Способ получения ксантиноксидазы Советский патент 1991 года по МПК C12N9/02 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения ксантиноксидазы (КО), и может быть использовано в инженерной энзимологии.

Известен способ выделения КО (КДГ) из корневых клубеньков 3 видов бобовых - сои, вигны и фасоли Лима с использованием мо- ноклональных Антител к КДГ сои 1.

Наиболее близким и изобретению по технической сущности является способ получения КО из животного источника - сливок, включающий отделение масла, фракционирование бутанолом, трехкратное высаливание сульфатом аммония, хроматографию на гидроксилапатите и гельфильтрацию 2.

Недостатками известного способа являются необходимость свежевыделенных сливок из парного молока, трудоемкость

процесса отделения масла, длительное фракционирование (17ч) бутанолом - токсичным органическим растворителем (сыво- ротка:бутанол 5:1). Для выделения КО по данному способу требуется от 4 до 5 дней.

Целью изобретения является упрощение процесса и удешевление целевого продукта.

Способ включает обработку исходного сырья и очистку продукта, причем в качестве исходного сырья используют зародыши пшеницы - отходы мукомольно-крупяного производства, которые обрабатывают буферным раствором, полученный экстракт прогревают при 55-65°С, а разделение бес- клеточного экстракта проводят методом ионообменной хроматографии на ДЭАЭ- целлюлозе и изоэлектрофокусированием

О

ю

CJ

о

Јь

VJ

П р и м е р. 10 г зародышей зерна пшеницы растирают в ступке в 50 мл 0,1 М Na-фосфатного буфера, рН 8,0, содержащего 0,5 мМ ЭДТА, 10 мм восстановленного глутатиона, 10 мМ NaaMoCM. Эту смесь центрифугируют при 12000 g в течение 15 мин при 4 С. Бесклеточный экстракт прогревают от 55 до 65°С 5 мин, охлаждают до 15°С. Денатурированные балластные белки осаждают центрифугированием при 12000 g в течение 10 мин при 4°С. Белки надосадоч- ной жидкости после центрифугирования осаждают сульфатом аммония до 35% и центрифугируют. Осадок растворяют в 0,1 М трис-буфере, рН 8,2, и пропускают через сефадекс С-25 для обессоливания. Фракции первого пика пропускают через ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-52-целлюло- зе и элюируют 0,2 М NaCI. Фракции, обладающие КО активностью, подвергают препаративному изоэлектрофокусирова- нию(ИЭФ).

0

5

0

Изоэлектрофокусирование ведут в градиенте концентрации сахарозы 5-50% с 1,5%, амфолинов, рН 3-10. Размеры колонки 1,6x30 см, напряжение 500 В, время 12 ч, температура 10°С. Полученный препарат электрофоретически гомогенен. Результаты очистки приведены в таблице.

Следует особо отметить, что при прогревании активность КО зародышей пшеницы резко увеличивается.

Формула изобретения

Способ получения ксантиноксидазы, включающий экстракцию исходного сырья и очистку экстракта, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса и удешевления целевого продукта, в качестве исходного сырья используют зародыши зерна пшеницы, которые экстрагируют буферным раствором, содержащим соль молибдена, экстракт прогревают при 55-65°С и подвергают очистке методом ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе и изоэлектрической фокусировки.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения ксантиноксидазы, и может быть использовано в инженерной энзимологии. Цель изобретения - упрощение процесса и удешевление целевого продукта. Способ включает экстракцию зародышей зерна пшеницы буферным раствором, прогревание экстракта при 55-65°С в течение 5 мин, фракционирование сульфатом аммония и очистку методом ИОХ и ИЭФ. Степень очистки 1093. 1 табл. со с