СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ БЛОКООБРАЗОВАНИЯ ЧУМНОГО МИКРОБА Российский патент 1994 года по МПК C12N1/00 

Изобретение относится к медицинской микробиологии, а именно к методам моделирования для изучения этапов развития инфекционного процесса особо опасных инфекций. Выяснение сложных взаимоотношений возбудителя с переносчиком, включая размножение чумного микроба в блохе и механизм образования блока - это основной вопрос трансмиссивного пути передачи чумного микроба. Существующие методы изучения основаны на поэтапном слежении за этим явлением непосредственно в организме блохи, что представляет собой значительные трудности в изучении: последовательных процессов изменения фенотипа чумного микроба при формировании блока, влияния на этот процесс условий опыта (температурных режимов и т.д.) и различных веществ.

"Блок" у зараженных чумой блох представляет собой микробные глыбки. Однако до настоящего времени не представляется возможным изучить явление вне организма блохи, хотя это состояние можно трактовать, как агрегированность микробных клеток (формирование цепочек, плотных комков и сгустков).

Известен способ моделирования агрегированности микроорганизмов, основанный на использовании в качестве носителя небиологического сорбента-каолина (Bolus alba). Для агрегирования сальмонелл использовали коммерческий образец Bolus alba, просеянный через сито до величины частиц в пределах 20 мкм. Порошок в объеме 0,5 см³ конъюгировали с 0,25 мл взвеси сальмонелл на солевом растворе до концентрации 10⁹ микробных клеток в 1 мл, ресуспендировали в 3 мл солевого раствора, инкубируя смесь в течение 1-3 ч. Затем осуществляли исследование микробного агрегирования в развитии инфекционного процесса на модели сальмонеллеза мышей ("Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии N 9, 1988, М.: Медицина, с.29." Роль агрегирования микробных клеток в развитии сальмонеллеза мышей". ВП.Жалко-Титаренко и др.).

Недостатком этого способа моделирования является то, что использование в качестве активатора образования агрегатов небиологического сорбента приводит к побочным эффектам, связанным с процессами взаимодействия макро- и микроорганизма, т. е. при дальнейшем использовании образованного агрегата для исследования наблюдаются эффекты, зависящие непосредственно от используемого сорбента.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению относится способ моделирования агрегатов с использованием активатора биологического происхождения. Сальмонеллами заражают культуру клеток HE_p-2, которые содержатся в поддерживающей среде 0,5%-ного раствора лактальбумина без антибиотиков и сыворотки. Затем осуществляют исследования над полученной моделью ("Журнал микробиологии, эпидемиологии, иммунологии" N9, М.: Медицина, 1988, с.29).

Недостатком этого способа моделирования является то, что in vitro прослеживаются адгезивные процессы только на ранних стадиях.

Целью изобретения является повышение адекватности и объективности процесса моделирования с одновременным обеспечением возможности изучения процесса блокообразования. Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что культуру микробной взвеси вносят в среду активации агрегирования с последующим микроскопированием, причем в качестве среды активации блокообразования используют жидкую среду с гемолизированной кровью в соотношении 1: 10-1: 5, затем полученную взвесь инкубируют в течение 18ч при 28-37^оС (оптимальной для развития чумного микроба). Микроскопирование мазков, приготовленных из этой жидкой культуры, осуществляют поэтапно в процессе формирования агрегатов через 5-6, 11-12 и 17-18 ч.

Существенность отличий заявляемого объекта обосновывается тем, что отличительные признаки, включенные в формулу изобретения, в совокупности с существенными признаками ограничительной части формулы изобретения обеспечивают объект в целом новыми свойствами:
а) на полученной модели появилась возможность изучать интимные механизмы блокообразования у зараженной чумой блохи;
б) экспериментально обоснована роль гемолизированной крови в агрегировании чумного микроба как основы блока у зараженных чумой блох;
в) экспериментально на модели установлена взаимосвязь блокообразования и вирулентности чумного микроба.

Способ осуществляется следующим образом. В жидкие среды (физиологический раствор хлорида натрия, 1% пептонную воду, бульон Хоттингера pН 7,2) добавляют 5%-ную гемолизированную кровь в соотношении 1:10-1:5 и засевают по 1 петле суточной агаровой культуры чумного микроба. В качестве контроля берут эти же среды без гемолизированной крови. Посевы инкубируют при 28 и 37^оС. Агрегированность чумного микроба изучают в мазках из культур через 5-6, 11-12 и 17-18 ч.

П р и м е р 1. Жидкие среды - бульон Хоттингера (pH 7,2), 1% пептонная вода; активатор агрегирования - 5% гемолизированная кровь, температура инкубации жидких культур 28^оС.

Культуру Y.pestis предварительно инкубируют на агаре Хоттингера pH 7,2 при 28^оС в течение одних суток, после чего используют для моделирования блока чумного микроба. В среду выращивания - бульон или пептонную воду добавляют 5%-ную гемолизированную кровь в соотношении 1:10. В полученные таким образом среды засевают 100 мк культуры чумного микроба и выращивают в условиях 28^оС в течение 18 ч. На протяжении всех этапов формирования агрегатов - через 5-6, 11-12 и 17-18 ч (т.е. временных интервалов, общепринятых в микробиологии чумы) осуществляют наблюдение в мазках из этих субкультур. Для этого каплю культуры равномерно распределяют по всей поверхности предметного стекла и после фиксации окрашивают по Граму. При просмотре мазков производят подсчет одиночных микробов, цепочек, состоящих из разного числа микробов, а также их скоплений - группы до 10 бактерий, 10-50 и более 50 в каждом поле зрения. Данные по агрегированности приведены в таблице.

Через 18 ч культивирования исходную взвесь микробов разводят 1:10 и 1: 100 и 0,2 мл подкожно заражают белых мышей (по 4 животных на одну дозу). Павших мышей и забитых на 21-е сутки исследуют бактериологически. Посевы инкубируют при 28^оС, рост возбудителя чумы учитывают на 5-6-е сутки. Вирулентность оценивают по среднему гармоническому срока жизни, состояние агрегированности - по двухфакторному дисперсионному комплексу (Марков А.М., Поляков А.Е., 1974).

В мазках, приготовленных из культур, выросших в бульоне и пептонной воде с гемолизированной кровью, микробы располагаются в основном в виде цепочек или скоплениями и при этом они состоят из 20-30 и даже 90 чумных микробов, что четко прослежено в жидкой среде при инкубации в условиях 28^оС. Значение гемолизированной крови и температурного режима в формировании агрегатов чумного микроба подтверждено (уровень вероятности этих утверждений для пептонной воды p>>0,99), причем более существенное влияние на этот процесс оказывает гемолизированная кровь (доля влияния 46,7%).

Усиление вирулентности чумного микроба, выращенного на среде с гемолизированной кровью, выразилось в сокращении минимального и максимального среднего гармонического срока жизни зараженных животных. Так, разница этого показателя для микроба, выращенного на пептонной воде при 28^оС, по сравнению с контролем составила 02 сут по минимальному и 4,7 сут по максимальному срокам жизни; гибель животных в опытных группах увеличилась на 2,5%, а для выращенных на бульоне Хоттингера - по минимальному сроку - 0,8 сут, по максимальному - 3,4 сут, гибель подопытных животных возросла на 31,2%.

П р и м е р 2. Жидкие среды - бульон Хоттингера (pH 7,2), 1% пептонная вода; активатор агрегирования - 5% гемолизированная кровь, температура инкубации жидких культур чумного микроба 28^оС. Культуру Y.pestis предварительно инкубируют на агаре Хоттингера, (pH 7,2) при 28^оС в течение одних суток, после чего используют для моделирования блока чумного микроба. В среду выращивания (бульон или пептонную воду) добавляют 5%-ную гемолизированную кровь в соотношении 1:5. В полученные таким образом среды засевали 100 мк чумного микроба и выращивали в условиях 28^оС в течение 18 ч. Способ моделирования и изучение состояния агрегированности осуществляют аналогично примеру 1.

П р и м е р 3. Жидкие среды - бульон Хоттингера (pH 7,2), 1%-ная пептонная вода; активатор агрегирования - 5%-ная гемолизированная кровь в соотношении со средой 1:10; температура инкубации жидких культур чумного микроба 37^оС. Культуру Y.pestis предварительно инкубируют на агаре Хоттингера (pH 7,2) при 28^оС в течение одних суток, после чего используют для моделирования блока чумного микроба. В среду выращивания (бульон или пептонную воду) добавляют 5%-ную гемолизированную кровь в соотношении 1:10. В полученные таким образом среды засевают 100 мк культуры чумного микроба и выращивали в условиях 37^оС в течение 18 ч. Способ моделирования и изучение состояния агрегированности осуществляют аналогично примеру 1.

П р и м е р 4. Жидкие среды - бульон Хоттингера (pH 7,2), 1%-ная пептонная вода; активатор агрегирования - 5%-ная гемолизированная кровь в соотношении со средой 1:5; температура инкубации жидких культур чумного микроба 37^оС.

Культуру Y. pestis предварительно инкубируют на агаре Хоттингера (pH 7,2) при 28^оС в течение одних суток, после чего используют для моделирования блока чумного микроба. В среду выращивания (бульон или пептонную воду) добавляют 5%-ную гемолизированную кровь в соотношении 1:5. В полученные таким образом среды засевают 100 мк культуры чумного микроба и выращивают в условиях 37^оС в течение 18 ч. Способ моделирования и изучение состояния агрегированности осуществляют аналогично примеру 1.

В качестве активатора агрегирования использована гемолизированная кровь - биологический препарат, непосредственно участвующий в формировании блока преджелудка у зараженных чумой блох. Положительный эффект заключается в том, что:
1) получена возможность in vitro изучать интимные механизмы блокообразования у зараженных чумой блох;
2) доказана роль гемолизированной крови в формировании агрегатов чумного микроба, составляющих основу "блока" в преджелудке блокированных переносчиков;
3) установлено значение агрегатов чумного микроба в повышении вирулентности возбудителя для лабораторных животных;
4) получена возможность выявления особенности развития инфекционного процесса в организме восприимчивого животного при трансмиссивном механизме заражения.

Данные, полученные при просмотре мазков через 11-12 ч, не отличаются от результатов 5-6-часовой экспозиции. Агрегированность чумного микроба была самой высокой при концентрации гемолизированной крови в среде 1:5.

Использование: медицинская микробиология. Сущность изобретения: способ включает внесение микробной взвеси в среду активации агрегирования с последующим микроскопированием, в качестве среды активации блокообразования используют жидкую питательную среду с гемолизированной кровью в соотношении 1: 5-1: 10, затем взвесь инкубируют в течение 18 ч при температуре 28 или 37°С, а микроскопирование мазков, которые готовят из этой жидкой культуры, осуществляют поэтапно в процессе формирования агрегатов через 5-6,11-12 и 17-18 ч. 1 табл.

СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ БЛОКООБРАЗОВАНИЯ ЧУМНОГО МИКРОБА, включающий внесение микробной взвеси в жидкую питательную среду с гемолизированной кровью в соотношении 1 : 5 - 1 : 10, инкубацию ее при температуре 28 или 37^oС в течение 18 ч, и микроскопирование мазков поэтапно в процессе формирования агрегатов чумного микроба через 5 - 6, 11 - 12 и 17 - 18 ч.