Изобретение относится к новым биологически активным соединениям, конкретно, к гликопептиду β -глицирризиновой кислоты с дибутиловым эфиром L-глутаминовой кислоты: 3-0-[2-0-(N- β-D-глюкопиранозируланоил-L-глутаминовой кислоты дибутиловый эфир)-N- β -D-глюкопираноизилураноил-L-глутаминовой кислоты дибутиловый эфир]-(3 β, 20 β)-11,30-диоксо-30-(N-L-глутаминовой кислоты дибутиловый эфир)-30-норолеан-12-ена формула (1)
Ylu(ОВи)2, проявляющему анти-СПИД активность.
Указанное соединение и его свойства в литературе не описаны.
В настоящее время в мире интенсивно проводятся исследования по поиску средств лечения СПИДа. Известно уже более 50 препаратов, подавляющих репродукцию вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) in vitro [1]. Одним из таких препаратов является глицирризиновая кислота (ГК). Японскими исследователями было установлено, что ГК эффективно ингибирует репродукцию ВИЧ [2-6]. Показано также, что введение ГК в высоких дозах (800-1600 мг/день) больным СПИДом вызывает у них увеличение содержания лимфоцитов и снижение количества вирусного антигена [5]. Механизм антивирусного действия ГК до настоящего времени остается неустановленным. Однако, ГК малоэффективна как ингибитор репликации ВИЧ на хронически инфицированных клетках.
Целью изобретения является поиск новых соединений в ряду производных β -глицирризиновой кислоты, обладающих анти-СПИД-активностью.
Поставленная цель достигается гликопептидом β -глицирризиновой кислоты формула I, проявляющей анти-СПИД-активность.
Фармакологические свойства описываемого соединения были изучены в отделе культивирования и диагностики ретровирусов НПО "Вектор".
Противовирусная активность соединения I изучалась на модели первично инфицированных ВИЧ-1 лимфоидных клеток МТ-4. Раствор гликопептида в ДМСО (25 мг/мл - 50 мг/мл) вносили в суспензию инфицированных ВИЧ-1 клеток до конечной концентрации препарата 250-500 мкг/мл, ДМСО до конечной концентрации 0,5-2,0%. В предварительных опытах было установлено, что ДМСО в концентрациях 0,5-2,0% не блокирует репродукцию ВИЧ-1. Об ингибировании репродукции ВИЧ-1 в клетках судили по снижению активности обратной транскриптазы и снижению накопления вирусного антигена (методом иммуноферментного анализа) в культуральной жидкости на 4 сутки культивирования по сравнению с контролем (без добавления препарата).
В качестве препаратов сравнения использовали очищенную β -глицирризиновую кислоту (0,2-0,5%), эффективно ингибирующую репродукцию ВИЧ-1 в клетках in vitro, и один из наиболее эффективных для лечения СПИДа препаратов - азидотимидин (АЗТ), механизм действия которого связан с блокированием вирусной обратной транскриптазы и термированием синтеза вирусной ДНК [7].
Основным недостатком этого препарата является его высокая токсичность [8].
Установлено, что соединение (I) эффективно ингибирует репродукцию ВИЧ-1 в культуре клеток в концентрациях от 0,25 до 0,50 мг/мл (на 99,3-99,5%) (таблица). По уровню выявленной противовирусной активности гликопептид (I) аналогичен АЗТ и β-ГК. Препарат менее токсичен по сравнению с АЗТ, причем снижение концентрации препарата приводит к уменьшению токсического воздействия на культуру клеток (увеличению % живых клеток).
При использовании β -ГК и гликопептида (I) в равных концентрациях (250 мкг/мл) анти-ВИЧ - активность соединения I была более выражена.
ЛД50 гликопептида (I) = 650 (500-845) мг/кг (внутрибрюшинно) и ≈ 7000 мг/кг (внутрижелудочно) мыши. Данное соединение относится к классу малоопасных веществ. Соединение (I) менее токсично, чем азидотимидин, количество живых клеток (%) в случае гликопептида (I) было в 2 раза больше, чем у АЗТ. При введении в желудок препарат (I) также менее токсичен, чем исходная β-ГК, ЛД50 которой составляет ≈ 5000 мг/кг (мыши).
Выход гликопептида (I) 80%. Аналитически чистый продукт получали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле при элюции смесью растворителей хлороформ-метанол = 50 : 1 и 25 : 1 (v/v).
Таким образом, новое матолоксичное производное β -глицирризиновой кислоты гликопептид (I), эффективно ингибирует репродукцию ВИЧ-1 in vitro (в культуре клеток МТ-4), менее токсичный, чем азидотимидин, аналогичный по анти-СПИД - активности АЗТ и β -ГК.
Сущность изобретения демонстрируется следующими примерами:
П р и м е р 1. Изучение анти-СПИД активности.
Противовирусная активность гликопептида (I) изучена на модели первично инфицированных ВИЧ-1 лимфоидных клеток МТ-4 (in vitro). Растворы препаратов в ДМСО (20 мг/мл - 50 мг/мл) вносили в суспензию инфицированных ВИЧ-1 клеток до конечной концентрации препарата 250-500 мкг/мл, ДМСО до конечной концентрации 0,5-2,0% . В предварительных экспериментах было установлено, что ДМСО в концентрациях 0,5-2,0% не блокирует репродукцию ВИЧ-1. Об ингибировании репродукции ВИЧ-1 в клетках судили по снижению активности обратной транскриптазы и снижению накопления вирусного антигена (методом иммуноферментного анализа) в культуральной жидкости на 4 сутки культивирования по сравнению с контролем (без добавления препарата). В качестве препаратов сравнения использовали один из наиболее эффективных для лечения СПИДа препаратов - азидотимидин (АЗТ), механизм действия которого связан с блокированием вирусной обратной транскриптазы и термированием вирусной ДНК, и β -глицирризиновую кислоту, эффективно ингибирующую репродукцию ВИЧ-1 в клетках. Результаты проведенных экспериментов приведены в таблице.
Как видно из данных таблицы, исследованное соединение I эффективно ингибирует репродукцию ВИЧ-1 в культуре клеток в указанных концентрациях (на 98,5-99,5%). По уровню выявленной противовирусной активности производное β -ГК (I) аналогично АЗТ и β -ГК. В разведении 250 мкг/кг гликопептид (I) эффективнее β -ГК в той же концентрации. Соединение (I) менее токсично по сравнению с АЗТ, т.к. количество живых клеток значительно (≈ в 2 раза) выше, чем в случае АЗТ. Снижение концентрации препарата приводит к снижению токсического воздействия на культуру клеток.
П р и м е р 2. Получение гликопептида (I).
К раствору 1,64 г (2 ммоль) очищенной β -глицирризиновой кислоты (92-95% ) в 50 мл сухого диоксана при 0оС прибавляют 1,2 г (10,4 ммоль) N-гидроксисукцинимида и 1,3 г (6 ммоль) N,N'-дициклогексилкарбодиимида и перемешивают при этой температуре 2,5-3 часа, при комнатной 6-7 час и оставляют смесь на ночь при 4-8оС. Отфильтровывают выпавший осадок дициклогексилмочевины, к фильтрату после охлаждения в бане со льдом прибавляют 2,0 г L-Glu(OBu)2 ˙HCl (6,8 ммоль) и по каплям 1,0 (9,8 ммоль) сухого триэтиламина и 5 мл сухого диметилформамида, выдерживают смесь при комнатной температуре с периодическим перемешиванием 24 часа. Растворитель упаривают в вакууме, остаток растворяют в хлористом метилене (200 мл), промывают последовательно 5% HCl, водой, 5% NaHCO3, водой и сушат над MgSO4. Упариванием растворителя в вакууме получают 2,48 г (80%) гликопептида (I), который хроматографировали на колонке из силикагеля L (100/250, ЧССР), элюируя смесью хлороформа-метанола 50 : 1, 25 : 1 и 10 : 1 (v/v). Смесью 50 : 1 и 25 : 1 вымывают 1,59 г (64% ) аналитически чистого продукта (I) в виде аморфного вещества желтоватого цвета. Rf = 0,5 (хлороформ-метанол-вода = 45 : 10 : 1) (силуфол). [α]D20= +30o (с = 0,02; метанол).
ИК, ν см-1: 1740 (COOBu), 1690 (CONH, амид I); 1650 (C11 = 0); 1530 (CONH, амид II).
УФ, λmaxMeOH (lg ε): 249 нм (4,09).
Найдено, %: C 60,19; H 8,24; N 2,73.
C81H131N3O25.
Вычислено, %: C 60,30; H 8,53; N 2,72.
Растворим в ацетоне, метаноле, тетрагидрофуране, диоксане, спирте, диметилформамиде.
Использование: в качестве средства с анти-СПИД-активностью. Сущность: изпродукт 3-0-[2-0-(N- b -D-глюкопиранозилураноил-L-глутаминовой кислоты дибутиловый эфир)-N- b -D-глюкопиранозилураноил-L-глутаминовой кислоты дибутиловый эфир]-(3 b , 20 b )-11,30-диоксо-30-(N-L-глутаминовой кислоты дибутиловый эфир)-30-норолеан-12-ена БФ C81H131N3O25, выход 64%, Rf = 0,5( CH3Cl : CH3OH : H2O = 45 : 10 : 1). [α]
Гликопептид β - глицирризиновой кислоты с дибутиловым эфиром L-глутаминовой кислоты общей формулы
где R - L - Glu (OBu)2,
проявляющий анти-СПИД-активность.
| Механическая топочная решетка с наклонными частью подвижными, частью неподвижными колосниковыми элементами | 1917 |
|
SU1988A1 |
