Способ серодиагностики Коксаки В инфекций Советский патент 1992 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано для улучшения серодиагностики энтеровирусных инфекций.

Целью изобретения является повышение точности способа.

Способ осуществляют следу ющим образом..

В качестве вируса с высокой инфекционной активностью используют вариант вируса Коксаки В2 (Ohlo-1), в поддерживающую среду которого добавляют 50 мкг/мл трипсина.

Предлагаемый вариант вируса Коксаки В2 выделен от больного серозным менингитом в культуре клеток фибробластов эмбрионов человека (ФЭЧ), в питательную среду которых было добавлено 50 мкг/мл трипсина. Вариант вируса в указанной культуре

прошел более 25 пассажей. Данный штамм вируса Коксаки В2 депонирован в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии им.Д.И.Ивановского АМН СССР.

Пример. Проводили серодиагностику у 32 больных серозным менингитом. Для этой цели исследовали парные сыворотки от этих больных, собранные в первые дни болезни и в период реконвалесценции (через 2-3 недели), на наличие вируснейтрализующих антител к вирусу Коксаки В2.

Приготовление Культуры клеток ФЭЧ осуществляют следующим образом. Ткани туловища и конечностей плода 2-4 мес. беременности измельчают ножницами до мелких кусочков размером 2-4 мм, затем промывают 3 раза в растворе Хенкса. рН 7,4. Измельченную ткань трипсинизируют. Для этого к ткани, находящейся в трипсинизационной колбе, добавляют 50.0 мл 0,25%-ного раствора трипсина и перемешивают в течение 5 мин с помощью магнитной мешалки. После осаждения ткани первую порцию надосадочной жидкости отбрасывают. Затем к осадку добавляют мл 0,25%-ного трипсина и перемешивают на магнитном смесителе при комнатной температуре в течение 20 мин. Полученную суспензию, состоящую из клеток, переливают в центрифужные пробирки, клетки осаждают центрифугированием при 2500-3000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость отбрасывают, осадок ресуспендируют в небольшом объеме (50,0 мл) раствора Хенкса (рН 7,4) и помещают в холодильник до смешивания с клетками последующих экстракций.

К ткани, оставшейся в колбе, добавляют свежий раствор трипсина и повторно производят экстракцию. Экстракцию повторяют 2-3 раза. Смешанную суспензию клеток, полученную после всех экстракций, центрифугируют при 2500-3000 об/мин в течение 10 мин, Надосадочную жидкость отбрасывают, клетки ресуспендируют в среде, содержащей 0,5%-ный раствор гидролизата лактальбумина на растворе Хенкса (рН 7,0). Осадок ресуспендируют в питательной среде для выращивания.клеток до концентрации 250 тыс. .клеток в 1,0 мл. В качестве среды для выращивания клеток используют среду, содержащую 0,5% гидролизата лактальбумина на растворе Хенкса, рН 7.0 и среду 199 на растворе Хенкса, рН 7,2, в каждую из которых добавляют сыворотку крупного рогатого скота до 10,0% и антибиотики из расчета 25 ть1с. ед. пенициллина и 25.0 мг стрептомицина на 100,0 мл. среды. Культуру разливают в стерильные пробирки в обьеме 1,0 мл. Для работы используют культуру со сплошным монослоем клеток, имеющих типичную морфологию для ФЭЧ, с четко выраженными границами между Клетками. В качестве поддерживающей ереды .используют приведенные питательные среды без добавления сыворотки.

Накопление инфекционного вируса в культу ре к леток ФЭЧ. Для этой цели используют маточный материал полученного варианта вируса Коксаки В2 (депонент Г KB V1934). Доза заражения составила 0,1 мл х ЦПДбО/мл на 250000-500000 клеток. За 2-3 ч до внесения вируса производят смену среды выращенной культуры ФЭЧ на поддерживающую, но с добавлением трипсина в конечной концентрации 50 мкг/мл. Вирус вносят в культуру клеток ФЭЧ и после часового контакта культуру заливают средой, содержащей трипсин в такой же концентрации (50 мкг/мл), и инкубируют при 37°С в течение 2-7 дней до наступления характерных деструктивных изменений клеток. Просмотр зараженных вирусом клеток осуществляют на 2-3-й день после заражения. Степень цитопатогенного действия (ЦПД) вируса oцe.ивaют по четырехбалльной системе. Культуральную вируссодержащую жидкость получают посредством замораживания и оттаивания в смеси сухого льда со спиртом. Затем культуральную жидкость центрифугируютвтёчёние 15мин при 3000 об/мин, Надосадочную жидкость сливают и используют в качестве инфекционного вируса. Количественное содержание вируса в надосадочной жидкости о преде л я ют методом конечного разведения в ФЭЧ с добавлением в питательную среду 50 мкг/мл трипсина. Инфекционнь1й титр составляет 7,0 Ig ЦПД50/0,1 мл. .

Для реакции нейтрализации используют культуру ФЭЧ, выращенную на среде с 0,5% гидролизата лактальбумина на растворе Хенкса, рН 7,0, с 10%-ным содержанием сыворотки крупного рогатого скота. Перед употреблением культуры ростовую среду меняют на поддерживающую (среду 199 без добавления сыворотки). Разведения вируса и исследуемые сыворотки готовят на среде 199. При этом число рядов стерильных пробирок должно соответствовать количеству исследуемых сывороток, а количество пробирок в одном ряду - числу разведения сывороток. Вируссодержащий материал э объег/ie 0,5 мл с активностью 100 ЦПДбО в 0,1 мл смешивают с 0,5 мл каждого разведения сыворотки, выдерживают смеси 1 ч при 37°С и вносят по 0,2 мл в 4 пробирки с культурой ФЭЧ, где предварительно производят смену ростовой среды на поддерживающую с добавлением в последние 50 мкг трипсина. После заражения пробирок смесями рабочую суспензию вируса разводят в 10 10 и 10 раз и по 0,1 мл каждого разведения вводят в 4 пробирки. Культуру инкубируют при 37°С, результаты регистрируют на 7-е сутки после заражения. При окончательном учете результатов ЦПД в контроле при использовании вируса в рабочей дозе должно соответствовать 100 ЦПД50. Определение количественного содержания вируса в рабочей дозе в ФЭЧ также проводят в присутствии трипсина в поддерживающей среде.

Титром сыворотки считают наибольшее разведение, защищающее 50,0% зараженных культур от действия 100 ЦПДзо вируса. По сравнению с прототипом точность диагностики возрастает на 19,7% (вь1являемость при использовании предлагаемого

способа составляет 64,3%. а в прототипе 44,6%) при локализации инфекции в оболочках головного мозга (серозный менингит), на 23% (выявляемость при использовании предлагаемого способа составляет 74,3%, а в прототипе 51,32%) при диагностике другой локализации инфекции, к примеру как сопутствующая при герпангине. Форму л а и 3 о бретени я Способ серодиагностики Коксаки В инфекции, включающий забор крови, выделение сыворотки, ее разведение, инкубацию с тест-вирусом, выявление титра антител в культуре клеток и при нарастании титра антител в парных сыворотках диагностируют Коксаки В инфекцию, отличающийся тем. что, с целью повышения точности способа, в качестве тест-вируса используют трипсинзависимый -вариант Коксаки В2 (штамм Ohio-1) вируса.

0

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использованодля улучшения серодиагностики энтеровирусных инфекций. Цель изобретения - повышение точности диагностики. В культуру фибробластов эмбриона человека вносят индикаторный вирус, содержащий разведения исследуемой сыворотки. В качестве индикаторного вируса используют трипсинзависимый вариант вируса Коксаки В2 (Ohio-1) и при увеличении титров антител в парных сыворотках диагностируют Коксаки В инфекцию. По сравнению с прототипом увеличивается точность диагностики на 23% при локализации инфекции в оболочках головного мозга и на 23% при другой локализации инфекции.