СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСПОРТНОЙ РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ (ТРНК) ИЗ ПРЕПАРАТА СУММАРНОЙ ТРНК ПЛАЦЕНТЫ ЧЕЛОВЕКА Российский патент 1995 года по МПК G01N30/06 C07H21/02 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам получения высокообогащенных транспортных РНК из тканей млекопитающих, и может быть использовано для производства индивидуальных транспортных рибонуклеиновых кислот тРНК млекопитающих (например, тРНК^Phe), широко использующихся в исследовательской практике.

Известен способ получения тРНК фракционированием препарата суммарной тРНК из плаценты человека с помощью последовательных жидкостных хроматографий: сначала на ВD-целлюлозе, затем на сорбентах RPC-5 и Aminex А-25 [1]
Недостатками данного способа являются большая трудоемкость, так как для каждой хроматографии используются различные сорбенты и, соответственно, меняются условия, а также значительная длительность процесса, обусловленная тем, что используемые для фракционирования сорбента не выдерживают высокого давления при элюции. При этом способ отличается недостаточно высокой чистотой получаемых индивидуальных тРНК ( ≈ 70-80%).

Целью изобретения является разработка препаративного метода, обеспечивающего достаточно быстрое (менее 8 ч) получение высокоочищенной ( ≈99%) индивидуальной тРНК из препарата суммарной тРНК плаценты человека.

Цель достигается способом получения тРНК путем последовательных стадий жидкостной хроматографии, на каждой из которых происходит обогащение препарата суммарной тРНК по целевому продукту, при этом используют обращенно-фазовую хроматографию на крунопористом микросферическом силикагеле с привитыми алифатическими группами C₁₈ в градиенте концентраций ацетонитрила в следующей последовательности: на первой стадии хроматографа препарат суммарной тРНК из плаценты человека пропускают через колонку, заполненную сорбентом сухим методом, а последующие стадии хроматографии ведут на колонке, заполненной суспензионным методом, при этом перед последней хроматографией обогащенные по тРНК^Phe фракции подвергают аминоацилированию фенилаланином.

Сравнивая способ получения тРНК с известным, можно отметить, что данный способ значительно более удобный, поскольку все последовательные хроматографии проводятся на одном и том же сорбенте, в одной и той же системе. Используемый в предлагаемом способе сорбент позволяет проводить высокоэффективную обращенно-фазовую хроматографию (ВЭОФ), которая занимает примерно 1 ч (хроматографии на BD-целлюлозе и RPC-5 занимают 5-10 ч каждая). Кроме того, степень чистоты целевого продукта, полученного данным методом, практически 100% против 70-80% в известном.

Известно использование высокоэффективной обращенно-фазовой хроматографии для фракционирования препарата суммарной тРНК из кишечной палочки (E.coli) [2]
Однако существенное отличие предлагаемого способа состоит в том, что введена стадия хроматографии суммарной тРНК на колонке, заполненной сорбентом сухим методом. В случае использования для фракционирования суммарной тРНК из плаценты человека эта стадия является ключевой, так как без нее фракционирование препарата оказалось невозможно.

Сущность способа поясняется примерами.

На фиг.1-3 показаны профили хроматографии, поясняющие данные примеры.

П р и м е р 1. Получение индивидуальной тРНК из препарата суммарной тРНК из плаценты человека.

70 мг суммарной тРНК из плаценты человека растворяют в 1,5 мл буфера А (0,1 М NaOAc, рН 5,5, 10 мМ MgCl₂, 0,5 мМ ЕДТА) и наносят на колонку 1х30 см, заполненную сухим методом (сорбент насыпают в колонку) силикагелем Lichrospher Si-500 (Merck, ФРГ) с привитыми алифатическими радикалами С₁₈ (LC₁₈). Сорбент LC₁₈ приготовлен как описано в работе [2] кипячением Lichrospher Si-500 (диаметр пор 500 , размер частиц 10 мкм) с октадецилтрихлорсиланом в толуоле. Элюцию ведут линейным градиентом концентрации ацетонитрила в буфере А от 0% со скоростью 0,15% в мин (скорость элюции 3 мл/мин). В процессе хроматографии (профиль хроматографии на фиг.1) собирают фракции объемом 10 мл и проверяют в них акцепторную активность по фенилаланину. Для этой цели из каждой фракции отбирают аликвоту по 50 мкл, осаждают тРНК добавлением 2,5 объема этанола, охлажденного до -20^оС. Осадок отделяют центрифугированием, растворяют в 40 мкм буфера В (20 мМ MgCl₂, 20 мМ трис-HCl, рН 7,5, 2 мМ АТР, 3х10^-5 М [¹⁴C]-фенилаланин) и добавляют фенилаланил-тРНК-синтетазу до конечной концентрации 50 мкг/мл. После инкубации в течение 20 мин при 20^оС реакционные смеси наносят на Whatmanu 3 ММ (1х1 см) и промывают при 0^оС дважды 5%-ной трихлоруксусной кислотой, а затем этанолом, сушат и просчитывают радиоактивность. Акцепторную активность вычисляют из соотношения оптической плотности и радиоактивности во фракциях. Фракции, содержащие тРНК^Phe, объединяют, в результате получают 160 ОЕ₂₆₀ тРНК с акцепторной активностью 120 пмоль Phe на 1 ОЕ₂₆₀: тРНК из этой объединенной фракции осаждают этанолом, растворяют в 1,5 мл буфера А и рехроматографируют на колонке, заполненной сорбентом LC₁₈ в виде суспензии в изопропаноле под давлением 250 атм с использованием установки Slurry packing фирмы Altech Ass (с насосом фирмы Haskel (США) (профиль хроматограммы на фиг.2).

В полученных хроматографических фракциях определяют акцепторную активность по фенилаланину, как описано выше. В результате получают 70 ОЕ₂₆₀ тРНК с акцепторной активностью 200 пмоль Phe на 1 ОЕ₂₆₀. Эту тРНК осаждают этанолом и проводят препаративное аминоацилирование ¹⁴С-фенилаланином в присутствии фенилаланил-тРНК-синтетазы, как описано выше при определении акцепторной активности (концентрация тРНК^Pheсоставляет 10^-5 М), причем перед добавлением фермента реакционную смесь делят на порции по 0,6 мл. По окончании реакции порции объединяют и добавляют NaOA c рН 5,5 до конечной концентрации 0,1 М. Реакционную смесь хроматографируют вновь в описанных выше условиях (на колонке с LC₁₈, заполненной суспензионным методом), при этом целевой продукт элюируется отдельным пиком (фиг.3). Соотношение оптической плотности и радиоактивности дает значение 1800 пмоль Phe на 1 ОЕ₂₆₀ тРНК, т.е. получен практически на 100% чистый целевой продукт. Общий выход 5 ОЕ₂₆₀˙тРНК^Phe.

П р и м е р 2. Фракционирование суммарной тРНК из плаценты человека в описанных выше условиях, но без стадии хроматографии на колонке, заполненной сорбентом сухим методом.

70 мг суммарной тРНК из плаценты человека растворяют в 1,5 мл буфера А и хроматографируют на колонке, заполненной сорбентом LC₁₈ при давлении 250 атм суспензионным методом. Через 15 мин после начала хроматографии начинает возрастать сопротивление колонки току элюента при допустимых значениях давления. Выделение индивидуальной тРНК^Pheстановится невозможным.

Использование: биотехнология. Сущность изобретения: тРНК^Phe транспортную рибонуклеиновую кислоту выделяют из препарата суммарной тРНК плаценты человека обращенно-фазовой хроматографией на крупнопористом микросферическом силикагеле с привитыми алифатическими группами C₁₈ -использованием в качестве элюента градиента концентрации ацетонитрила. При этом стадии хроматографии проводят в следующей последовательности: сначала препарат суммарной тРНК пропускают через колонку, заполненную сухим методом. Последующие стадии, включающие обогащение фракций и выделение целевого продукта, ведут на колонке, заполненной суспензионным методом, при этом перед выделением продукта хроматографией обогащенную фракцию подвергают аминоацелированию фенилаланином. Способ обеспечивает значительное сокращение длительности процесса, повышение чистоты целевого продукта с 70 - 80 до 99%. 3 ил.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСПОРТНОЙ РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ (ТРНК) ИЗ ПРЕПАРАТА СУММАРНОЙ ТРНК ПЛАЦЕНТЫ ЧЕЛОВЕКА путем последовательных обогащающих по целевому продукту стадий жидкостных хроматографий на колонках, заполненных сорбентом, в потоке элюента, отличающийся тем, что в качестве сорбента используют крупнопористый микросферический силикагель с привитыми алифатическими группами C₁₈, а элюцию препарата проводят линейным градиентом концентрации ацетонитрила, при этом первую стадию хроматографии проводят на колонке, заполненной сорбентом сухим методом, последующие стадии хроматографии ведут на колонке, заполненной суспензионным методом, а перед последней стадией обогащенные по целевому продукту фракции препарата подвергают аминоацилированию фенилаланином.