КЛАТРАТ 7-ИЗОПРОПОКСИИЗОФЛАВОНА И ЦИКЛОДЕКСТРИНОВОГО ПОЛИМЕРА, ПРОЯВЛЯЮЩИЙ АКТИВНОСТЬ ПРОТИВ ОСТЕОПОРОЗА И ОСТЕОМАЛЯЦИИ Российский патент 1994 года по МПК C08B37/16 A61K31/735 

Изобретение относится к клатрату из 7-изопропоксиизофлавона, полученного с циклодекстриновым полимером. В клатрате, согласно изобретению, в качестве циклодекстринового производного можно использовать α -, β- или γ -циклодекстрин, гептакис-2,6-O-диметил- или гептакис-2,3,6-три-O-метил- β -циклодекстрин с мол. массой около 10000.

Получение иприфлавона (7-изопропоксиизофлавона) описано; характеристики соединения следующие: мол. масса 280,3; т.пл. 112-118^оС; растворимость в воде при 25^оС: 1-2 мг/мл. Он слаборастворим в ацетоне, но хорошо растворяется в хлороформе и диметилформамиде.

Известное лекарство ямболап, содержащее 200 мг иприфлавона в качестве активного ингредиента, которое используют для лечения остеопороза и остеомаляции. Однако из-за своей слабой растворимости и всасываемости его терапевтическая эффективность недостаточна.

При введении меченого радиоактивными изотопами иприфлавона гончим собакам и определении количества выводимого радиоактивного материала наблюдали тот факт, что только 12% введенного радиоактивного материала выделяется с мочой. Анализ ЖХВД крови подтвердил то, что его метаболиты (7-гидроксиизофлавон как основной метаболит) проявляются в крови.

Прилагали большие усилия для того, чтобы повысить всасываемость иприфлавона и его основного метаболита (7-гидроксиизофлавона). В европейском патенте описывается, что всасываемость и растворимость фармацевтических составов, обладающих слабой растворимостью, повышается, если их перемалывают с инертными носителями. Например 2 г иприфлавона перемалывали в течение 10-60 мин вместе с 2 г аэросила или 2 г активированного угля, или 2 г активированной глины, или 2 г активированного оксида алюминия в вибромельнице с использованием стальных шариков. Растворимость полученного продукта, например, с аэросилом составила 20,4 мг/мл и 50%-ном водном метаноле через 30 мин при 37^оМ, в то время как растворимость неизмельченной смеси составила только 15,0 мг/мл, соответственно растворимоcть in vitro увеличилась в 1,36 раза. Анализ уровней содержания в крови собак после перорального введения показал, что иприфлавон нельзя обнаружить в крови. Перемалывание вместе с аэросилом увеличивает всасываемость основного метаболита с 0,152 мг/ч/мл до 0,485 мг/ч/мл, что соответствует увеличению в 3,19 раза.

Хорошо известно, что различные нестабильные и летучие активные ингредиенты различных фармацевтических составов и пестицидов становятся стабильными и кристаллическими, когда они образуют молекулярные капсулы с циклодекстрином. С фармацевтической точки зрения самым важным действием является то, что клатраты с различными активными ингредиентами со слабой растворимостью в воде становятся смачиваемыми водой, их можно легко диспергировать и поэтому они легко растворяются в воде. Их растворимость и всасываемость, в основном, в 1,3-3 раза выше, чем растворимость свободных некомплексных активных ингредиентов.

Целью изобретения является повышение растворимости иприфлавона.

Указанная цель достигается структурой нового производного иприфлавона - клатрата 7-изопропоксиизофлавона и циклодекстринового полимера общей формулы
2A где А= α -, β- или γ -циклодекстрин, гептакис-2,6-О-диметил-β-циклодекстрин или гептакис-2,3,6-три-О-метил-О-циклодекст- рин, проявляющего активность против остеопороза и остеомаляции.

Было установлено, что после введения клатрата, согласно изобретению, растворимость in vitro иприфлавона в 10 раз, а уровень содержания в крови основного метаболита в 15-20 раз выше, по сравнению с растворимостью иприфлавона, введенного per se. Можно также определить всасываемость иприфлавона в неизменной форме и фармацевтически эффективной концентрации.

Циклодекстрины получают из крахмалов, используя фермент цилклодекстрин-глюкозилтраксферазу. Существует три различных вида циклодекстрина, т.е. α -, β- и γ -циклодекстрин, который содержит 6,7 или 8 ед. глюкопиранозы, связанных с α -1,4-глюкозидными связями. Три циклодекстрина отличаются друг от друга молекулярной массой, растворимостью в воде и диаметром полости, соответственно они могут образовывать клатраты с самыми разными видами соединений, но клатраты одного и того же соединения, образованные с различными видами циклодекстрина, обладают совершенно разными свойствами. Существует возможность проводить дальнейшие модификации в молекуле циклодекстрина путем подходящих замещений. Например, в случае с диметил-β-циклодекстрином (ДИМЕБ) две гидроксильные группы каждого ядра глюкозы метилируют, в то время как в случае с триметилциклодекстрином (ТРИМЕБ) все гидроксильные группы замещены на метоксигруппы. Растворимость у этих соединений даже выше, и их комплексообразующая способность также отличается от аналогичных показателей у незамещенных циклодекстринов.

Для циклодекстринов в основном характерно то, что внешняя поверхность молекулы гидрофильна, но внутренняя поверхность является неполярной, и благодаря размеру внешнего пространства имеется возможность включить (ввести) подходящую "примесную молекулу". Так называемое "молекулярное капсулирование" можно осуществлять таким образом.

Одним из доказательств образования клатрата из иприфлавона и циклодекстрина является то, что циклодекстрин увеличивает растворимость иприфлавона в водных растворах. Для того, чтобы определить это свойство, 10 мг иприфлавона, циклодекстрина в различных количествах и 5 мл дистиллированной воды поместили в пробирки для испытания объемом 10 мл, пробирки встряхивали в течение 4 дн при 25^оС со скоростью вращения 325 об/мин, после чего образцы отфильтровали на стеклянном фильтре, и фильтраты подвергли фотометрическому анализу в 50%-ном водном растворе этанола. Результаты приведены в табл. 1.

Растворимость иприфлавона в дистиллированной воде составляет 1-2 мг/мл при 25^о. Из данных табл. 1 видно, что растворимость иприфлавона может увеличиваться в β-циклодекстриновом растворе в зависимости от концентрации β -циклодекстрина- до 15-кратного повышения растворимости в дистиллированной воде. При повышении концентрации β -циклодекстрина до 1% растворимость иприфлавона увеличивается до 16-20 мг/мл, но при дальнейшем повышении концентрации циклодекстрина уровень растворимости сначала остается постоянным, затем начинает снижаться, когда концентрация циклодекстрина превышает 1,8% . Растворимость становится постоянной величиной, составляющей 6 г/мл, когда концентрация циклодекстрина превышает 4% в суспензии. Эту величину можно считать конечной растворимостью твердого клатрата, образованного в присутствии избыточного иприфлавона.

В γ -циклодекстриновом растворе растворимость значительно не увеличивается, можно достигнуть только трехкратного увеличения.

В случае с α -циклодекстрином растворимость иприфлавона увеличивается до 20-22 мг/мл в 12%-ном растворе. УФ-спектр иприфлавона также изменяется в таком растворе.

При использовании тримеба или димеба также можно наблюдать повышение растворимости. При увеличении концентрации циклодекстриновых производных повышение растворимости иприфлавона почти линейно. В 15%-ном растворе тримеба растворимость составляет 440 мг/мл, и в 15%-ном растворе димеба можно достигнуть растворимости 1700-2000 мг/мл, соответствующей увеличению растворимости в 300 и 1770 раз соответственно.

Суммируя вышеупомянутые результаты, можно сказать что растворимость иприфлавонового клатрата, согласно изобретению, в 4 раза выше относительно активного ингредиента, чем растворимость иприфлавона per se и всасываемость его после перорального введения крысам минимум в 10 раз лучше, по сравнению с уровнем содержания в крови, измеренном после введения свободного активного ингредиента в той же дозе. Неизменный уровень содержания 7-изопропоксиизофлавона составляет по крайней мере 25% от общего количества материала, который всасывается.

Клатрат, согласно изобретению, можно получить, когда 7-изопропоксиизофлавон подвергают взаимодействию с циклодекстриновым производным в водно-органической среде. Можно использовать в качестве органического растворителя спирт или кетон. По предпочтительному варианту подвергают взаимодействию водные растворы компонентов, предпочтительно при 50%-ной концентрации этанола, затем путем охлаждения выделяют полученный кристаллический продукт.

Согласно другому методу, два компонента можно смешать в водном растворе ацетона одновременно с выпариванием растворителя. Используя димеб или тримеб или растворимый циклодекстриновый полимер, из реакционной смеси можно выделить твердый порошкообразный продукт путем выпаривания, сушки распылением, сушки при температуре ниже 0^оС, или в случае с димебом путем нагревания раствора.

Следующие примеры подробно иллюстрируют изобретение.

П р и м е р 1. Получение иприфлавон- β-циклодекстринового клатрата, имеющего молярное соотношение 1:2.

11,0 г (39,2 ммоль) иприфлавона и 114,3 г (88,3 ммоль)циклодекстрина с содержанием влаги 12,36% растворяют в 2,25 л водного раствора этанола, составляющего по объему 50% при 80^оС, интенсивно перемешивая, и дают остыть до комнатной температуры. Осажденный кристаллический продукт отфильтровывают и сушат в течение 24 ч при 60^оС, что дает 96,4 г продукта в виде рыхлого порошка белого цвета. Размер частиц был менее 99 мм. Содержание иприфлавона: 10,8% по массе, иприфлавон: β -циклодекстрин=1:2, выход относительно активного ингредиента 94,7%.

Для того, чтобы доказать, что вышеупомянутый продукт действительно является клатратом, проводили различные анализы: термоаналитический анализ, дифракцию рентгеновских лучей и анализ растворимости.

Термоаналитическое поведение механической смеси и свободных компонентов является почти одинаковым, но изменения в клатрате, происходящие из-за нагревания, можно наблюдать только одновременно с разложением циклодекстрина. При испытании механической смеси дифференциальной сканирующей калориметрией (ДСК) при 115^оС установили, что эндотермический пик соответствует точке плавления иприфлавона, но в случае с клатратом пик не наблюдался. Механическая смесь показала непрерывную потерю массы в соответствии с уровнем содержания иприфлавона, в интервале между 130 и 50^оС, но в случае с клатратами не наблюдали какой-либо потери в массе или высвобождения органических веществ в том же температурном интервале (анализ термического расширения, АТР).

Диаграмма, полученная в результате рентгеноструктурного анализа порошка механической смеси, состоит из добавочных сумм диаграмм порошковых компонентов. Однако диаграмма порошка из клатрата содержит меньше пиков и новые пики (20^о= 6,7; 8; 20,9), характеристические для клатрата и отличаются от характеристических пиков β циклодекстрина (20^о=4,5; 10,6; 12,3), а у иприфлавона составляют 20^о=5,8; 11,5; 15,5, 17,3, 22,0, указывая на новую кристаллическую структуру и таким образом подтверждая косвенно образование клатрата.

Для того, чтобы провести испытания, 250 мл дистиллированной воды поместили в колбу емкостью 500 мл и нагревали до 37^оС. Затем продукт в количестве, соответствующем 50 мг активного ингредиента, добавили, затем суспензию, полученную таким образом, перемешивали при 1000 об/мин, используя магнитную мешалку. Через определенные интервалы отбирали образцы проб по 2-6 мл и фильтровали на стеклянном фильтре, и после разбавления фильтраты измеряли фотометрически в смеси вода:этанол в соотношении 1:1.

Полученные результаты приведены в табл. 2.

Растворение свободного активного ингредиента является относительно медленным, оно достигает величины насыщения иприфлавона (около 1,5 мг/мл) через 40-50 мин. В случае с образцами, содержащими иприфлавон-β -циклодекстриновый клатрат, максимальную концентрацию растворенного иприфлавона получают уже через 1 мин, т.е. активный ингредиент растворяется, сразу же также происходит мгновенное растворение, более того, вначале концентрация активного ингредиента может быть такой же высокой, как и двойной уровень насыщения. Растворение смеси иприфлавона и β -циклодекстрина является более медленным, концентрация растворенного активного ингредиента достигает величины, определенной тогда, когда растворили клатрат, только через 30-40 мин.

Растворимость активного ингредиента определили также при различных уровнях содержания рН. Полученные кривые растворимости при рН 1,3 (это соответствует кислотности желудочного сока; НСl) при рН 7,6 (это соответствует величине рН кишечника; фосфатный буфер) существенно не отличаются от величин растворимости, полученных в дистиллированной воде, соответственно растворимость активного ингредиента не зависит от рН в испытуемом интервале рН.

П р и м е р 2. Получение иприфлавон- γ -циклодекстринового клатрата, имеющего молярное соотношение 1:2.

0,5 г (1,78 ммоль) иприфлавона растворяют в 50 мл 96%-ного этанола и раствор, по- лученный таким образом, добавляют по каплям к раствору из 8,0 г (5,35 ммоль) γ -циклодекстрина с содержанием влаги 13,3% в 50 мл дистиллированной воды в течение 2 ч, затем смеси дают остыть до комнатной температуры. После интенсивного перемешивания еще в течение 16 ч полученный продукт отфильтровывают и сушат в течение 24 ч при 60^оС, чтобы получить 5,5 г продукта.

Содержание иприфлавона: 7; 2,29. Выход относительно активного ингредиента 87%. Продукт также содержит свободный циклодекстрин.

П р и м е р 3. Получение иприфлавон- α -циклодекстринового клатрата, имеющего молярное соотношение 1:2.

0,5 г (1,78 ммоль) иприфлавона растворяют в 10 мл ацетона в роторной ступке и добавляют 4,0 г (3,70 ммоль) α -циклодекстрина с содержанием влани 10% по массе и 2 мл дистиллированной воды. Легкую суспензию, полученную таким образом, гемогенизируют, растирая до тех пор, пока не выпарится растворитель. После чего продукт, полученный таким образом, сушат в течение 24 ч при 60^оС. Он содержит 11,1% активного ингредиента, и также свободный α -циклодекстрин.

Примеры форм выпуска фармацевтических составов, содержащих иприфлавон-циклодекстриновый клатрат в качестве активного ингредиента, и их биологические испытания.

П р и м е р 4. Сравнивают растворимость известного ямболапа в таблетках, содержащих 200 мг иприфлавона (А), таблетки, содержащей 40 мг иприфлавона в форме β -циклодекстринового клатрата, полученного согласно примеру 1(В), и таблетки, содержащей 200 мг иприфлавона и 330 мг ( β циклодекстрина при 37^оС в 500 мл желудочного сока. Кусочек таблетки помещают в оборудование и определяют количество растворенного материала путем спектрофотометрии при 247 нм.

Составы испытуемых таблеток были следующими, мг:
Таблетка (А) известная как таблетка ямболап Иприфлавон 200 Амилум максдис 36 ПВП 13 Эсма опренг 30 Тальк 7 Стеарат магния 4
350 Таблетка В:
Клатрат, согласно изобретению, содержащий 40 мг иприфлавона 370 ПВП 15
385 Таблетка С: Иприфлавон 200 β -циклодекстрин 330 ПВП 20
550
Результаты испытаний на растворитель приведены в табл. 3.

Из результатов видно, что только 0,62 мг иприфлавона растворяются из обычной таблетки, но в случае с таблеткой, содержащей 1/5 активного ингредиента в форме β -циклодекстринового клатрата, по сравнению с количеством активного ингредиента, присутствующего в обычной таблетке, количество растворившегося активного ингредиента удваивается, и количество растворенного материала на 30% превышает максимальную величину, полученную при использовании обычных таблеток через 2 мин.

В случае с таблеткой, которая содержит иприфлавон и β-циклодекстрин в форме механической смеси, растворение происходило несколько медленнее, но даже в этом случае количество растворенного активного ингредиента было выше, по сравнению с обычной таблеткой.

В испытаниях на всасываемость ЦФИ использовали самцов крыс массой 170-200 г. Спустя 16 ч после обездвижения ввели иприфлавон в дозе 25 мг/кг (группа А), иприфлавон - β -циклодекстриновый клатрат, приготовленный согласно примеру 1 (группа В) и иприфлавон- β -циклодекстриновую смесь (группа С), оба содержат β -циклодекстрин в эквимолярном соотношении по отношению к активному ингредиенту, после этого животным дали пищу для крыс и воду (по желанию).

Материалы для испытания смешали в течение 5 мин в 2 мл 1%-ного раствора целлюлозы и ввели через желудочную трубку. Образцы плазмы собрали через 10, 30 мин и 1,2 и 4 ч после лечения, используя кровь, которая вытекала после ее перерезывания у животных, которым провели анестезию эфиром. Образцы крови поместили в пробирки с гепарином, центрифугировали, подвергли нутч-фильтрованию и хранили глубоко замороженными в ампуле до последующего использования.

Для того, чтобы отобрать образцы мочи, после обработки животных поместили в отдельные метаболитические емкости и собирали отдельно мочу и фекалии в течение 24 ч. Образцы мочи хранили до последующего использования, подвергнув глубокому замораживанию. Концентрацию неизмененного иприфлавона и его основных метаболитов (7-гидроксиизофлавон) в моче и образцах плазмы определяли с помощью жидкостной хроматографии высокого давления.

Для того, чтобы провести жидкостное хроматографирование высокого давления, использовали жидкостной хроматограф типа RP-18 и в колонке обратного тока Zichrosorb (размер зерна в случае с образцом плазмы: 10 μм и в случае с образцами мочи: 5 μм ). Скорость потока элюента: 1,5 мл/мин, длина волны УФ-детектора 254 нм, скорость движения бумажной ленты 0,2 см/мин.

В случае с образцами плазмы в качестве элюента использовали смесь 0,05 М ацетатный буфер (рН 3), ацетонитрил 6,0:40, и в случае с образцами мочи смесь ацетатный буфер: ацетонитрил 55:45. Внутренним стандартом был этаноловый раствор 2-метил-7-метокси-4-нитроизофлавон (100 мг/мл) и для калибрования использовали растворы, включающие 100 мг/мл и 10 мг/мл 7-гидроксиизофлавона в метаноле.

Для того, чтобы подвергнуть анализу образцы плазмы, к 1 мл плазмы добавили 1 мл ацетатного буфера (рН 5) и фермент глюкуронилазу (арилсульфоназа) (100 FU), разбавив в 10 раз 10 мл дистиллированной воды, и инкубировали при 37^оС в течение 24 ч. После инкубирования добавили 50 мл 2н. NaOH, и смесь экстрагировали бензолом и центрифугировали. Отделили органическую фазу, водную фазу подкислили 400 мл 1н. НСl, и после добавления 50 мл раствора внутреннего эталона, экстрагировали повторно 8 мл бензола. Органическую фазу центрифугировали, выпарили, остаток растворили в 100 мл элюента, и для инъекции использовали и измерили 50 мл этого раствора.

Уравнение кривой калибровки: y= 8,2; х= 0,08, коэффициент поправки 0,9999.

Для того, чтобы проанализировать образец мочи, к 0,5 мл мочи добавили 0,5 мл ацетатного буфера (рН 5), и 10 мл фермента β-глюкуронилазы (арилсульфоназа) (1000 FU), и смесь экстрагировали 8 мл бензола и центрифугировали. Органическую фазу отделили, водную фазу подкислили, добавив 400 мл 1н. НСl и после добавления 50 мл раствора внутреннего эталона, его экстрагировали еще 8 мл бензола. Органическую фазу центрифугировали, выпарили и остаток растворили в 100 мл элюента, и инъецировали 10 мл этого раствора в жидкостной хроматографии.

Уравнение кривой калибровки: y= 0,911; х=-0,09, коэффициент поправки 0,9995.

В табл. 4 показаны величины концентрации неизмененного иприфлавона, и в табл. 5 величины концентрации основного метаболита, определенные в крови животных. Группе А ввели иприфлавон per se к группе В клатрат, согласно изобретению, и к группе С смесь иприфлавона и β -циклодекстрина.

На каждом отрезке времени неизмененный иприфлавон можно было обнаружить только в случае группы В, и его количество составляло 50-500 нг/мл. В случае с группой А, аналогично группе С, неизменный иприфлавон можно было обнаружить только через некоторые периоды времени (через 2 и 4 ч). Что касается основного метаболита, то в каждом промежутке времени уровня плазмы были в 10-20 раз выше в группе В, по сравнению с уровнями групп А и С, которые были определены через один и тот же отрезок времени, т.е. величины группы В находятся между 3 и 20 мг/мл, тогда как в случае с группами А и С они находятся в интервале от 0,2 до 1,0 мг/мл. Во всех случаях второй пик появляется в кривой плазмы через 2 ч, что может быть результатом интенсивного энтерогепатитного цикла, и лучшей всасываемости в малом кишечнике.

В табл. 6 показаны результаты жидкостной хроматографии высокого давления образцов мочи. В интервале 0-24 ч в образцах мочи не могли обнаружить неизменный иприфлавон. Однако можно проследить наличие основного метаболита (во всех случаях). Средняя величина содержания 7-гидроксиизофлавона была 952 мг, что соответствовало трехкратному повышению, по сравнению с другими группами. Согласно данному опыту, количество основного метаболита составляет 50-55% от общего количества метаболита, и поэтому общее количество, выделившееся с мочой, в 2 раза выше чем количество, которое определено нами de facto (на самом деле). Принимая во внимание это рассуждение, можно сказать, что в случае с группой В 40%, в то время, как в случае с группами А и С только 10-14% введенной дозы выделяется с мочой.

Согласно вышеупомянутым фактам можно сказать, что после введения крысам иприфлавон- β -циклодекстринового клатрата определили, что можно достичь повышения в 10-15 раз уровня содержания в плазме и в 3 раза повысить количество вещества, выделяющегося с мочой, по сравнению с контрольной группой.

Количество основного метаболита (7-гидроксиизофлавон), выделившегося с мочой, измеренное после перорального введения эквивалентных доз

Использование: в медицине, для лечения остеопороза и остеомаляции. Сущность изобретения: клатрат 7-изопропоксиизофлавона и циклодекстринового полимера формулы , где А - α =, b = или g = циклодекстрин, гептакис-2,6-О-диметил- b -циклодекстрин или гептакис-2,3,6-три-О-метил- b -циклодекстрин, проявляющий активность против остеопореза и остеомаляции. 6 табл.

Клатрат 7-изопропоксиизофлавона и циклодекстринового полимера общей формулы
2A ·
где A = α = β = , или γ - циклодекстрин, гептакис-2,6,О-диметил-О-циклодекстрин или гептакис-2,3,6-три-О-метил- β -циклодекстрин, проявляющий активность против остеопороза и остеомаляции.