Штамм вниигенетика-4995,продуцирующий лизин Советский патент 1979 года по МПК C12K1/02 C12D13/06 

Изобретение относится к микробиологии и касается иолучения штамма Сог пеЬас1еrium glutamicum ВНИИгенетика-4995, продуцирующего L-лизин.

L-лизии является одной из незаменимых аминокислот и широко применяется в сельском хозяйстве для сбалансирования аминокислотного состава кормов и повышения их питательной neffHOCTH.

Известен штамм Brevibacterium sp. 22Л, продуцирующий L-лизин 1.

Известен также штамм Micrococcus glutamicus Т-3 (Сог пеЬас1ег1игп glutamicum Т-3) используемый для получения L-лизина 2.

Однако для этих ц таммов потребуется интенсивная аэрация питательной среды для максимального накопления L-лизина. Эти штаммы способны продуцировать значительные количества L-лизина только в тех условиях, где сульфитное число не ниже 4,0 г Ог/л-час

Указанный уровень аэрации среды по техническим причинам не всегда может быть достигнут на сун1ествуюпи1х промышленных предприятиях, что, в свою очередь, ведет

к снижению выхода продукта при использовании известных И1таммов.

Кроме того, уровень накопления L-лизина у известных штаммов зависит от качества свекловичной ме,тассы, являюн1ейся в данном способе основным источником углерода в питательной сргде. В состав мелассы также входит некоторое количество ростовых факторов и других веществ, избыток которых оказывает существенное влияние на уровень накоп.чения лизина.

Количестве11ное и качественное соотношение компонентов мелассы определяется многими факторами, главными из которых являются почвенные и климатические условия района вырашивания свеклы, ее сорт и условия хранения, а также условия производства сахара. Следует отметить, что основным критерием оценки пригодности данной партии мелассы для биосинтеза лизина является ее прямая биологическая проверка путем использования в питательной среде для вырашивания штамма продуцента и получения L-лизипа,

Цель изобретения заключается в создании штамма-продуцента L-лизина, который обеспечит стабильность уровня накопления лизина на производстве независимо от степени пптенсивпости аэрации питательной среды и качества используемой мелассы. штамм по думали путем ступенчатой селекции с п|1и 1епеаием мутагена (| -метил-.нитро-.-нит|)озогуаппдина) из штамма СогупеЬасteriimi gJiitartiicuni Т 3. Отбор нродуктип 11 1х Bapnamoii осушеств.ляли па среде с мелассой при нониженпом уровне азрации среды (су.ль(|1итнг)е число 2 г Ое/л-час). В результате проведения двух этапов селекции нолучеп Н1тамм (ог. f lutainicHm ВНИИ генетика-4995, который продуцирует в оптимальных д.ля исходного 1нтамма Т 3 условиях )авное с ним количество .лизина и не снижает VTOT уровепь в пебла|-ог1риятных для исходного пггамма ус.ловиях: при ионижепии пптеиспвностп a paiuin или нсноль.чова.чни «псподходяще) ме.лассы. Штамм хранилчя li 1денл ра,Л1,нг)м )мьинлен}н 1Х кул1,тур иод номером В 345. Штамм имеет с, характерислл ку. Морфо.логня. К.лслкн оиа.льн1мс, короткие (0,() 1,2мк} ()f)(jBi)ie, грамно.ложггге.льпые. пенодвижшле. Кульлуральпыс и (|)изиологпческме призпакп. Мясо-:1Снтон п,1Й aiap (МИЛ). Колонии на седь.мые роста диаметром 2,0 3,0 мм, круг.лые. к)ай г.л,), ирииоднят в виде коиуса, поверхность с радиальными .ме.лк.ч.ми б{))().чдками, цвел бе,.лый. Рост плт)нха на Всорые сутки умеренны, край гладки, пои. рхность ладкая, .Л1 : , -л. , цвет белый. ПЛОСКИ, о; ее К (реда i.i. Па седьмь е сутки роста образует ко.л: ..: .шамегром OJ - 1,2 мм. кругль е е -ла пм крае.м. центр пр 1 1однял, 1рофИ,Л) , пол1ср иость ладкая, б.леслННхан,-нвел бе.1ый. Росл на вто|)ые сутки умере 1иьн1, краГ: г., поверхность гладкая, (})и;) n.ioc-Knii, б, тускЛ |й, UKT 6e;iijiii. Д.ля роста па мирпша.пяюй среде нужда етгя 1 био;и1пе, roMocep i ie (j.iii мелиопипе и ), нзо,леЙ 1И1К и ва,. Мо.локо не c ejvrb BaeT. С.лабо 1одн,е.лаН1васлКартофе.ль. Ма четверлл е сут ЛЛ ПТрИХ бе, , шпмент в среде не в). .Желатину tie разжп/каеч. (Зтио пение к Кточпнкам угллсрода. симили)ует г,лк), caxapo.jy, кеи,. га.лак 4):iy . и.ли аммс.ннм, слабо ,л г. не не; o.iij .ел- лактозу. С)1 п)П1епне к и.ючнпкам азола. .Xccinni.лирует се|.)пок 1сi.iii, x;io) 1.лн а.иллюкис.ч,п ) и мочевппу. Ниже п)едстав.1ен)1 такблицы cpai IHIтельных .ia6oi)aropHbrx- 1С11ЫЛаний icx(j. штамма Т 3 и иового 1 лапт 1ого штамма ВНИИ енетика 4995. Н 1тате; ьнь е среды содержат в качестве иеточ 1ика углерода мелассу (22%), в качестве источ шка ростов х cfjaKTOpOB кислот Н)Й (среда 1) и..:|и ферментативнь Й (среда 2) -идролизат) БВК,(БВК -- кормовые дрожж, получен 1 е а у леводородах 1ефТ), кол-ичество ервог() и вторО о 1,0°/о и 2,0/,, (1о сухо.м} весу) соответстве1 но, сернок 1слый аммоннй (2,) и мел (2,) иите)сивн(сть созда ол пулем вар Д1рования обл емами нитате.л) сред1) в колбах. Иов1 И1ения уровня дости ают ис о; ьзованием колб со стек; ян Ь Ми отбойниками. Как следует из рИВОДИМЫХ , П1ТаММ ВНИИгенетика--4995 нри интенсивности аэра.ии средь имеет оди аково вь сокий урове 1ь ако 1ления Ь-лизи 1а, как О абсол отной ко1,ентра и-и родукта, так и удель К)й нродуктивности. Исходный 1 1тамм Т - 3 нака ливает наиболь нее количество В УСЛОВИЯХ ВЬ СОКОЙ аэрац и средь и резко снижает выход рп указанных условий. Но)Й Л-амм образуст меныпее чем исходный ко;1ичество б омассь, и имеет более высокую р() 1уктивность (г лизина ia биомассы). , федслав„ле ные в т аблине ,i, нока:5 ва1от, что 10В1)Й тамм ВНИИ -еиетика - 4995 имеет высокий урове1 ь 1ако ления 1.-. срсде Л1 1, еодержа цей меласс)1 из тре.х об.ластей страны, тогда как )сх(1ДН)и Н л-амм Т 3 .еел- высокий ). на одном 3 трех ис Ь ганных o6)a. меласс. Как с ндете,л)Слли От дан)е л (;й же таб., урове 1ь након.ления . у )i) тамма аходится в мень )ст ол ко1 ненлра и н ростовых ()акгоров i среде (в коч 1ентраiu- i О 0,75 1,(||, че.м у исход 1О ( нта.мма, V кото) , роел0)1х (|)аклч)ров .) К резко у сниже1 1О в,хода 1.-лизипа. и б 1омассь у нтаммов т 3 и В 1ИИ енет 1ка 4995 ри раз1 ьг условиях средь Ле 1 (28°С; () колб 250 .Mjrj скорость вра цения качалки 240 об/мин родо.лжитель юсть ферMe iTa U 72 ч) ) в Таб, 1. лизина у штаммов Т-3 и ВНИИ енетика --4995 нри разных условиях среды .Nl 2 (28°С; объем колб 750 .мл; скоросП) вра 1ения качалки 240 об/мин; ироДО..Л Л ОС1Л ферМе Та.П 72 ч) .) лаб.шце 2. Вь1ход у тамма Т--3 и ВНИИгене1Л ка 4995 ia с)еде oVy 1, содержа 1ей ме,ласс различ Н х артий и различные ростового фактора (КБВК-кислотно о 1-и;1ролизата белково-витаминного коннсл Т|)гга) (2нч;; облаем колб 250мл; скорое i) 5ран1е1П Я качалки 240 об/мин; нродолжительность ферментации /2 ч; уровень аэрации по сульфитному чиспу - 4,2 г Ог/л lac привепено в таблице 3.

Таким образом нредполагаемый новый мутантный штамм ВНИИгенетика-4995, нолученный путем ступенчатой селекции из штамма Т-3, отличается от носледнего способностью накопления большого количества лизина (около 40 г/л) при пониженной аэрации среды (сульфитное число 1,0- 3,0 г Оз/л-час), более высокой удельной продуктивностью лизина на единицу биомас сы (2,9-4,1 г/г), более стабильным выходол. гфодукта при использовании различных партий мелассы и различных концентраций ростового фактора в среде, меньшим размером колоний и белой окраской штриха и колоний на средах МПА и Гловера.

Полученный новый штамм «ВНИИгенетика-4995 с указанными отличительными признакамисоздает предпосылки для осуществления стабильного процесса производства L-лизина в промышленных условиях независимо от колебаний уровня аэрации (в широком диапазоне сульфитного числа от 1,0 до 3,5 г Ог/л-час) и независимо от применяемой партии мелассы, которая может быть получена с различных сахарных заводов.

Пример 1. Культуру штамма ВНИИгенетика-4995 вырапшвают в течение 1 сут в пробирках на скошенной агаризованной среде МПА. Выросшую культуру с косяков петлей переносят в колбы емкостью 250 мл, содержашие 30 мл посевной среды. Состав посевной среды (вес./о): меласса - 3; кукурузный экстракт - 3; NaCI - 0,4; рН - 7,2.

Засеянные ко;1бы инкубируют на качалке (220-240 об/мин) в течение 18-24ч при температуре 28°С. Вырашенпый таким образом посевной материал в количестве 5°/о от объема ферментационной среды инокулируют в ферментационную среду следующего состава (вес. °/о):

.Меласса22,0 (по сахару 1 1,0°/о)

Кислотп ы и гпдрол и зат дрожжей (БВК)

1,0 (по сухому весу)

(NH4)2SO:

2,6

2,0

Мел

Для приготовления гидролизата 10/о суспензия БВК в 4 H,)j -автоклавируется при 128°С в течение 2,5 ч, пейтралпзуется аммиаком и добавляется в гштательпую среду из расчета БВК, (по сухо.му весу). Вмест( с необходимы.ми ростовы.ми факторамп при использовании гидролизата БВК вносится необходимое количество сульфата аммония (2,):

Вода водопроводная

рН среды доводят при

помоши NaOHдо 7.0-7,5

Фер.ментацию проводят в колбах Эрлен мейера (емкостью 250 мл), содержащих 10мл среды, па качалке (240 об/мин) при 28-30°С). Сульфитное число при указанном объ рме соеды согтявляет 3,0 г Ог/л-час, После bo-/Z4 в культуральнои жидкости накапливается 39,6 г/л лизина. (Исходный штамм Т-3 в тех же условиях накапливает 28,3 г/л лизина).

Пример 2. Способ выращивания посевного материала тот же, что в примере 1, Отличие состоит в составе ферментационной среды и условиях ферментации.

Ферментационная среда содержит, вес.°/о: Меласса22,0 (по сахару 11,0%)

Ферментативный гидролизат дрожже2,0 (по сухому весу) вых клеток

2,5 (NHOzSO.

2,0 Мел

Вода водопроводная рН среды доводят NaOH после стерилизациидо 7,2-7,5

Ферментацию нроводят в колбах Эрленмейера (емкостью 750 мл), содержащих 75 мл среды, на качалке (240 об/мин) при 29С. Сульфитное число при данном режиме аэрации среды составляет 1,0 г Ог/л-час .

После 65-72 ч в культуральнои жидкости

накапливается 33,4 г/л лизина (Исходный щтамм Т-3 в аналогичных условиях накапливает 17,4 г/л лизина).

Пример 3. Способ выращивания посевного материала тот же, что и в примере 1, условия ферментации как в примере 2. Отличие в составе ферментационной среды.

Ферментационная среда содержит, вес./| 22,0 (по сахару 1 1,0%)

Меласса

Кукурузный

3,0 (сырой вес)

экстракт

3,5

NH.C1

0,1

Кг ПРО.

2,0

Мел

рН среды как и в примере 2

После 72 ч ферментации в культуральнои жидкости накапливается 22,7 г/л лизина. (Исходный Н1тамм Т-3 в аналогичных у-славиях накапливает 13,3 г/л лизина).

Пример 4. Способ выращивания посевного материала, состав сред тот же, что и в примере 1. Отличие состоит в условиях ферментации.

Ферментацию проводят в металлическом ферментере (емкостью 20л), содержащем 12л среды. .Аэрацию питательной-среды осуществляют путем подачи возду.ха с объемной скоростью 1 объем воздуха на 1 объем среды в минуту при скорости вращения мещалки 700 об/мин. Данный режим аэрации соответствует сульфитному числ 3,2гО2/Л час. .

Накопление лизина и биомассы (в сравнении со щтаммом Т-3) на 72 часа фермен тации указаны в табл. 4.

Таблиц-а 1.

в указанных вариантах оиытгш использованы копбы с (чбойникамп

Т-З

ВНИИгенетика-499532, ,1

Т а б п и ц

Формула изобретения

Штамм CoTYnebacterium glutamicum ВНИИгенетика-4995, продуцирующий L-лизин. Хранится в Центральном музее промышленных культур, регистрационный JN9 В-345.

Морфологические признаки. Клетки, короткие овальные, 0,6-1,2 мк, бесспоровые, грамположительные, неподвижные.

Культуральные и физиологические признаки. Д ясо-пентонный агар (МПА). Колонии на седьмые сутки роста диаметро.м 2,0- 3,0 мм, круглые, край гладкий, центр приподнят в виде конуса, поверхность с радиальными мелкими бороздками, цвет белый. Рост штриха на вторые сутки умеренный.

ТабпицаЗ

Таблица 4

край гладкий, поверхность гладкая, профиль плоский, блеск тусклый, цвет белый.

Среда Гловера. На седьмые сутки роста образует колонии диаметром 0,7-1,2мм, круглые с гладким краем, центр приподнят,

профиль сферический, поверхность гладкая, блестящая, цвет белый. Рост штриха на вторые сутки умеренный, край гладкий, поверхность гладкая, профиль плоский, блеск тусклый, цвет белый.

Для роста на минимальной среде нуждается в биотине, гомосерине (или метионине и треонине), изолейцине и валине.

Молоко не свертывает. Слабо подщелачивает.

Картофель. На четвертые сутки штрих белого цвета, пигмент в не выделяет. Желатину не разжижает.

Отношение к источникам углерода. АсСи.мнлирует глюкозу, сахарозу, мальтозу, кси,лозу, галактозу, маннозу. ацетат натрия или аммония. C.ia6o иснользует этиловый спирт. Не исиользует лактозу.

Отноп еиие к источникам азота. .Ассимилирует сернокислый, хлорист1 1Й или азотись киел 1)1 и аммоний и .мочевину.

Штамм «ВНИИгенетика- -4995 сиособеи стабил.ьно на.чаплмвать лизип (около 40r/,ii па средах, содержащих в качестве основных ко.миопеитов мелассу и источники ростовых факторов (кис.лотный или (jep.vieViT.aтивпыи гидролизат дрожжевых клеток или кукурузный экстракт) при низком уровне аэрации среды (сулвфитное число 1,0- .15 г Ог/л-час). Имеет высокую иродуктивноств лизина па единицу биомассв {2,9- 4,1 г лизина/г биомассы} и обеспечивает стабильное накопление продукта при использовании различных партий мелаееы и новышеипы.х концентраций роетового фактора в среде.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

2.Авторское свидетельство № 213032, кл. С 12 D 13/06, 1966.