ГЛИКОПЕПТИД β-ГЛИЦИРРИЗИНОВОЙ КИСЛОТЫ С МЕТИЛОВЫМ ЭФИРОМ ГЛИЦИЛ-L-ВАЛИНА, ПРОЯВЛЯЮЩИЙ АНТИ-СПИД-АКТИВНОСТЬ Российский патент 1994 года по МПК C07J53/00 C07J63/00 A61K31/705 

Изобретение относится к новому биологически активному соединению, конкретно, к гликопептиду β -глицирризиновой кислоты с метиловым эфиром глицил-L-валина: 1-0-[(3 β, 20 β)-11-оксо-20-оксо-20-(N-глицил-L-валина метиловый эфир)-30-норолеан-12-ен-3-ил] -2-0-[ β -D-6-оксо-6-дезокси- 6-(N-глицил-L-валина метиловый эфир)-глюкопиранозил- β -D-6-оксо-6-дезокси-6-(N-глицил-L-валина метиловый эфир)-глюко- пиранозид формулы (I)
проявляющему анти-СПИД активность. Указанное соединение и его свойства в литературе не описаны.

В настоящее время во всем мире интенсивно проводятся исследования по поиску средств лечения СПИДа. Известно уже более 50 препаратов, подавляющих репродукцию вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) in vitro [1]. Одним из таких препаратов является глицирризиновая кислота (ГК) - активное начало экстракта солодки [2-6] . Установлено, что введение ГК в высоких дозах (800-1600 мг/день) больным СПИДом вызывает у них увеличение содержания ТЧ лимфоцитов и снижение количества вирусного антигена [5]. Механизм антивирусного действия ГК до настоящего времени остается неустановленным. Однако, ГК малоэффективна как ингибитор репликации ВИЧ на хронически инфицированных клетках.

Целью изобретения является поиск нового соединения в ряду производных β-глицирризиновой кислоты, обладающих анти-СПИД активностью.

Поставленная цель достигается гликопептидом β-глицирризиновой кислоты формулы (I), проявляющим анти-СПИД активность.

Фармакологические свойства соединения I.

Противовирусная активность соединения I была изучена на модели первично инфицированных ВИЧ-1 лимфоидных клеток МТ-4. Раствор препарата в ДМСО (20 мг/мл - 50 мг/мл) вносили в суспензию инфицированных ВИЧ-1 клеток до конечной концентрации препарата 100-1000 мкг/мл. ДМСО до конечной концентрации 0,5-2,0% . В предварительных опытах было показано, что ДМСО в концентрациях 0,5-2,0% не блокирует репродукцию ВИЧ-1. Об ингибировании репродукции ВИЧ-1 в клетках судили по снижению активности обратной транскриптазы и снижению накопления вирусного антигена (методом иммуноферментного анализа) в культуральной жидкости на 4 сутки культивирования по сравнению с контролем (без добавления препарата). В качестве референс-препаратов использовали один из наиболее эффективных для лечения СПИДа препаратов - азидотимидин (АЗТ), механизм действия которого связан с блокированием вирусной обратной транскриптазы и терминированием синтеза вирусной ДНК [7], и β -глицирризиновую кислоту (β -ГК), эффективно ингибирующую репродукцию ВИЧ-1 в клетках. Основным недостатком АЗТ является его высокая токсичность [8]. Установлено, что исследованное соединение (I) эффективно ингибирует репродукцию ВИЧ-1 в культуре клеток в концентрации от 0,1 до 1,0 мг/мл. Противовирусная активность соединения (I) аналогична активности АЗТ и β -ГК (ингибирование на 98-99%). В разведении 100 и 250 мкг/мл гликопептид (I) подавляет репликацию ВИЧ-1 эффективнее β -ГК. Соединение (I) менее токсично для культуры клеток, чем АЗТ. Снижение концентрации препарата приводит к уменьшению токсического воздействия на культуру клеток.

Гликопептид (I) менее токсичен, чем АЗТ. LD₅₀ гликопептида (I) ≈ 8000 мг/кг.

Данное соединение относится к классу малоопасных веществ.

Синтез гликопептида (I) проводили дициклогексилкарбодиимидным методом пептидного синтеза без предварительной защиты ОН-групп углеводной части молекулы гликозида. Выход гликопептида (I) составил 49%. Аналитически чистый продукт получали путем перекристаллизации из смеси ацетона-гексана (45%).

Таким образом, предложено новое малоопасное производное β -глицирризиновой кислоты - гликопептид (I), эффективно ингибирующий репродукцию ВИЧ-1 in vitro (в культуре клетка МТ-4), менее токсичный, чем азидотимидин, обладающий анти-СПИД активностью, аналогичной активности АЗТ и β -ГК.

П р и м е р 1. Изучение анти-СПИД активности.

Противовирусная активность представленного гликопептида (I) была изучена на модели первично инфицированных ВИЧ-1 лимфоидных клеток МТ-4. Раствор препарата в ДМСО (20 - 50 мг/мл) вносили в суспензию инфицированных ВИЧ-1 клеток до конечной концентрации препарата 100-1000 мкг/мл, ДМСО до конечной концентрации 0,5-2,0% . В предварительных экспериментах было установлено, что ДМСО в концентрациях 0,5-2,0% не блокирует репродукцию ВИЧ-1. Об ингибировании репродукции ВИЧ в клетках судили по снижению активности обратной транскриптазы и снижению накопления вирусного антигена (методом иммуноферментного анализа) в культуральной жидкости на 4 сутки культивирования по сравнению с контролем (без добавления препарата). Для сравнения использовали один из наиболее эффективных для лечения СПИДа препаратов - азидотимидин (АЗТ), механизм действия которого связан с блокированием вирусной обратной транскриптазы и терминированием синтеза вирусной ДНК, и β -глицирризиновую кислоту (β -ГК), эффективно ингибирующую репродукцию ВИЧ-1 в клетках. В таблице 1 приведены результаты проведенных экспериментов. Установлено, что исследованное соединение (I) эффективно ингибирует репродукцию ВИЧ-1 в культуре клеток в концентрациях от 0,1 до 1,0 мг/мл. По антивирусной активности (анти-ВИЧ) соединение I аналогично АЗТ и β -ГК (ингибирование на 98,1-98,9% ). Следует отметить, что в концентрациях 100 и 250 мкг/мл соединение I подавляет репликацию ВИЧ-1 эффективнее β -ГК.

Соединение I менее токсично для культуры клеток, чем АЗТ, причем снижение концентрации препарата приводит к уменьшению токсического воздействия на культуру клеток. Данные приведены в таблице.

П р и м е р 2. Получение гликопептида (I).

а) Гидрохлорид метилового эфира глицил-L-валина -Gly-L-Val (ОМе).HСl (1а)
К суспензии 5 г (28,7 моль) Gly-L-Val (Reanal) в 200 мл сухого метанола прибавляют по каплям 20 мл перегнанного хлористого тионила при охлаждении в ледяной бане и перемешивают 2 ч до растворения осадка, выдерживают 24 ч при комнатной температуре, упаривают растворитель в вакууме при температуре 30^оС, образовавшийся сироп обрабатывают сухим эфиром и сушат в вакууме до постоянного веса.

Выход 3,0 г (46,6%).

[α ]_D²⁰ = -87,5^о (с = 0.02; 40% EtOH)
Найдено, %: С 41,97; Н 7,27; N 11,94; Cl 15,42.

C₈H₁₆N₂O₃.HCl.

Вычислено, %: C 42,75; H 7,63; N 12,46; Cl 15,80.

б) Гликопептид β -глицирризиновой кислоты с метиловым эфиром глицил-L-валина (I)
К раствору 1,64 г (2 ммоль) β -глицирризиновой кислоты (92-95%) в 50 мл сухого ДМФА при охлаждении в ледяной бане прибавляют 1,5 г (7 ммоль) Gly-L-Val (ОМе).HCl (1а), 1,4 г (6,5 ммоль) N,N'-дициклогексилкарбодиимида и по каплям 5 мл сухого пиридина, перемешивают смесь при охлаждении 1 ч, выдерживают при комнатной температуре 48 ч с периодическим перемешиванием. Отфильтровывают осадок дициклогексилмочевины, фильтрат выливают в 400 мл холодной воды, подкисленной лимонной кислотой, отфильтровывают белый осадок, промывают его водой, высушивают. Получают 1,3 г (48,7%) гликопептида (I), который перекристаллизовывали из смеси ацетона-гексана. Выход гомогенного по ТСХ продукта 1,2 г (44,9%). R(f) = 0,45 (хлороформ-метанол-вода = 45 : 10 : 1), 0,33 (хлороформ-спирт = 7 : 1). [α ]_D²⁰ = +25^о (с = 0,03, метанол). т.пл. 169-171^оС.

ИК, ν, см^-1: 3600-3200 (ОН, NH); 1740 (СООМе), 1660 (С₁₁ = О), 1580, 1530 (СОNH).

УФ, λ_max^МеОН (lg ε) : 249 нм (3,95).

Найдено, %: С 60,20; 48,21; N 6,44.

С₆₆Н₁₀₄N₆О₂₂.

Вычислено, %: С 59,44; Н 7,86; N 6,30.

Использование: в качестве средства с анти-СПИД-активностью. Сущность: продукт: 3-0-[2-0- b -D-глюкопиранозилураноил)- b -D-глюкопиранозилураноил] -(3 b , 20 b )-11,30-диоксо-30-(N-6-аминоурацил)-30-норолеан-12-ен, выход 98,9% БФ C₄₆H₆₅N₃O₁₇ , т.пл. 261 - 264°С. Вещество способно эффективно ингибировать репродукцию ВИЧ-1 в культуре клеток. 1 табл.

Гликопептид β-глицирризиновой кислоты с метиловым эфиром глицил-L-валина

где R - Gly - L - Val(OMе),
проявляющий анти-СПИД-активность.