Штамм вируса гепатита ни-А, ни-В для приготовления специфических диагностических препаратов Советский патент 1991 года по МПК C12N7/00 

Изобретение относится к вирусологии и касается получения диагностических препаратов.

Цель изобретения - выделение нового штамма вируса эпидемического гепатита ни-А, ни-В, способного вызывать соответствующую инфекцию у обезьян, сопровождающуюся выделением вируса, используемого для специфической диагностики гепатита ни-А, ни-В у людей.

Штамм вируса эпидемического гепатита ни-А, ни-В Ош-2599 выделен из фекальной пробы больного, взятой за день до появления желтухи. Штамм депонирован в

Государственной коллекции вирусов под № 831 и обладает следующими свойствами.

Морфологические свойства.

Фекальная проба в виде экстракта была исследована методом иммуноэлектронной микроскопии с использованием сывороток добровольца, зараженного и перенесшего эпидемический гепатит ни-А, ни-В: ре- конвалесцентной сыворотки, содержащей антитела к вирусу ни-А, ни-В и взятой до заражения и не содержащей антител к данному вирусу. В исследуемой пробе были обнаружены вирусные частицы, реагирующие с реконвалесцентной сывороткой и не

о

00

VJ о

го

реагирующие с сывороткой, взятой до заражения.

Вирусные частицы представляли собой сферические образования размером 27-28 нм, в препаратах они обнаруживались в виде полных и пустых форм. В присутствии реконвалесцентной сыворотки эти частицы выявлялись в виде скоплений или единичных структур, покрытых характерным венчиком антител. При исследовании 2%-ной фекальной суспензии концентрация частиц составляла 1000 на 5 ячеек электронно-микроскопической сеточки.

Биофизические свойства. Для изучения биофизических свойств выделенного штамма, названного Ош-2599, были приготовлены очищенные двумя разными способами экстракты. Первый способ очистки включал два этапа центрифугирования - при 3000 об/мин и 10000 об/мин. Второй способ очистки включал помимо центрифугирования трехкратное замораживание-оттаивание при температурах -70°С/37°С. При иммуно- электронно-микроскопическом исследовании очищенных первым способом экстрактов вирус гепатита ни-А, ни-В выявлен в количестве 1000 частиц на 5 ячеек сеточки, а при исследовании экстрактов, очищенных вторым способом, выявлены только единичные частицы вируса.

Исходя из этих результатов, далее для изучения плавучей плотности выделенного вируса в градиентах хлорида цезия были использованы только экстракты, очищенные первым способом. При проведении ана- лиза фракций (с помощью метода иммуноэлектронной микроскопии) различных градиентов в хлориде цезия не удалось выявить вирусспецифические структуры.

Полученные данные показывают, что выделенный вирус разрушается в результате замораживания-оттаивания, а также в результате воздействия концентрацией солей хлорида цезия, что характерно для вируса эпидемического гепатита ни-А, ни-В.

Далее были проведены опыты по определению коэффициента седиментации данного вируса в сахарозе. Результаты показали, что основная масса частиц вируса выявлялась во фракции, соответствующей коэффициенту седиментации 183 s. Антигенные свойства. Вируссодержащие фракции далее объединяют и снова центрифугируют в 30%-ной сахарозе для осаждения частиц вируса. Полученный осадок ресуспендирован в фосфат- но-солевом буфере, и вируссодержащая суспензия исследована методом иммуноэлектронной микроскопии в шифрованном опыте с различными сыворотками. Проведенные исследования показывают, что вирусоподобные структуры размером 27 нм реагируют с сыворотками, содержащими антитела к вирусу эпидемического (фекально-орального) гепатита ни-А, ни-В, и выявляются с хорошим венчиком антител. Сыворотки, не содержащие антитела к указанному вирусу, не реагируют с этими структурами.

0Полученные данные свидетельствуют

о том, что при описанной очистке и концентрировании в сахарозе частицы вируса выделенного штамма сохраняют свои морфологические и антигенные характери5 стики, присущие вирусу эпидемического гепатита ни-А, ни-В.

Антигенные свойства штамма Ош-2599 были исследованы с помощью реконвалес- центных сывороток, полученных из разных

0 стран мира (Индия, Бирма, Непал, Франция, Афганистан). Исследование показывает антигенную близость выделенного штамма вирусу гепатита ни-А, ни-В, распространенному в данных странах.

5Штамм Ош-2599 вируса гепатита ни-А,

ни-В в виде 10%-ного фекального экстракта, обработанного антибиотиками, был введен внутривенно яванской макаке. После этого у обезьяны развивалась типичная инфек0 ция, и вирус далее был пассирован на яванских макаках.

При заражении яванских макак штамм Ош-2599 вызывает развитие инфекции со специфическим поражением печени, выде5 лением вируса с фекалиями и накоплением вируса в желчи и печени. Вирус выделяется с фекалиями и накапливается в желчи в количестве, достаточном для получения вирусного антигена и осуществления спе0 цифической диагностики эпидемического гепатита ни-А, ни-В.

Ниже описаны возможности использования вируса гепатита ни-А, ни-В, получаемого от обезьян, зараженных штаммов

5 Ош-2599.

П р и м е р 1. Использование вируса гепатита ни-А, ни-В, полученного из фекальных проб инфицированной штаммом Ош- 2599 яванской макаки, для диагностики

0 гепатита ни-А, ни-В.

Фекальные пробы от инфицированной штаммом Ош-2599 яванской макаки собирают на 15-25 день после заражения и готовят из них 10%-ные фекальные экстракты: к 0,5

5 г фекалий добавляют 5,0 мл 0,01 М раствора фосфатно-солевого буфера (ФСБ), встряхивают 15 мин на шуттель-аппарате, затем центрифугируют 30 мин при 3000 об/мин, переливают надосадочную жидкость в пластиковые пробирки и осветляют центрифугированием в течение 30 мин при 10000 об/мин. Далее экстракты проверяют на наличие антигена методом иммуноэлектрон- ной микроскопии.

Положительные на антиген фекальные пробы в виде 10%-ных экстрактов используют в качестве антигена для выявления антител к вирусу эпидемического гепатита ни-А, ни-В в исследуемых сыворотках больных и в качестве положительного контроля при обследовании на вирус фекальных проб больных.

В таблице показано присутствие антител к вирусу эпидемического гепатита ни-А, ни-В в сыворотках больных из различных географических зон мира.

П р и м е р 2. Использование вируса гепатита ни-А, ни-В, полученного из желчи, инфицированной штаммом Ош-2599 яванской макаки, для моделирования гепатита ни-А, ни-В.

Яванскую макаку, инфицированную штаммом Ош-2599, забивают на 14-15 день после заражения. Желчь из желчного пузыря отсасывают стерильным шприцем и в дальнейшем проверяют на содержание вируса методом иммуноэлектронной микроскопии. Содержание вируса в желчи достигает 300 частиц на 5 ячеек электронно- микроскопической сеточки.

В зависимости от содержания вируса желчь разводят в 5-10 раз стерильным физиологическим раствором, добавляют канамицин (0,5 мг/мл) и используют для заражения яванских макак. Заражение проводят внутривенно введением 1 мл разведенной физраствором желчи. Далее наблюдают развитие инфекции эпидемического гепатита ни-А, ни-В: выделение вируса с фекалиями, характерные для острого гепа- 5 тита гистологические изменения печеночной ткани, появление вирусспецифических антител.

Для моделирования гепатита ни-А, ни-В может быть использован также фекальный

0 экстракт, приготовленный по примеру 1.

П р и м е р 3. Использование вируса гепатита ни-А, ни-В, полученного от инфицированной штаммом Ош-2599 яванской макаки, для получения гипериммунных ди5 агностических сывороток.

Для получения гипериммунных диагностических сывороток используют обезьяну (яванскую макаку), предварительно зараженную штаммом Ош-2599 и переболевшую

0 гепатитом ни-А, ни-В. Через два месяца после первого заражения обезьяне внутривенно вводят 1 мл вируссодержащей жидкости, полученной из фекальной пробы (пример 1) или из желчи (пример 2). Через две недели

5 после повторного заражения обезьяну обескровливают. Из полученной крови обычным способом готовят сыворотку.

Полученную сыворотку титруют методом ИЭМ и в дальнейшем используют для

0 выявления вируса гепатита ни-А, ни-В в фекальных пробах больных с целью специфической диагностики.

Формула изобретения Штамм вируса гепатита ни-А, ни-В, ГКВ

5 №831 для приготовления специфических диагностических препаратов.

Изобретение относится к вирусологии и касается получения диагностических препаратов. Цель изобретения - новый штамм вируса эпидемического гепатита ни-А, ни- В, способного вызывать соответствующую инфекцию у обезьян, сопровождающуюся выделением вируса, используемого для специфической диагностики гепатита ни-А, ни- В у людей. Штамм вируса эпидемического (энтерально передающегося) гепатита ни-А, ни-В Ош-2599 выделен из фекальной пробы больного, взятой за день до появления желтухи, и депонирован в Государственной коллекции вирусов под №831. При заражении яванских макак штамм Ош-2599 вызывает развитие инфекции со специфическим поражением печени, выделением вируса с фекалиями, накоплением вируса в печени и желчи, появлением антител к вирусу эпидемического гепатита ни-А, ни-В. Вируссо- держащие материалы и сыворотки, полученные от зараженных обезьян, используются для осуществления специфической диагностики эпидемического гепатита ни-А, ни-В. 1 табл. сл С

Место сбора

Европейская часть СССР

Ташкент

Демократическая Республика Афганистан

Индия

Монгольская Народная Республика

Франция

Количество положительных проб

Количество обследованых

2/84 12/37 34/52 24/38 1/24 2/25