Штамм BREVIBACTERIUM SP. Е 531-продуцент @ -лизина Советский патент 1993 года по МПК C12P13/08 C12P13/08 C12R1/13 

Изобретение относится к микробиоло1-ической промышленности и касается нового штамма бактерий, продуцирующего L-лизин. используемый в качестве кормовой добавки. Известен штамм Brevlbacterlum flavum RC-115-продуцент L-лизина, Штамм RC-115 характеризуется потребность в аминокислотах (треонине и метионцне) .и высоким урЬвнем образования лизина в лабррато.рны1 условиях. При ферментации о колбах штамм продуцирует 2034 г/л L-лизина, влабораторныхферментерах на мелассной среде с дробной добавкой сахарозы - 45-60 г/л L-лизин. Однако в пройзводг/твенных условиях в ферментерах емкостью 30 и 50 м средний уровень образования лизина у штамма не превышает 25 г/л. Помимо этого недостатком штаммя RC115 является высокая зависимость образования лизина от колебаний количества треонина и питательной среде, где источниками треонина является основное сырье меласса, а также кукурузный экстракт или заменяющие его различные гидролизаты белковых веществ. Треонин является необходимым ростовым фактором для продуцента, но его избыток в среде ингибирует процесс лизинообразования. Цель изобретения получение штаммапрбдуцента L-лизина, у которого высокая способность к сверхсинтезу лизина-сохра-; няется в производственных условиях неза- висимо от объема ферментационных аппаратев)л применяемого в производстве сырья. Предлагаемый штамм Brevlbacterlum sp. Е 531 получен путем многоступенчатой селекции из штамма Brivlbacterlum sp. 22 Л с применением двух мутагенных факторов: раствора нитрозогуанидина (НГ) и паров диэтилсульфата (ДЭС). Селекция проведена по следующей схеме: отбор на среде НГ НГ НГ с аналогом ДЭС 22Ле 132РЕ 193СС28NC E5 Начиная со второго этапа селекции, отбор продуктивных штаммов вели на среде повышенным до 13% по сахару содержанием мелассы, подавляющим синтез лизина у исходного штамма 22Л. На предпоследнем этапе селекции был проведен отбор мутантов, устойчивых к ингибированию аналогом лизина 5-(2-аминоэтил)-1-цистеином (ASLQ в сочетании с треонином. В результате был получен новый штамм Brevibacterium sp. Е 531. Основные отличия штамма Е 531 от штамма прототипа RC-115 заключаются в более высоком уровне лизинообразования в различных условиях ферментации и в устойчивости к аналогу лизина, что обеспечивает штамму меньшую зависимость синтеза лизина от содержания в среде треонина. Ниже приведены результаты изучения влияния аналога лизина (АЭЦ) и треонина на рост штаммов Е 531, RC-115 и 22Л. В табл. 1 представлены данные, показывающие оптическую плотность суспензии клеток трех штаммов после 15 ч роста в минимальной среде с гомосерином (0.1 мг/мл), в которую добавлены АЭЦ и треонин в соотношении 1:1. Как видно из табл. 1, рост штамма Е531 в меньшей степени ингибируется аналогом анализа в сочетании с треонином по сравнению с исходным штаммом прототипом RC115. Из таблицы также видно, то рост нового штамма п первые 15 ч значительно опережает рост двух других штаммов. У известных аналогорезистентных штаммов продуцент лизина устойчивость роста клеток к ингибированию аналога лизина (АЭЦ) обусловлена мутационным изменением ключевого фермента синтеза лизина уб-аспартокиназы, которое заключается в том,- что указанный фермент Становится менее чувствительным к подавлению его активности смесью лизина и треонина. Определение уровня активности аспартокиназы и чувствительности фермента к ингибированию лизином и треонином проведено у нового штамма Е531 и его исходного штамма 22Л (табл. 2j Как видно из представленных в табл. 2 данных, удельная активность аспартокиназы нового штамма Е531 в 1,5 раза выше активности исходного штамма 22Л. Лизин и треонин, взятые в отдельности, не оказывают существенного влияния на активность фермента обоих штаммов, тогда как эквимолярная смесь этих аминокислот на 90% подавляет активность фермента у штамма 22Л, но только на 55% у штамма Е531. Таким образом, ключевой фермент биосинтеза лизина у штамма Е531 характеризуется более высоким уровнем удельной активности и меньшей чувствительностью к ингибированию смесью лизина и треонина. Эти Свойства аспартокиназы являются, очевидно, причиной более высокого уровня лизинообразования у штамма Е531 по сравнению с родительским штаммом и штаммом-прототипом RC-115 при ферментации на средах с повышенным сол ржлн11 м треонина. В табл. 3 представлены данные, показывающие влияние добавки трернина к ферментационной среде, содержащей мелассу и кукуруэн ы и экстракт, на выход лизина после 65 ч ферментации. Как видно из данных табл. 3, увеличение содержания треонина в среде приводит к резкому снижению продуктивности родительского штамма и штамма-прототипа. У штамма Е531 синтез лизина в меньшей степени, подвержен отрицательному влиянию треонина. Кроме уменьшения зависимости от отрицательного действия треонина, снижение чувствительности аспартокиназы к ингибированию смесью лизина и треонинд обусловливает и другое полезное свойство, нового штамма, а именно более высокую стабильность сггособности продуцировать лизин. Так, реверсия к дикому типу у штамма 22Л одновременно с утратой ауксотрофных свойств (потребностьв гомосерине или треонине и метионине) приводит к полной утрате способности выделять, лизин. В то же время прототрофные ревертанты штамма Е531 сохраняют способность прюду-цировать в среднем 40-50% лизина от у|зовня родительского штамма. . Приобретение в процессе многоэтапной селекции свойства штамма Е531 обеспечивают ему более высокий уровень продуктивности по сравнению со штаммами 22Л и RC-115. В табл. 4 приведены данные, характеризующие уровень образования лизина у трех штаммов в лабораторных условиях на средах разного состава. Как свидетельствуют эти данные, новый читамм Е531 на всех использованных вйри антах ферментационных сред обладает болеевысокой способностью К лизинообразованию по сравнению с исходным штаммом 22Л, а также штаммом прототип.ом. Следует отметить, что повышение в среде концентрации мелассы и, соответственно, сахара не приводит к снижению, уровня образования лизина у нового штамма, как это имеет место у штамма 22Л и на вариантах сред 1 и 3-у штамма прототипа. Стабильно высрк1 й уровень образования лизина характеризует штамм Е531 не только в лабораторных условиях, но и в производственнь1х условиях при ферментации в ферментах большей емкости (50 и 100 м. Штамм Brevlbacterium sp. Е531 депонирован в Центральном музее промышленных микроорганизмов института ВНИИГенетика, и имеет регистрационный номер ЦМПМ В-1959.. Культурально-морфологическая характеристика штамма Brevlbacterium sp. Е531. Морфология клеток: клетки овальные, размером 0,5-2,0 х 0,3-1,0 мк, спор не образуют, неподвижные, грамположйтельные. Рост на мясо-пептонном агаре. Через 7 суток роста образует округлые колонии диаметром 4-4,5 мм, матовые, желтовато-кремовые; пигмент в среду не выделяют, noBeptxHocTb гладкая, форма выпуклая, край р вный, структура однородная, консистенция тестообразная, дает равномерную суспензию в воде. При посеве штрихом через 2 сут рост умеренный, край гладкий, поверхность матовая, полная, цвет желтовато-кремовый. При посеве уколом рост в глубине агара слабый, на поверхности умеренный. Рост на минеральной среде Гловера с глюкозой, биотином, тиамином и гомосерином. На вторые сутки образует округлые колонии диаметром 1,5-2,6 мм, светло-кремовые, пигментв среду не выделяет, поверхность слегка бугристая, профиль выпуклый, с несколькими концентричными складками, край ровный, структура колонии однородная, консистенция тестообразная, дает равномерную суспензию в воде. штриха на вторые сутки умеренный, плотный, цвет светло-кремовый. Отношение к источникам углерода. Сбраживает с образованием кислот глюкозу, сахарозу, мальтозу, фруктозу, инозит. Не образует кислот на лактозе, галактозе, арабинозё, рамнозе, ксилозе этаноле, метаноле, манните, сорбите, глицерине, дульците. Айсимилирует глюкозу, сахарозу, мальтозу, фруктозу, маннозу, инозитксилозу, рамнозу, этанол, уксусную кислоту, глицерин, дильцит, янтарную кислоту, сорбит. Таким образом, новый штамм Brevlbactorlum sp. Е531 характеризуется высоким и стабильным уровнем образования лизина в различных условиях ферментации и обладает пониженной чувствительностьк к колебаниям состава питательной среды, что при промышленном при/иенении штамма должно способствоватъ повышению стабильности производственного процесса и увеличить обьг ем продукта с существующих производственных мощностей на заводах отрасли, производящих L-лизин. Использование штамма Brevlbacterium ln РЦ11 ППИЯЯанГ Мв rnPnVinillMy ППММРПЯУ Пример 1. Культуру штамма Brevfbacterium sp. 351, выращенную при в течение 1 сут на мясо-пелтонном агаре, петлей засевают в колбы емкостью 750 мл, содержащие по ЗТЗ Мл посевной срёды .следующего coctaea, %: меласса - 8,0; гидролизат белково-витаминного концеит4)ата (БКВ) - 11.0; рН среды - 7.0. Колбы .помещают на круговую качалку и выращива ют посевной материал в течение 21 ч при зо°с;::,, .,. . . / .; , .; . Готовым посевным материалом (по 2 мл) засевают колбы ёмкостью 750 мл, содержащие по 20 мл фермёнтационной среды еле- дующего состава, %: меласса 24.0; гцдролйзат БВК-6,0. хлрридаммония-2.5 гидрофосфат калий -0.2; мел- 1;0;рН среды 7.0. Ферментационная среда, разлитая в кОлбы, перед посевом стерилизуется «втоклавированием. После посева колбы устан ав л и ва ют на к ру го вую качал ку и инкубируют при30 С. Через i66 ч после начала ферментации в культурной жидкости накапливается Цлйзин в концентраций 47,1 г/л (RO монохлоргидрату), В этих условиях лри йспользЬввнии щтамМа ВС-115нак$пливаётся З2.в г/л L-лизМина. П м е р 2, Культуру iuтамм:а Bfievltecterium Sp. ES31 вмращивают, как ri зано в примере 1, в пс11севной :реде, имеющей Соста1в, %:мёлассаг8.0; кукурузный экстракт6.0. хлорид аммоний-1,0. рНередь 7.0. V Готовый посевной Материал (по 2 мл) использукит Для ггосева фёрментаЦионнрйГJ среды. грцготбвЛеннЬй пЬ примеру 1, но содёржа1|цёи вместо гидролизат БВЦкукурузныйэкстг)акт в концентрации 4%. УелоВИЯ ферментации те же. что и Ьг|исанные Ь примере 66 ч после нйчаЛаферментации в кул ьтурной жидкости накапливаетСи lL-лизин в концентрации 46,0 г/л. В этих условиях при использовании штамма RС115 накапливается 38,4 г/л L-лизина. Примерз. Приготовление посевного материала штамма Bnatylbacterlumsp. Е531 и УСЛОВИЯ ферментации те же. что в примере 2, но в составе ферментации среДы вместо кукуруэного экстракта содержится гидролизат хлопкового шрота в концентрации 8.0%, Через 65 ч после начала ферментации в культурной жидкости образуется 1-лизиН в концентрации 38.9 г/л. В зтих условиях лри использовании. штаМма RC-115 образуется 18,1 г/л L-лизина. П р -и М е р 4. Культуру штамма erevlbacterfum sp. Е531. выращенную при в течение суток на мясо-пептонном агаре, петлей засевают в колбы емкостью мл. содержащие по 70 мл посевной среды следующего состава. %; меласса - 12.0; гидролизат БВК - 8.0; мел - 2.0; гидррфосфат аммония - 0.1; рН среды 6.8-7.2. Колбы прмещают на круговую качалку и выращивают посевной материал в течение 21 с при Приготовленным посевным материалом объемом 1 л засевают 2,5 м стерильной посевной среды того же состава, помещенную в ферментер емкостью5 м. Ферментероборудован барботе ром для распределения воздуха и рубашкой дли охлаждения. Выращивание культуры в ферментере проводят при 30-32С в течение 21 ч с непрерывной аэрацией (2-3 м врздуха в Мин). Выращенной культурой обьемом 2.5 м засевают 30 -м ферментационной среды, приготовленной в ферментере емкостью 50 м . Ферментер оборудован барботажным врздухораспределением. Ферментационная среда имеет следующий состав. %; меласса .2б,0; гидролизат БВК-4,5; хлорид аммония 1,2; мел г 0,7,- гидрофосфат аммония-0.1; рН Среды 6,8-7,2 устанавливают амиачной водой. Ферментацию п|роводят при 30-32°С с непрерывной аэрацией (28-36 М воздуха в 1 мин). Через 22 ч после начала ферментации к фер-. ментационной СрёДё добавляют 2 т стерилизованной мелассы. После 8. ч ферментации концентрация L-лизина В культурной жидкости составляет 49 т/л.; П р им е р 5. Посевной материал шТамма Breylbacterlum sp. Е531 готовят по примеру 4. Ферментацию .проводят в ферментере емкостью 50 оборудованным аэратом типа диффузор. После 60 ч ферментации концентрация L-лизина в кyльtypнoй жидкости составляет 42 г/л. П РИМ е р 6. Посевной материал штамма BTevlbacterlum sp. Е531 объемом 5 м готовят по примеру 4. Ферментацию проводят в ферментере ёмкостью 100 м с контактным устройством массопередачи типа 1Г1ерфорированных тарелок. В ферментер помещают 60 м ферментационной среды, имеющей состав, как указано в примере 4. но концентрация мелассы составляет 28%, Ферментацию проводят при 30-32°С с непрерывной аэрацией (55-66 м воздуха в 1 мин). После 40 ч ферментации концентрация К-лизина составляет 45 г/л. ШтамМ Brevlnacterium sp. Е531 в отличии от известных характеризуется устойчивостью к $-(2-аминоэтил)-цистенну и высоким уровнем образования лизина, до 49 г/л а производственных,условиях, ферментёрах большей емкости. (56) Авторское свидетельство СССР № 671384. кл. С 12 D 13/nfi 1Q7R

10 Таблица 1

869332

х) Активность фермента выражена в % к активности в отсутствие аминокислот,

Влияние добавки .треонина на уровень образования лизина

.Таблица4

.«-

Сравнительная характеристика способности к образованию лизина у нового штамма Е531

и штаммов 22Л и RC-115 в лабораторных условиях (колбы емк. 750 мл, объем среды 20 мл,

продолжительность ферментации: вар. 1,2-68 ч, вар. 3.4-90ч)

Та блица 2

.SТаблицаЗ

)Гйдролизат хлопкового шрота, ) Гидролизат БВК,

Формула изобретения

Штамм Brevlbacterium sp. Е 531 Депонирован в Центральном музее промышленных микроорганизмов Всесоюйногр

Продолжение табл.

научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов г.Москвы, регистрационный номер ЦМПМ В-1959)-продуцент L-лизина.