СПОСОБ ЭКСПРЕССНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИБИОТИКОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ С ПОМОЩЬЮ РЕАКЦИИ НЕПРЯМОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ (РНГА) Российский патент 2003 года по МПК C12Q1/04 G01N33/53 

Изобретение относится к области медицины, а именно к микробиологии.

Определение чувствительности к антибиотикам возбудителя чумы необходимо для быстрого выбора наиболее эффективного препарата для специальной профилактики и лечения чумной инфекции.

Известны классические способы определения чувствительности к антибиотикам возбудителя чумы - метод диффузии в агар и метод серийных разведений в жидкой или агаризованной питательных средах (Инструкция по экстренной профилактике и лечению опасных инфекционных заболеваний. М.: Военное издательство, Минздрав СССР, с.16-22. ДСП).

Недостатками этих способов являются длительные сроки получения окончательных результатов, а также возможность несовпадения данных по чувствительности микробов к антибиотикам с клиническими наблюдениями, поскольку исследования проводят в пробирочных условиях (ин витро).

Наиболее близким к заявляемому способу является способ определения антибиотикочувствительности возбудителя чумы, направленный на повышение чувствительности способа (Патент РФ 2045576, С 12 Q 1/04, опубликован 10.10.95. Бюл. 11).

Способ включает исследование нативного материала путем введения его опытным белым мышам, обработанным испытуемым антибиотиком в лечебной дозе, и контрольным мышам подкожно в область спины 0,5-1,0 мл суспензии исследуемого материала в физиологическом растворе, причем суспензию предварительно смешивают с желтком куриного яйца в объемном соотношении 1:1,4 с 25 мг поливинилпирролидона и с 7 мг циклофосфана, мазки - отпечатки готовят с места введения, а антибиотикочувствительность определяют по отсутствию возбудителя чумы в мазках - отпечатках опытных мышей при обнаружении его у контрольных.

Однако указанный способ основывается на иммунофлуоресцентном анализе материала с места введения и не предусматривает его исследование более простым и надежным серологическим методом (РНГА), включающим возможность относительно точного количественного определения содержания специфического капсульного антигена.

Целью предлагаемого изобретения является экспрессное определение антибиотикочувствительности возбудителя чумы с помощью реакции непрямой гемагглютинации (РНГА).

Поставленная цель достигается тем, что чистую 1-2-суточную культуру чумного микроба в дозе 10⁷-10⁹ КОЕ/мл (0,7-1 мл одномиллиардной суспензии) смешивают с консервированной кровью человека в объемном соотношении 1:0,5-1: 0,7, к полученной смеси добавляют 0,5-0,7 мл желтка куриного яйца, 5-7 мг кортизона (из расчета на одно животное) и вводят под кожу спины 2-м белым мышам - одной опытной, второй контрольной. К инокуляту, вводимому опытной мыши, предварительно добавляют испытуемый антибиотик в лечебной дозе. Результаты учитывают, определяя наличие или отсутовие роста чумного микроба на месте введения с помощью серологического метода.

Отличительные признаки заявляемого способа по отношению к прототипу заключаются в том, что обнаружение чумного микроба в материале из места введения исследуемой пробы осуществляют с помощью серологического метода, который по сравнению с иммунофлуоресцентным анализом является более точным, поскольку включает возможность количественного определения содержания специфического антигена фракции I.

Применение в качестве исследуемого материала чистой культуры возбудителя исключает возможность ложноположительных серологических реакций, которые могут быть за счет наличия контаминирующей микрофлоры.

Добавление к исследуемой культуре консервированной крови человека и кортизона (вместо поливинилпирролидона и циклофосфана) создает наиболее оптимальные условия для биосинтеза F_I ⁺ штаммами чумного микроба в организме биопробного животного F_I антигена и селективного накопления микробных клеток с продукцией фракции I на месте введения.

Способ осуществляется следующим образом.

Чистую 1-2-суточную культуру чумного микроба в дозе 10⁷-10⁹ КОЕ/мл (0,7-1 мл одномиллиардной суспензии) смешивают с консервированной кровью человека в объемном соотношении 1:0,5-1:0,7, к полученной смеси добавляют 0,5-0,7 мл желтка куриного яйца, 5-7 мг кортизона (из расчета на одно животное) и вводят под кожу спины 2-м белым мышам (опытной и контрольной). К инокуляту, вводимому опытной мыши, предварительно добавляют испытуемый антибиотик в лечебной дозе. Через 6 часов после заражения грызунов умерщвляют хлороформированием и прикрепляют к вскрывочной доске спиной кверху. Отсепаровывают кожу спины и кожный лоскут отбрасывают на голову грызуна. При этом легко обнаруживается место введения за счет пропитывания мягких тканей кровью. Патологически измененные ткани места введения опытной и контрольной мыши тщательно срезают ножницами и переносят их в отдельные стерильные фарфоровые ступки, в которые предварительно наливают 0,5 мл стерильного физиологического раствора, и тщательно растирают пестиком. Полученную эмульсию переносят в пробирки, обеззараживают по общепринятой методике (добавляют до 1% формалина) и используют для постановки реакции непрямой гемагглютинации (РНГА). Для постановки указанной реакции используют иммуноглобулиновые эритроцитарные диагностикумы, предназначенные для определения возбудителя чумы и лабораторной диагностики вызванного им заболевания.

Постановку РНГА осуществляют в У-образных лунках планшетов микротитратора Такачи. Для проведения одного анализа в 11 лунок двух рядов планшетов вносят по 0,05 мл разводящей жидкости. В первые лунки обоих рядов добавляют по 0,05 мл исследуемого материала опытной и контрольной мыши. Большими петлями микротитратора (0,05 мл) готовят два ряда двукратных разведений. Во все лунки вносят по 0,025 мл взвеси иммуноглобулинового эритроцитарного диагностикума, планшеты встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 1,5-2 часа. Постановку РНГА сопровождают обязательным контролем эритроцитарного диагностикума на отсутствие спонтанной агглютинации. Для этого в последние лунки каждого ряда вносят по 0,05 мл разводящей жидкости и 0,025 мл взвеси эритроцитарного диагностикума.

О чувствительности возбудителя к антибиотикам судят по разнице в титрах антигена в опытом и контрольном рядах.

Анализ завершают определением степени чувствительности возбудителя к испытуемому антибиотику. Антибиотик относят к эффективным только в том случае, если положительный результат ингибиции микробного роста регистрируют только в пробах, приготовленных с места введения опытных мышей. Отсутствие разницы в титрах опытных и контрольных проб свидетельствует об устойчивости возбудителя к испытуемому антибиотику.

Возможность использования предлагаемого способа иллюстрируется примерами практического его выполнения с использованием полной совокупности заявляемых признаков.

Пример 1.

Чистую 1-2-суточную культуру чумного микроба в дозе 10⁷ КОЕ/мл (0,7 мл одномиллиардной суспензии) смешивают с консервированной кровью человека в объемном соотношении 1:0,5, к полученной смеси добавляют 0,5 мл желтка куриного яйца, 5 мг кортизона (из расчета на одно животное) и вводят под кожу спины 2-м белым мышам (опытной и контрольной). К инокуляту, вводимому опытной мыши, предварительно добавляют испытуемый антибиотик в лечебной дозе. Через 6 часов после заражения грызунов умерщвляют хлороформированием, вскрывают и исследуют только материал из места заражения с помощью реакции непрямой гемагтлютинации (РНГА).

Обнаружение возбудителя чумы у контрольных животных при отсутствии его у опытных свидетельствует об эффективности испытуемого антибиотика. При неэффективности антибиотика возбудитель чумы обнаруживают как в контроле, так и в опыте.

Пример 2.

Чистую 1-2-суточную культуру чумного микроба в дозе 10⁸ КОЕ/мл (0,8 мл одномиллиардной суспензии) смешивают с консервированной кровью человека в объемном соотношении 1:0,6, к полученной смеси добавляют 0,6 мл желтка куриного яйца, 6 мг кортизона (из расчета на одно животное) и вводят под кожу спины 2-м белым мышам (опытной и контрольной). К инокуляту, вводимому опытной мыши, предварительно добавляют испытуемый антибиотик в лечебной дозе. Через 6 часов после заражения грызунов умерщвляют хлороформированием, вскрывают и исследуют только материал из места заражения с помощью реакции непрямой гемагглютинации (РНГА).

Обнаружение возбудителя чумы у контрольных животных при отсутствии его у опытных свидетельствует об эффективности испытуемого антибиотика. При неэффективности антибиотика возбудитель чумы обнаруживают как в контроле, так и в опыте.

Пример 3.

Чистую 1-2-суточную культуру чумного микроба в дозе 10⁹ КОЕ/мл (1 мл одномиллиардной суспензии) смешивают с консервированной кровью человека в объемном соотношении 1:0,7, к полученной смеси добавляют 0,7 мл желтка куриного яйца, 7 мг кортизона (из расчета на одно животное) и вводят под кожу спины 2-м белым мышам (опытной и контрольной). К инокуляту, вводимому опытной мыши, предварительно добавляют испытуемый антибиотик в лечебной дозе. Через 6 часов после заражения грызунов умерщвляют хлороформированием, вскрывают и исследуют только материал из места заражения с помощью реакции непрямой гемагглютинации (РНГА).

Обнаружение возбудителя чумы у контрольных животных при отсутствии его у опытных свидетельствует об эффективности испытуемого антибиотика При неэффективности антибиотика возбудитель чумы обнаруживают как в контроле, так и в опыте.

Как показали экспериментальные исследования, заявляемые пределы содержания ингредиентов, входящих в состав инокулята, а также дозы возбудителя чумы являются оптимальными для достижения поставленной цели, так как обеспечивают задержку, размножение и накопление микробных клеток чумы только на месте введения, что облегчает поиск возбудителя. При этом создаются оптимальные условия для интенсивного биосинтеза видоспецифического капсульного антигена - фракции I, что позволяет определять антибиотикочувствительность возбудителя чумы серологическим методом в живом организме (ин виво). При этом результат можно получить уже через 8-10 часов от начала анализа.

Таким образом, использование заявляемого способа позволит проводить экспрессное определение антибиотикочувствительности возбудителя чумы в живом организме (ин виво).

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для определения антибиотикочувствительности возбудителя чумы ин виво с помощью серологического метода - РНГА. Способ включает введение опытным белым мышам, обработанным испытуемым антибиотиком в лечебной дозе, и контрольным мышам подкожно в область спины суспензии исследуемого материала. В качестве исследуемого материала используют чистую культуру чумного микроба в дозе 10⁷-10⁹ КОЕ/мл (0,7-1 мл одномиллиардной суспензии), которую предварительно смешивают с консервированной кровью человека в объемном соотношении 1:0,5-1: 0,7, к полученной смеси добавляют 0,5-0,7 мл желтка куриного яйца, 5-7 мг кортизона из расчета на одно животное, а наличие или отсутствие возбудителя чумы на месте введения определяют с помощью реакции непрямой гемагглютинации (РНГА). Изобретение позволяет проводить экспрессное определение антибиотикочувствительности возбудителя чумы с помощью РНГА.

Способ экспрессного определения антибиотикочувствительности возбудителя чумы с помощью реакции непрямой гемагглютинации (РНГА), включающий введение опытным белым мышам, обработанным испытуемым антибиотиком в лечебной дозе, и контрольным мышам подкожно в область спины суспензии исследуемого материала в физиологическом растворе с активаторами, иммунодепрессантом и определение антибиотикочувствительности по отсутствию возбудителя чумы на месте введения у опытных мышей при обнаружении его у контрольных, отличающийся тем, что для повышения чувствительности способа в качестве исследуемого материала используют чистую культуру чумного микроба в дозе 10⁷-10⁹ КОЕ/мл (0,7-1 мл одномиллиардной суспензии), которую предварительно смешивают с консервированной кровью человека в объемном соотношении 1:0,5 - 1:0,7, к полученной смеси добавляют 0,5-0,7 мл желтка куриного яйца, 5-7 мг кортизона из расчета на одно животное, а наличие или отсутствие возбудителя чумы на месте введения определяют с помощью реакции непрямой гемагглютинации (РНГА).