Способ получения целлюлаз Советский патент 1989 года по МПК C12N9/42 C12N9/42 C12R1/885 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам получения целлкшаз культивированием грибов- продуцентов, и может быть использовано в лесной, целлюлозно-бумажной, текстильной промьгашенности и сельском хозяйстве.

Целью изобретения является повыше- ни выхода целлюлаз.

Способ предусматривает использование только труднометаболизируемых источников целлюлозы, прошедших предварительную обработку с удалением легко метаболизируемых фракций Сахаров, при оптимальных для биосинтеза целлюлаз

соотношениях целлюлозы и лигнина от 3:2 до 1:3 и содержании чистой целлюлозы в среде 0,65-1,35 мас.%.. Эти источники целлюлозы являются трудноразрушаемыми в природе лигноцеллюлоз- ными отходами промьшшенности и ского хозяйства (целлолигнин) либо могут быть получены из них или более богатых целлюлозой материалов путем их частичного гидролиза целлюлолити- ческими фрагментами.

Способ осуществляют следующим образом.

В качестве продуцентов используют штаммы Trichoderma viride Б7 и V 3/10,

Jib СО

o

ЭО 9d

дештннрованиые во Всесоюзной коллекции промыиитенных микроорганизмов и имеющие соответственно регистрационные номера BKim и F-79 и ВКПМ F-120

Культуры продуцентов выра11р1вают на скошенной агаризованной среде Роулен-Тома в течение 5-6 сут. Ферментационная среда содержит в своем составе источник углерода в виде целлюлозосодержащего отхода, органи ческий источник азота и необходимые минеральные соли. Ферментационную питательную среду засевают водной суспензией конидий сп скошенного агара из расчета 10 конидий/мл ере ды. Культивирование осуществляют в .колбах Эрленмейера объемом 750 мл при рабочем объеме среды 100 мл в условиях аэрации на круговых качалках, вращающихся со скоростью 200 91886

220 об/мин, в течение 144-192 ч при 28-30°С.

Активность целлюлолитических фер- с ментор определяют по степени гидролиза фильтровальной бумаги Ватман № 1, Количество образующихся редуцирующих Сахаров определяют методом Шомоди- Нельсона. Целлюлолитическую активность вьфажают в миллиграммах глюко10

15

20

зы, образующейся в реакционной смеси при действии на субстрат 1 мл неразведенного фильтрата культуральной жидкости (ед/мл), а также в международных единицах целлюлолитической активности (МЕ/мп).

Таблица иллюстрирует средние достигаемые значения активности для различных видов лигноцеллюлозного сырья при реализации предлагаемого способа на двух штаммах T.viride,

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в лесной, целлюлозно-бумажной, текстильной промышленности и сельском хозяйстве. Цель изобретения - повышение выхода целлюлаз. Способ предусматривает выращивание продуцента TRICHODERMA VIRIDE на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода лигноцеллюлозные виды сырья, выбранные из отходов промышленности или сельского хозяйства, или твердый остаток этих отходов, подвергнутый обработке целлюлозами, причем соотношение целлюлозы и лигнина устанавливают от 3:2 до 1:3, содержащие чистой целлюлозы в среде 0,65-1,35 мас.%. Выход целлюлаз повышается в 1,4-4 раза. 1 табл.

Примечание. 1- сучковая целлюлоза производства лесопромыоленного комплекса; 2 - холоцеллкшоза из стеблей хлопчатника (); 3 - отход переработки бумаги и картона для текстильных патронов фабрики бумажно-технических изделий; А - осажденный бентонитом из сточных вод отход производства конденсаторной бумаги бумажной фабрики; 5 - кис- лотно-осахаренная древесно-волокнистая масса производства целлюлозно-бумажного комбината; звездочкой обозначены виды отходов после обработ- хя целлюлязакч (для снижения содержания целлюлозы),

5

Сопоставление данных таблицы показывает, что наиболее высокие выходы целлкхпаз для обоих штаммов (в 1,5- 4 раза выше, чем для базового объекта, опыт 13) наблюдаются при использовании различных видов лигноцеллю- лозных отходов или их остатков после обработки целлюлазами до достижения соотношения целлюлозы и лигнина от 3:2 до 1:3 (предпочтительно от 1:1 до 1:2). Как повьпиение (опыты 1 и 2) так и понижение (опыты 11 и 12) этого соотношения приводит к ухудшению выхода ферментативной активности несмотря на то, что во всех случаях уравнивается содержание чистой целлюлозы в среде культивирования. Установлено, что при использовании приготовленных указанным вьпие способом лигноцеллюлозных материалов в среде культивирования содержалось не свьппе 0,025 г/л растворимых Сахаров, тогда как при использовании свекловичного жома их концентрация в среде составляла 1,8 г/л.

Пример 1 (контроль). Для осуществления процесса биосинтеза целлю- лолитических ферментов конидиями штаммов T.viride 13/10 или Б7 засевают ферментационную среду следующего состава, мас.%:

Свекловичный жом

Пшеничные отруби

MgS04

4,0 5,0 0,2 0,06 0,6 1,43 рН - натуСолодовые ростки Вода - водопроводная, ральный.

Культивирование осуществляют в колбах Эрленмейера объемом 750 мл при объеме среды 100 мл. Оптимальная температура ферментации 28-30 С. Через 144 ч уровни целлюлолитической активности составляют, ед./мл (МЕ/мл Штамм 13/10 (F-120) 12,9 (1,19) Штамм Б7 (F-79) 12,9 (1,14) Пример 2, Процесс ферментаци осуществляют в тех же условиях, что и в примере 1, но вместо свекловичного жома используют обработанную целлюлазами холоцеллюлозу гузапаи при соотношении целлюлозы и лигнина 3:2 и содержании в среде чистой целлюлозы 1,13 мас.%. Через 168 ч уровни целлюлазной активности составляют ед./мл (МЕ/мл):

Штамм 13/10 20,3 (1,9)

Штамм Б7 16,9 (1,65)

П р и м е р 3. Процесс ферментации

0

осуществляют в и в примере 1,

5

Штамм Б7 Приме осуществляют в и в -примере 1 ,

0

5

0

тех же условиях, что но вместо свекловичного жома используют мелкое волокно - отход производства конденсаторной бумаги при соотношении целлюлозы и лигнина 1:1 и содержании чистой целлюлозы в среде 0,9 мас.% для штамма 13/10 и 1,13 мас.% для штамма Б7. Через 192 ч уровни целлюлазной активности соста,вляют,. ед./мл (hfE/мл) : Штамм 13/10 24,1 (2,2) 28,2 (2,6)

р 4. Процесс ферментации тех же условиях, что но вместо свекловичного жома используют бумажную пыль (отход бумаги для текстильных патронов), обработанную целлюлазами при соотношении целлюлозы и лигнина 1:2 и содержании чистой целлюлозы в среде 0,9 мас.%. Через 168 ч уровень цел- . люлазной активности для штамма 13/10 составляет 46,1 ед./мл или 4,3 МЕ/мл, Приме р 5. Процесс ферментации осуществляют в тех же условиях, что и в примере 1, но вместо свекловичного жома используют мелкое волокно - отход производства конденсаторнйй бумаги - после обработки целлюлазами при соотношении целлюлозы и лигнина 1:3 и содержании чистой целлюлозы в среде 1,13 мас.%. Через 192 ч уровень целлюлазной активности составляет, ед./МП (МЕ/мл):

25,5 (2,3) 20,0 (1,9)

6 (опытно-промьшшен- ные испытания). Ферментацию проводят в ферментере рабочим объемом 9 м на среде того же- состава, чтр и в приме- g ре 1, за исключением того, что пшеничные отруби используют в концентрации 0,5%, а вместо свекловичного жома в ферментер загружают 117 кг по сухому весу бумажной ,пыли, предварительно обработанной целлюлазами, при соотношении целлюлозы и лигнина 1:1 и содержании чистой целлюлозы в ферментере 0,65 мас.%. Посевной материал - 5 колб поверхностной культуры штамма T.viride 13/10. Время активации на качалке 13,5 ч. Продолжительность выращивания посевного материа ла в инокуляторе 22,5 ч, объем ино- кулята 1 м, исходный рН среды 5,25.

5

0

Штамм 13/10 Штамм Б7 Пример

0

5

Через 121 ч уровень активности штамма 13/10 22,6 ед./мл или 2,1 МЕ/мп при среднегодовом уровне на среде с жомом (базовый объект) 13,2 ед./мл или 1,2 МЕ/нл,

В примерах 4-6, где используется обработка целлюлазани для получения целлолигнина необходимого состава, применятся глубокий гидролиз фермент- ными препаратами целлобранином, цел- локандином, целловиридином из расчета 20 ед./г сырья в течение 48-72 ч при 45-50 С с последующим тщательным отмыванием образующихся Сахаров до концентрации менее 0,002%. Обработанное ферментами сьфье фактически может являться отходом ферментативного получения Сахаров.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить выход целлюлаз в 1,5-4 раза, утилизировать трудноразрушаемые лигнифицированные отходы промьшшенности и сельского хозяйства и заменить кормовое сырье - свекло- вичный жом.

За базовый объект принят способ получения целлюлаз, используемый на биохимическом заводе и включающий культивирование продуцентов целлюлаз грибов Trichoderma viride (Т.reesei ) на среде того же состава, что в примере, 6, за исключением того, что в качестве источника углерода используется ,4%-ный жом.

По сравнению с базовым объектом предлагаемый способ позволяет полу

чить в тех же условиях и за то же время выход целлюлаз в 1,7 раза вьпие при использовании более дешевого,сырья - остатка ферментативного гидролиза бумажной пьши.

Формула изобретения

1,Способ получения целлюлаз, предусматривающий культивирование грибов Trichoderma spp - продуцентов целлю- лолитических ферментов на питательной среде, содержащей целлюлозосодержащий источник углерода, источник азота - пшеничные отруби и солодовые ростки, минеральные соли и воду при оптимальной температуре культивирования до достижения максимальной активности, отличающийся тем, что,

с целью повьппения выхода целлюлаз, в качестве источника углерода используют лигноцеллюлозные виды сырья, представляющие отходы промышленности или- сельского хозяйства, или твердый остаток этих отходов, подвергнутый обработке целлюлазами, при этом соотношение целлюлозы и лигнина устанавливают от 3:2 до 1:3, содержание чистой целлюлозы в среде - от 0,65 до 1,35 мас.%,

2.Способ ПОП.1, отличающийся тем, что в качестве продуцента используют штамм Trichoderma viride ВКПМ F-79 или Trichoderma viride ВКПМ F-120,