Способ получения комплексов включения 7-изопропоксиизофлавона Советский патент 1992 года по МПК C08B37/16 A61K31/735 

Изобретение относится к клатрату 7- изопропоксиизофлавона (иприфлавона), который может найти применение в медицине для лечения остеопороза и остеомаляции.

Известные препараты, содержащие ип- рифлавон, имеют недостаточную терапевтическую эффективность из-за слабой растворимости и всасываемости.

Известен способ получения субстанции иприфлавона.

Характеристики соединения следующие: мол. м. 280,3, т.пл. 113-118°С, растворимость в воде при 25°С 1-42 мг/мл. Она слабо растворимо в ацетоне, но хорошо в хлороформе и диметилформамиде.

Известно, что всасываемость и растворимость фармацевтических составов, обладающих слабой растворимостью, повышается, если их перемалывают с инертными носителями. Например, перемалывание равных количеств иприфлавона, аэросила (или активированного угля, активированной глины, активированной окиси алюминия) в вибромельнице с использованием стальных шариков позволяет получить составы, растворимость которых выше, чем исходного пирифлаво на. Так, продукт с аэросилом имеет растворимость 20,4 мг/мл в 50%-ном водном метаноле через 30 мин при 37°С, в то время как растворимость неизмельченной смеси составляет только 15,0 мг/мл, т.е. растворимость In vitro увеличивается в 1,36 раза. Анализ уровней содержания в крови собак после перорального введения показывает, что иприфлавон нельзя обнаружить в крови. Перемалывание с аэросилом увеличивает всасываемость основного метаболита с 0,152 мпч/мл до 0,485 МР ч/мл, что соответствует увеличению в 3,19 раза.

XI

СЛ vj 4 Ю

оз

Цель изобретения - получение вещества, содержащего 7-изопропоксиизофлавон (иприфлавон) и обладающего Способностью всасывания в фармакологически активной концентрации,

Указанная цель достигается тем, что согласно способу получения комплексов включения 7-изопропоксиизофлавона, имеющего формулу

СН3СН2-0

заключающемуся в том, что 7-изопропоксиизофлавон подвергают взаимодействию с а, /,у -циклодекстрином , гептакис-2,6,0-диме- тил- или 2-гептакис -2,3,6-три-0-метил-/3 - циклодекстрином, или циклодекстриновым полимером с мол. м. 4000 в водной или водно-органической среде, при молярном соотношении 7-изопропоксиизофлавона и циклодекстринового компонента 1:2-3,3, с последующим выделением и сушкой целевого продукта.

Установлено, что растворимость полученного соединения включения In vitro в 10 раз выше по сравнению с растворимостью иприфлавона введенного perse, а уровень содержания в крови основного метаболита выше в 15-20 раз. Установлена всасываемость пирифлавона в неизменной форме и в фармацевтически эффективной концентрации. Одним из доказательств образования соединения включения является увеличение растворимости иприфлавона в водных растворах.

Растворимость иприфлавона в полученных соединениях включения приведена в табл.1.

Повышение растворимости наблюдается при использовании всех исследованных циклодекстриновых компонентов.

Суммируя результаты,- представленные в табл. 1, можно сказать, что растворимость иприфлавонового клатрата в 4 раза выше относительно активного ингредиента, чем растворимость иприфлавона perse, и всасываемость его после перорального введения крысам минимум в 10 раз выше по сравнению с уровнем содержания в крови, измеренном после введения свободного активного ингредиента в той же дозе. Неизменный уровень содержания иприфлавона составляет по крайней мере 25% от общего

количества материала, который всасывается.

При получении предлагаемого соединения включения процесс взаимодействия реагентов осуществляют в водно-органической среде. В качестве органического растворителя можно использовать спирт или кетон. Предпочтительно используют 50%-ный раствор этанола. Выделение целевых продуктов

происходит при охлаждении реакционных растворов. Получают кристаллические продукты. Можно осуществлять смешение в водном ацетоне одновременно с выпариванием растворителя, используя димеб или тримеб

(диметил-циклодекстрин или триметил-цикло- декстрин), или растворимый циклодекстрино- вый полимер, из реакционной смеси можно выделить твердый порошкообразный продукт тем выпаривания, сушки, распыления,

сушки при температуре ниже 0°С, или в случае с димебом путем нагревания раствора.

Пример 1. Получение иприфлавон- -циклодекстринового клатрата, имеющего молярное соотношение 1:2.

11,0 г (39,2 ммоль) иприфлавона и 114,3 г (338,3 ммоль) / -циклодекстрина с содержанием влаги 12,36% растворяют в 2,25 л водного раствора этанола, составляющего 50 об.%, при 80°С, интенсивно перемешивая, и дают остыть до комнатной температуры. Осажденный кристаллический продукт отфильтровывают и сушат в течение 24 ч при 60°С, что дает 96,4 г продукта в виде рыхлого порошка белого цвета. Размер частиц менее 90 /и м. Содержание иприфлавона 10,8 мае. % иприфлавон: / -циклодекстрин 1:2, выход относительно активного ингредиента 94,7% (исходное соотношение иприфлафон: ft -циклодекстрин 1:2,3).

Для того, чтобы доказать, что указанный продукт действительно является клатратом, проводят различные анализы: термоаналитический анализ, дифракцию рентгеновских

лучей и анализ растворимости.

Термоаналитическое поведение механической смеси и свободных компонентов является почти одинаковым, но изменения в клатрате, происходящие из-за нагревания,

можно наблюдать только одновременно с разложением циклодекстрина. При испытании механической смеси дифференциальной сканирующей калориметрией (ДСК) при 115°С устанавливают, что эндотермический

пик соответствует точке плавления иприфлавона, но в случае с клатратом пик не наблюдается, Механическая смесь показывает непрерывную потерю массы - в соответствии с уровнем содержания иприфлавона в интервале между 130°С и 250°С, но

и в случае с клатратами не наблюдают какой-либо потери в массе или высвобождении органических веществ в том же температурном интервале (анализ термического расширения, АТР).

Диаграмма, полученная в результате рентгеноструктурного анализа порошка механической смеси, состоит из добавочных сумм диаграмм порошковых компонентов. Однако диаграмма порошка из клатрата содержит меньше пиков и новые пики (2 6Р 6.7; 7,8; 20,9), характеристические для клатрата и отличающиеся от характеристических пиков / -циклодекстрина (2 0° 4.5; 10,6;

12,3), а у иприфлавона составляют (2 6е 5,8; 11,5; 17,3; 22.0), указывая на новую кристаллическую структуру и, таким образом, подтверждая косвенно образование клзтра- та.

Для того, чтобы провести испытания, 250 мл дистиллированной воды помещают в колбу емкостью 500 мл и нагревают до 37°С. Затем продукт в количестве, соответствующем 50 мг активного ингредиента, добавляют, затем суспензию, полученную таким образом, перемешивают при 100 об/мин, используя магнитную мешалку. Через определенные интервалы отбирают образцы проб по 2-6 мл и фильтруют на стеклянном фильтре, и после разбавления фильтраты исследуют фотометрически в смеси вода; этанол в соотношении 1:1,

Полученные результаты приведены в табл. 2.

Растворение свободного активного ингредиента является относительно медленным, оно достигает величины насыщения иприфлавона {около 1,5 мг/мл) через 40-50 мин. В случае с образцами, содержащими иприфлавон - ft -циклодекстриновый клат- рат, максимальную концентрацию растворенного иприфлавона получают уже через 1 мин, т.е. активный ингредиент растворяется сразу же - так же происходит мгновенное растворение и в начале концентрация активного ингредиента может быть такой же высокой, как и двойной уровень насыщения. Растворение смеси иприфлавона и / -циклодекстрина является более медленным, концентрация растворенного активного ингредиента достигает величины, определенной тогда, когда растворяют клатрат,тольк о через 30-40 мин.

Растворимость активного ингредиента определяют также при различных уровнях содержания рН. Полученные кривые растворимости при рН 1,3 (это соответствует кислотности желудочного сока, HCI) и при рН 7.6 (это соответствует величине рН кишечника, фосфатный буфер) существенно не отличаются от величин растворимости, полученных в дистиллированной воде, соответственно растворимость активного ингредиента не зависит от рН в испытуемом интервале рН.

Пример 2. Получение иприфлавона - / -циклодекстринового клатрата, имеющего молярное соотношение 1:2.

0,5 г (1,78 ммоль) иприфлавона растворяют в 50 мл 96%-ного этанола, и раствор, полученный таким образом, добавляют по каплям к раствору из 8,0 г (5,35 ммоль) /3 -циклодекстрина с содержанием влаги

13,3% в 50 мл дистиллированной воды в течение 2 ч, затем смеси дают остыть до комнатной температуры. После интенсивного перемешивания еще в течение 16 ч полученный продукт отфильтровывают и сушат в течение 24 ч при 60°С, чтобы получить 5,5 г продукта.

Содержание иприфлавона: 7,9 мас.%, молярное соотношение иприфяавон: р - циклодекстрин 1:2,29. Выход относительно активного ингредиента 87%. Продукт также содержит свободный циклодекстрин (исходное соотношение иприфлавон: у - циклодекстрин 1:3).

Пример 3. Получение иприфлавон-циклодекстринового клатрата, имеющего молярное соотношение 1:2.

0,5 г (1,78 ммоль) иприфлавона растворяют в 10 мл ацетона в роторной ступке и добавляют 4,0 г (3,70 ммоль) а-циклодекстрина с содержанием влаги 10 мас.% и 2 мл дистиллированной воды. Легкую суспензию, полученную таким образом, гомогенизируют, растирая до тех пор, пока не выпаривается растворитель. После этого

продукт, полученный таким образом, сушат в течение 24 ч при 60°С. Он содержит 11,1% активного ингредиента и также свободный а -циклодекстрин. Молярное соотношение иприфлавона к. а -циклодекстрину составляет 1:1,1.

Примеры форм выпуска фармацевтических составов, содержащих иприфлавон- циклодекстриновый кяатрат в качестве активного ингредиента, и их биологические

испытания.

Пример 4. Получение комплекса включения иприфлавон-Димеб с молярным соотношением 1:2.

1,2 г (1,03 ммоль) Димеба растворяют в

Ю мл дистиллированной воды и добавляют 0,1 г (0,37 ммоль) иприфлавона. Полученную суспензию взбалтывают 4 дня, затем фильтруют на фильтре G4 и после этого осушают, вымораживают с получением 1,25 г продукта. Он содержит 5,67% активного компонента. Выход по активному компоненту 71% (молярное соотношение иприфлавон : Ди- меб равно 1:2,8).

Пример 5. Получение комплекса включения иприфлавон-Тримеб с молярным соотношением 1:2.

2,03 г (1,73 ммоль) Тримеба растворяют в 250 мл 50%-ного этанола и добавляют0,14 г (0,5 ммоль) иприфлавона. Полученный раствор перемешивают, затем высушивают разбрызгиванием с получением 1,96 г продукта. Он содержит 6,9% активного компонента. Выход по активному компоненту составляет 96,6% молярное соотношение иприфлавон:тримеб равно 1:3,5).

Пример 5. Получение комплекса включения иприфлавон-циклбдекстрино- вый полимер с молярным соотношением 1:2.

2 г (0,2 ммоль) циклодекстринового полимера со средней мол. м. 4000 растворяют в 250 мл 50%-ного этанола, затем поступают аналогично примеру 2. Количество полученного продукта составляет 1,85 г, содержание в нем активного компонента 7,2%. Выход по активному компоненту составляет

95,1%.

Пример 7. Сравнивают растворимость известного препарата, содержащего иприфлавон-ямболана в таблетках, содержащих 200 мг иприфлавона (А), таблетки, содержащей 40 мг иприфлавона в форме /3 -циклодекстринового клатрата, полученного согласно примеру 1, и таблетки, содержащей 200 мг иприфлавона и 330 мг -циклодекстрина при 37°С в 500 мл желудочного сока. Кусочек таблетки помещают в оборудование и определяют количество растворенного материала путем спектрофо- тометрии при 247 нм.

Составы испытуемых таблеток следующие: таблетка А (известная как таблетка ям- болап, К-020484), мг: иприфлавон 200: амилум максдис 36; лактоза 60: ПВП 13; эсма спренг 30; тальк 7; стеарат магния 4.

Таблетка В.

Предлагаемый клатрат, содержащий, мг: 40 мг иприфлавона 370; ПВП (поливи- нилпирролидон) 15.

Таблетка С, мг: иприфлавон 200, / -цик- лодекстрин 330; ПВП 20.

Результаты исследований приведены в табл. 3.

Из результатов видно, что только 0,62 мг иприфлавона растворяются из обычной таблетки, но в случае с таблеткой, содержащей одну пятую активного ингредиента в форме -циклодекстринового клатрата, по сравнению с количеством активного ингредиента, присутствующего в обычной таблетке, количество растворившегося активного ингредиента удваивается и количество

растворенного материала на 30% превышает максимальную величину, полученную при использовании обычных таблеток через 2 мин. В случае с таблеткой, которая содержит иприфлавон и а -циклодекстрин вформе механической смеси, растворение происходит несколько медленнее, но даже в этом случае количество растворенного активного ингредиента выше по сраанению с обычной таблеткой.

В испытаниях на всасываемость используют самцов крыс весом 170-200 г. Спустя 16ч после обездвижения вводят иприфлавон в дозе 25 мг/кг (группа А), иприфлавон- /3-циклодекстриновый клатрат,

приготовленный согласно примеру 1 (группа В) и иприфлавон- /3 -циклодекстриновую смесь (группа С) - оба содержат / -циклодекстрин в эквимолярном соотношении по отношению к активному ингредиенту, после

этого животным дают пищу, для крыс воду (по желанию) ad libitum.

Материалы для испытания смешивают в течение 5 мин в 2 мл 1 %-ного раствора целлюлозы и вводят через желудочную трубку.

Образцы плазмы собирают через 10; 30 мин и 1; 2 и 4 ч после лечения, используя кровь, которая вытекает из Vena femoralis после ее перерезывания у животных, которым проводят анестезию эфиром. Образцы крови помещают в пробирки с гепарином,

центрифугируют, подвергают нутч-фильтрованию и хранят глубоко замороженными в

ампуле до последующего использования.

Для того, чтобы отобрать образцы мочи,

после обработки животных помещают в отдельные метаболические емкости, и собирают отдельно мочу и фекалии в течение 24 ч. Образцы мочи хранят до последующего использования, подвергнув глубокому замораживанию. Концентрацию неизменного иприфлавона и его основных метаболитов (7-гидроксиизофлавон) в моче и образцах плазмы определяют с помощью жидкостной хроматографии высокого давления.

Для того, чтобы провести жидкостное хроматографирование высокого давления, используют жидкостной хроматограф типа RP-18 и в колонке обратного тока Lichrosorb (размер зерна в случае с образцами плазмы

10 мм и в случае с образцами мочи 5 //м). Скорость потока элюента1 1,5 мл/мин, длина волны УФ-детектора 254 нм, скорость движения бумажной ленты 0,2 см/мин,

В случае с образцами плазмы в качестве элюента используют смесь: 0,05 М ацетатный буфер (рН 3): ацетонитрил - 60:40, и в случае с образцами мочи смесь ацетатный буфер : ацетонитрил - 55 : 45. Внутренний стандарт - этаноловый раствор 2-метил-7- метокси-4-нитроизофлавон (100 (л г/мл), и для калибрования используют растворы, включающие 100 /г г/мл и 10 fi г/мл 7-гид- роксиизофлавона в метаноле.

Для того, чтобы подвергнуть анализу образцы плазмы, к 1 мл плазмы добавляют 1 мл ацетатного буфера (рН 5) и фермент глюку ронидазу (арилсульфоназа) (100 FV),разбавив в 10 раз 10 мл дистиллированной воды, и инкубируют при 37°С в течение 24 ч. После инкубирования добавляют 50 мл NaOH, смесь экстрагируют бензолом и центрифугируют. Отделяют органическую фазу, водную фазу подкисляют 400 мл 1Н HCI, и после добавления 50 мл раствора внутреннего этанола, экстрагируют повторно 8 мл бензола. Органическую фазу центрифугируют, выпаривают остаток, растворяют в 100 рл элюента, используют для инъекции и измеряют 50 /и л этого раствора

Уравнение кривой калибровки: у 8,2х

-0,08; коэффициент поправки 0,9999.

Для того, чтобы проанализировать образец мочи, к 0,5 мл мочи добавляют 0,5 р л ацетатного буфера (рН 5) и ЮуЯл фермента fi -глюкуринидазы (арилсульфатазз) (1000 FV) и смесь экстрагируют 8 мл бензола и центрифугируют. Органическую фазу отделяют, водную фазе подкисляют,добавив 400 мл 1Н HCI, и после добавления 50 мл раствора внутреннего этанола его экстрагируют еще 8 мл бензола. Органическую фазу центрифугируют, выпаривают и остаток растворяют в 100 ря элюента и инъекцмру- ют 10 мл этого раствора в жидкостный хроматограф.

Уравнение кривой калибровки: у 0,911х - 0,09; коэффициент поправки 0,9995.

В табл. 4 показаны величины концентрации неизменного иприфлавона; в табл. 5

-величины концентрации основного метаболита, определенные в крови животных.

Группе А вводят иприфлавон per se, группе В - предлагаемый клатрат и группе С - омесь иприфлавона и циклодекстри- на. На каждом отрезке времени неизменный иприфлавон можно обнаружить только в случае группы В и его количество составляет 50-500 нг/мл. В случае с группой А, аналогично группе С. неизменный иприфлавон можно обнаружить только через некоторые периоды времени (через 2 и 4 ч). Что

касается основного метаболита, то в каждом промежутке времени уровни плазмы в 10- 20 раз выше в группе А по сравнению с уровнями групп А и С, которые определены

через один и тот же отрезок времени, т.е. величины группы В находятся между 3 и 20 /Аг/мл, тогда как в случае с группами А и С находятся в интервале от 0,2 до 1,0 fi г /мл. Во всех случаях второй пик появляется в

кривой плазмы через 2 ч, что может быть результатом интенсивного энтерогепатит- ного цикла и лучшей всасываемости в малом кишечнике.

В табл. 6 показаны результаты жидкостной хроматографии высокого давлений образцов мочи. В интервале 0-24 ч в образцах мочи не могут обнаружить неизменный иприфлавон. Однако можно проследить наличие основного метаболита (во всех случаях).

Средняя величина содержания 7-гидрокси- изофлавона , что соответствует трехкратному повышению по сравнению с другими группами. Согласно опыту количество основного метаболита составляет 5055% от общего количества метаболита, и поэтому общее количество, выделившееся с мочой, в 2 раза выше, чем количество, которое определено de facto.

Таким образом, в случае с группой В

40%, в то время как в случае с группами А и Столько 10-14% введенной дозы выделяется с мочой.

После введения крысам иприфлавон - /3-цмклодекстринового клатрата определяют, что можно достичь повышения в 10-15 раз уровня содержания в плазме и в 3 раза повысить количество вещества, выделяющегося с мочой, по сравнению с контрольной группой.

Формулаизобретения

Способ получения комплексов включения 7-изопропоксиизофлавона, имеющего формулу

45

СН СИго50

обладающих способностью всасывания в фармакологически активной концентрации, заключающийся в том, что 7-изопропоксии- зофлавон подвергают взаимодействию с а,(3,у -циклодекстрином. гептакис-2,6-0- диметил- или 2-гептакис-2,3,6-три-0-метил- fi -циклодекстрином, или циклодекстрино- вым полимером с мол. м/4000 в водной или

водно-органической среде, при молярном соотношении 7-изопропоксиизофлавона и ццклодекстринового компонента 1:2-3,5 с

последующим выделением и сушкой целевого продукта.

Использование: в медицине для лечения остеопорозз и остеомаляции, Сущность: 7- изопроксиизофлавон подвергают взаимодействию с а«Д у -циклодекстрином, гептакмс-2,6-0-диметил- или 2-гептакис- 2,3,6-три-0-метил-/3 -циклодекстрином или циклодекстриновым полимером с мол. м. 4000 в водной или водно-органической среде. Молярное соотношение 7-изопропокси- изофлавон циклодекстрмновый компонент равно 1.2-3,5. Целевой продукт выделяют и сушат. 6 табл.

Таблица1

Таблица2

,17

,5

k

О О О

О

о

о

о

о

о

0,078

о

0,095 0,041

о о о о о

0,065 0,055 0,073 0,468

о,14з

0,194 0,271 0,354 0,203 0,514 0,402 0,214 0,148

0,363

0,054

О

О

О

ТаблицаЗ

Таблица

0,479

О

О

О

О

О

О

О

О

0,081

о о о о о о о о

15

1757472

16 Т а блица 5

Таблицаб