Способ определения аргинина Советский патент 1988 года по МПК G01N21/78 

со ;о

оо

Изобретение относится к биохимичеким методам исследования и может быт использовано при определении аргинина в смеси аминокислот, например в - лекарственной смеси Альвеэин или искусственных питательных средах.

Цель изобретения - повышение спе- цифичности определения и упрощение способа.

Способ осуществляется следующим образом.

Реактивы: 0,05%-ный водный раствор бромтимолового синего с рН 4,5 (для доведения значения рН до 4,5 используют 0,01 М НС1); хлороформ; 0,1 М раствор гидроксида натрия.

Смесь аминокислот Альвезин доводят по рН-метру до рН 7,0 (исполь- зуют 0,01 М раствор НС1 или 0,01 М раствор гидроксида натрия). Отбирают пробы с примерным содержанием аргинина 0,12 - 0,6 мкмоль, прибавляют 3 мл хлороформа и 2 мл 0,05%-но го раствора бромтимолового синего с рН 4,5. Перемешивают пробы переворачиванием пробирок (40 прреворачина- ний).После полного расслоения фаз отбирают из хлороформного слоя Гниж- ней фазы) 2 мл окрашенного в желтый цвет раствора и переносят в другук пробирку, содержащую 3 мл 0,1 М раствора 1челочи, и встряхивают до полного обесцвечивания хлороформного слоя После полного расслоения отбирают окрашенный в синий цвет верхний слой и фотометрируют при 590 нм в кювете с длиной светового пути 1 см на спектрофотометре или колориметре против хо- лостой пробы (которую готовят так же но вместо смеси аминокислот обрабатывают такой же объем воды).

Зависимость чувствительности способа определения аргинина от значений рН раствора бромтимолового синего приведены в табл.1.

0,05%-ный раствор бромтимолового синего должен иметь значение рН в пределах 4,0-4,6, поскольку в этом интервале значений рН достигается максимальная чувствительность метода (табл.1).

Изобретение относится к аналитической химии, в частности к определению аргинина (Arg)B смеси аминокислот. С целью повьппения специфич- ности определения и упрощения способа анализируемый раствор предварительно нейтрализуют до рН 6,9-7,1, затем добавляют хлороформ.Полученную смесь обрабатывают раствором бромти- молового синего с рН 4,0, перемешивают до стабильности окраски. После расслоения фаз отделяют хлороформный слой, обрабатывают часть его 0,1 М раствором NaOH, а после расслоения смеси фотометрированию подвергают водный слой. Процент откры.- тия добавленного Arg находится в пределах 94,4-100%, 6 табл. (Л

рН раствора 3,0 3,8 4,0 4,2 4,4 4,6 4,8 5,0 6,0 Оптич.плотность

0,05 0,24 0,37 0,30 0,40 0,38 0,24 0,23 0,20

Перемешивание смеси аминокислот, 40 хлороформа и раствора бромтимолового синего ведут до образования постоянной окраски хлороформного слоя, что сви,цетельствует о полном извлечении гидрофобного комплекса аргинина и 45 бромтимолового синего в хлороформ. Эту операцию можно контролировать визуально по отсутствию нарастания желтой окраски хлороформного слоя при перемешивании.JQ

Перемешивание ведут путем переворачивания пробирок, избегая вспенивания проб, поскольку зто приводит к за- вьпиению результатов. Экспериментально установлено, что для полного извле- д чения комплекса аргинин-бромтимоловый

Таблица I

синий в хлороформ необходимо не более 40 переворачиваний пробирок. Обнаружено также, что гидрофобный комплекс аргинин-бромтимоловый синий полностью переходит в хлороформный слой и в том случае, если пробы, не перемешивая, оставить на сутки и более.

Специфичность определения аргинина по предложенному способу была проверена по отношению к лругим аминокислотам при различных чначениях рП раствора бромтимоловогр синего (табл.2). Из табл.2 следует, ч го в указанных условиях определения метод практически полностью специфичен лля аргинина.

Примечание,

Растворы аминокислот доведены 0,01 М раствором едкого натрия до рН 7,0. Для исследования взяты пробы аминокислоту содержащие по 0,6 мкмоль каждой аминокислоты.

1397808

Таблица2

513

PocnpOH4Bo,r,HMOCTh метода опреде- тения аргинина проверена при паоал- т епъных опрепеленчях одной ч той же пробы (0;7 мкмоль) аргинина (табп.З) Полученные данные свидетельствуют с достаточно хороших метрологических ..раметрах способа определения арги-- (низкий ря.ябрсс данных в парал- ; ьнь х опредапениях) .

Т а б л и д а 3

тическая плотность Параметры nDoP

Г р ri ; и ч п н не: Х-среаняя

лриЛмети- ческяя отибка. S - средняя квадоати- ческая ошибка. V - коэфАици- ент вариации.

Чувствительность метода определения аргинина в укаэаннмх условиях составляет 0,12 мкмоль аргинина. Линейная зависимость между количеством аргинина и onTH4ecKO t плотностью рас . трора сохраняется в KOH-I иентраций 0,12-0,6 мкмоль (табл.4), чтп достаточно для построение калибровочной кривой.

Почможность определения аргинича в присутствии других аминокислот бы- лд проверена также на искусственно приготовленной смеси аминокислот и лекарственной смеси аминокислот Альрезин, к которым добавляли известные количества аргининз. Определение аргинина в лекарственной смеси Альвезин (препарат, как указано в рецептуре, содержит 3,3 г/л аргинина) представлено в табл.5. Т а б л и ц а 5

3,3 г/л

3,15 г/л

95,Д/

Определение аргинина в смеси аминокислот при добавлении известных количеств аргинина в искусственную смесь аминокислот (в 25 мл воды растворили 200 мкмоль лизина, нор-ва- лина, цистеина, орнитина, триптофана, аланина, гистидина, валина, сери- на, нор-лейцина, глутаминовой кислоты, фенилаланмна, аспарагина, лей- п ,1На, иэолейиина, глутамина, аспара- гиновой кислоты, глипина, пролина, трег.нина н метионина) или в лекарст- смег.ь аминокислот Альвезин пр.пставлеко в табл.6.

Результаты исследований свидетельствуют, что предложенный способ открывает аргинин в лекарственной смеси Альвезин в количествах, совпадающих с указанными в рецептуре, процент открытия добавленного аргинина находится в пределах 94,Д-100%.

Таким образом, предложенный способ является более простым и специфичным, чем известный.

Формула изобретения

Способ определения аргинина путем обработки раствора анализируемой пробы цветореагентом с последующим

Т а б л и ц а ft

фотометрированием полученного окрашенного раствора, отличающийся тем, что, с целью повышения специфичности определения и упрощения способа, анализируемый раствор предварительно нейтрализуют до рН 6,9-7,1, добавляют хлороформ, в качестве цветореагента используют раствор бромтимолового синего с рН 4,0-4,6, смесь перемешивают до стабильности окраски, после расслоения фаз отделяют хлороформный слой, обрабатывают часть его 0,М раствором гидроксида натрия и после расслоения смеси фотометрированию подвергают водный слой.