ГЛИКОПЕПТИД β-ГЛИЦИРРИЗИНОВОЙ КИСЛОТЫ С ДИМЕТИЛОВЫМ ЭФИРОМ L-АСПАРАГИНОВОЙ КИСЛОТЫ, ПРОЯВЛЯЮЩИЙ АНТИ-СПИД-АКТИВНОСТЬ Российский патент 1994 года по МПК C07J53/00 C07J63/00 A61K31/705 

Изобретение относится к новому химическому соединению, конкретно к гликопептиду β -глицирризиновой кислоты с диметиловым эфиром L-аспарагиновой кислоты: 3,0-[2-0-(N- β -Д-глюкопиранозил - ураноил-L-аспарагиновой кислоты диметиловый эфир)-N- β -Д-глюкопиранозил ураноил-L-аспарагиновой кислоты диметиловый эфир] - (3 β, 20 β)-11,30-диоксо-30-(N-L-аспарагиновой кислоты диметиловый эфир)-30-норолеан-12-ена формулы I
, где I R - L - Asp (OMe)₂;
II R - OH проявляющему анти-СПИД-активность.

Указанное соединение и его свойства в литературе не описаны.

В настоящее время во всем мире интенсивно ведутся исследования по поиску средств лечения СПИДа. Выявлены ряд соединений, ингибирующих репликацию вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) in vitro: рибавирин, фосфорномуравьиная кислота, азидотимидин (АЗТ), 2,3-дидезоксинуклеозиды и т.д. Начато клиническое применение ряда соединений, но результаты еще не полностью интерпретированы [1, 2].

β -Глицирризиновая кислота - активное начало экстракта корня солодки. В последние годы было обнаружено рядом японских ученых, что глицирризиновая кислота является эффективным ингибитором репликации ВИЧ, одновременно действует как иммуностимулятор [1-4]. Поэтому глицирризиновая кислота считается эффективным терапевтическим агентом для лечения СПИД. Однако, глицирризиновая кислота малоэффективна как ингибитор репликации ВИЧ на хронически инфицированных клетках.

Целью настоящего изобретения является поиск новых соединений в ряду производных β -глицирризиновой кислоты (β -ГК), обладающих анти-СПИД-активностью.

Поставленная цель достигается гликопептидом β -ГК формулы (I), проявляющим анти-СПИД-активность.

Противовирусная активность представленного соединения (I) была изучена на модели первично инфицированных ВИЧ-1 лимфоидных клеток МТ-4. Раствор препарата в ДМСО (20 мг/мл - 50 мг/мл) вносили в суспензию инфицированных ВИЧ-1 клеток до конечной концентрации препарата 250-1000 мкг/мл, ДМСО до конечной концентрации 0,5-2,0%. В предварительных экспериментах было установлено, что ДМСО в концентрациях 0,5-2,0% не блокирует репродукцию ВИЧ-1. Об ингибировании репродукции ВИЧ-1 в клетках судили по снижению активности обратной транскриптазы и снижению накопления вирусного антигена (методом иммуноферментного анализа) и культурной жидкости на 4 сутки культивирования по сравнению с контролем (без добавления препарата).

В качестве референс-препаратов использовали один из наиболее эффективных для лечения СПИДа средств - азидотимидин, механизм действия которого связан с блокированием обратной транскриптазы и термированием синтеза вирусной ДНК (5) и β-глицирризиновую кислоту эффективно ингибирующую репродукцию ВИЧ-1 в клетках in vitro. Основным недостатком АЗТ является его высокая токсичность (6).

В таблице приведены результаты проведенных экспериментов. Установлено, что соединение (I) эффективно ингибирует репродукцию ВИЧ-1 в культуре клеток МГ-4 в концентрациях от 0,25 до 1,0 мг/мл. По уровню противовирусной активности гликопептид (I) не уступает АЗТ и сравним с β -ГК. Гликопептид (I) не оказывает на культуру клеток токсичного действия в отличие от АЗТ. Более того, количество живых клеток значительно выше, чем в контроле инфицированных клеток без добавления препарата (см. табл. 1) (в 7-10 раз выше, чем в случае АЗТ и в 3-4 раза выше, чем в случае β -ГК).

ЛД₅₀ гликопептида (I) = 2000 (1666-2400) мг/кг (внутрибрюшинно) (мыши). Данное соединение относится к IV классу малоопасных веществ.

Синтез гликопептида (I) проводили методом активированных (N-гидроксисукцинимидных) эфиров без предварительной защиты гидроксильных групп углеводной цепи молекулы гликозида. Выход гликопептида (I) 76,0%. Аналитически чистый продукт получали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле при элюции смесью растворителей хлороформ-метанол = 50 : 1 и 25 : 1 (v/v) с выходом 60%.

Таким образом, новое малотоксичное производное β -глицирризиновой кислоты - гликопептид (I), эффективно ингибирует ВИЧ-1 in vitro (в культуре клеток МТ-4), менее токсичный, чем АЗТ, не уступающий по активности последнему и сравнимый по эффективности с β -ГК.

П р и м е р 1. Изучение анти-СПИД-активности.

Противовирусная активность гликопептида (I) была изучена на модели первично инфицированных ВИЧ-1 лимфоидных клеток МТ-4 in vitro. Растворы препаратов в ДMСО (20-50 мг/кг) вносили в суспензию инфицированных ВИЧ-1 клеток до конечной концентрации 0,5-2,0%. В предварительных экспериментах было установлено, что ДМСО в концентрациях 0,5-2,0% не блокирует репродукцию ВИЧ-1. Об ингибировании репродукции ВИЧ-1 в клетках судили по снижению активности обратной транскриптазы и снижению накопления вирусного антигена (методом иммуноферментного анализа) в культурной жидкости на 4 сутки культивирования по сравнению с контролем (без добавления препарата). Для сравнения использовали один из наиболее эффективных для лечения СПИДа препаратов - азидотимидин (АЗТ) и β -глицирризиновую кислоту (β -ГК), эффективно ингибирующую репродукцию ВИЧ-1 в клетках in vitro. Результаты экспериментов приведены в таблице.

Как видно из данных таблицы, гликопептид (I) эффективно ингибирует репродукцию ВИЧ-1 в культуре клеток в указанных концентрациях (на 95,3-97,3% ). По уровню противовирусной активности соединение (I) не уступает АЗТ и сравнимо с β -ГК. Предлагаемое производное β -ГК не оказывает на культуру клеток токсического воздействия в отличие от АЗТ. Количество живых клеток в культуре при обработке гликопептидом возрастает по сравнению с контролем (без добавления препарата).

П р и м е р 2. Получение гликопептида (I).

Получение гидрохлорида диметилового эфира L-аспарагиновой кислоты.

К суспензии 10 г (75 ммоль) L-аспарагиновой кислоты в 200 мл метанола при охлаждении в ледяной бане прибавляют по каплям 10 мл перегнанного хлористого тионила, перемешивают при 0-5^оС 1,5 ч до полного растворения осадка, выдерживают при комнатной температуре 12 ч. Упариванием растворителя в вакууме при 40^оС получают 14,2 г (96%) сиропообразного L-Asp(OMe)₂ ˙HCl, кристаллизующегося при стоянии. Перекристаллизация смеси метанола-эфира дает аналитически чистый продукт 11,8 г (80%), т. пл. 115-116^оС. лит. т. пл. 116-117^оС [7].

Синтез гликопептида (I).

К раствору 1,64 г (2 ммоль) очищенной β-глицирризиновой кислоты (92-95% ) в 50 мл сухого диоксана при 0^о прибавляют 1,2 г (10,4 ммоль) N-гидроксисукцинимида и 1,3 г (6 ммоль) N,N'-дициклогексилкарбодиимида и перемешивают при этой температуре 2,5-3 ч, при комнатной 6-7 ч, оставляют смесь на ночь при 4-8^оС, отфильтровывают выпавший осадок дициклогексилмочевины, к фильтрату после охлаждения в бане со льдом прибавляют 1,7 г L-Asp(OMe)₂ ˙HCl (7 ммоль) и по каплям 1,4 мл (13,7 ммоль) перегнанного триэтиламина и выдерживают смесь при комнатной температуре с периодическим перемешиванием 24 ч. Растворитель упаривают в вакууме, остаток растворяют в хлористом метилене (200 мл), промывают 5% HСl, водой, 5% NaHCO₃, водой и сушат над MgSO₄. Упариванием растворителя в вакууме получают 1,9 г (76%) гликопептида (I), который хроматографируют на колонке из силикагеля L (100/250 μ, ЧСФР), элюируя смесью хлороформа-метанола 50 : 1, 25 : 1 и 10 : 1 (v/v). Смесью 50 : 1 и 25 : 1 вымывают 1,5 г (60%) аналитически чистого продукта (I) в виде аморфного вещества желтоватого цвета, Rf = 0,50 (хлороформ-метанол-вода = 45 : 10 : 1), [ α ]_D²⁰ = =+60^o (с = 0,02; метанол).

ИК, ν, см^-1: 3600-3200 (OH, NH); 1740 (COOR); 1660 (C₁₁ = 0); 1540 (CONH).

УФ, λ_max^MeOH, (lg ε ): 248 нм (4,27).

Найдено, %: C 56,98; H 7,07; N 3,23.

C₆₀H₈₉N₃O₂₅.

Вычислено, %: C 57,54, H 7,16; N 3,35.

Растворим в метаноле, спирте, ацетоне, тетрагидрофуране, диоксане, ДМФА.

Использование: в качестве анти-СПИД средства. Сущность: продукт: 3-0-[2-0-(N- b -D-глюкопиранозилураноил-L-аспарагиновой кислоты диметиловый эфир)-N- b -D-глюкопиранозил ураноил-L-аспарагиновой кислоты диметиловый эфир] -(3 b, 20 b )-11,30-диоксо-30-(N-L-аспарагиновой кислоты диметиловый эфир)-30-норолеан-12-ен. Выход 76,0% . [α]2D

Гликопептид β - глицирризиновой кислоты с диметиловым эфиром L-аспарагиновой кислоты общей формулы

где R - L - Asp (OMe)₂, OH,
проявляющий анти-СПИД-активность.