают v.a кослках; Затнм суспензию клеток, смытых с агйра, виоспт в колбы емт хОстью 750м; с 60 мл жидкой среды следующего со-. гтак.. г/л; сахар 30: кукурузньй з :стрш т 2П; (Nlb)SO. 7; Ог4; ligSO,: 71120 0,4; дестчобиотин 5, ; тиамн 5,0-10 ; мел 5; вода остальное.

Поссй1-;уго среду перед добавлением мала одЕслачинаютНаОИ до рИ /,6-7,8.

Посевном материал выращивают иа круго.. ;й. качалке при 28-3 0 С в таче- Пие 25 30 м. Г(5тоБЬ Й пэсенной мате- риа;т в количес тпе 8-10% (по объес-гу) inioc iT в ферментационную среду еле

5

0

5

0

э

0

ется т-ш поднитки. После ДО ч фepмe Iтaди ; подлитку отключают и далее р1 -статирование на уровне 5,0- 6,5 осуществляют за счет имеющегося в среде мела. Фермента закакч;ша- ют через 73 ч лосле тасева аппарата, когда коицентраиик сахара в культу- ральлой снижается до нуля, . Концентрация L-сйркна в культураль- ной Ж1ЩКОСТИ достигает 4,5 г/л.

Выделение Ъ серина нрозодпт из 380 f-U7 культур:и;ьной ;;;вдкости с концентрацией серии . 4,5 г/л, содержащей также {0,5 г/л глутаминовой кислоты, 8 г/л a.v fi niaa и S г/л глицина. Выделение серинз до стадии перекрис- таллизац:п прово;,ЯТ5 как описано в примере 1. Перекристаллизацию серина проводят из 30%--ного раствора этанола. Б результате получает 1,7 г кристаллов с содержанием L-серина ке менее 99%.

П р и м е р А. Посевной мзтгриап готовят, как в примере ., и вносят в ферментационную среду следующего состава, г/л г сахар 60; кукурузный экстракт 5; С1 Ш)80 10; КК,,Р04 0,5; HgSO -7K20 0,5; тиамин ; дсстиобиотин 3, пеногаситель 3; вода остсльиое.

рН среды доводят с помощью КаОН ,до 7,6-7,8.

Ферментадию проводят в ферментере с рабочим объемом 0,5 л при следующем режиме: аэрирование культураль- пой жидкости 0,5 л/мин при постоян- . иом перемешивании 900 об/мин к темпе ратуре 30-32 С. рН-статирование з-пер вые 40 ч культивировагщя на уровне

б,,О ос;лцестзляют путем подачи подпитки в культуральную жядкость в пиде смеси сахара и аъадиачной воды при концентрации сахара в снеси 455 г/п и массовом соотношении сахар: 5азот 28:1. При этом потребляется 540-350 мл подпитки. Далее производят смену сахароаммиачной подпитки на раствор КаОН, который подают автомат1 чески в аппарат при том же уроэке рН-стагировапил до конца ферментации (35-40 мл).

Ферментацию заканчивают через 72 ч после засева аппарата, когда концентрация сахара а культуральной жкд; кости с -ипг.ается до куля. Накопление 1-,с.ерйма в купьтуральной жидкости 50,2 г/л. ..

Выделение 7..серина проводят из 30Q мл культуральной жидкости с кон

центрацией сертша 10,2 г/л, содержащей также 10 г/п глутямиковрй кислоты и 6 г/л аланила. Выделение серина до стадии пергкрнстгшлизации проводят как описано в примере 1 , У - рекристзй лизацию проводят из 20% пото водного раствора этанола. Б результате получают 1,2 г .криста.япоц с содаижаинем L-серина не менее 95%,

Получентгиш pt ayjibTav - п&идатель- ствуют о том, чтс с-помощью В. flsvuffl ВKIM В 3559 можно получать болеэ высокие уровни содерг7;ания 1,-се- рт нг -j культуральной жидкости, а таклй npe:-(apa .vbi а, шокйслоты высокой степени .

Ф о р к у л I s 3. о б р е т S и и я

Шта№ бактерий Вг€;Ч ;;,Ья 1;ег1гт1 fla- r-ura ВКШ-5, S--3559 - продуце Г: ь-серика.