СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НАТРИЕВОЙ СОЛИ 2-НИТРО-4-СУЛЬФОФЕНИЛОВОГО ЭФИРА БИОТИНА Российский патент 1998 года по МПК C07D495/04 A61K31/415 

Описание патента на изобретение RU2102395C1

Изобретение относится к области биоорганической химии и молекулярной биологии и может быть использовано для получения олиго(поли)нуклеотидов и биологически активных белков, несущих биотиновую группу [1-30]
Из известных способов получения эфиров биотина, с помощью которых синтезируют биотинилированные производные олиго(поли)нуклеотидов и белков [1,4-6] наиболее близким является способ, проводящий к образованию натриевой соли 2-нитро-4-сульфофенильного эфира биотина. Синтез ведут путем взаимодействия биотина и натриевой сили2-нитро-4-сульфофенола в растворе диметилформамида (ДМФА) в присутствии дициклогексилкарбодиимида (ДЦГК) при молярном соотношении исходных реагентов в ДЦГК, равном 1:1:1, по методике [6] аналогично получению натриевых солей 2-нитро-4-сульфофениловых эфиров аминокислот, а выделение продукта из реакционной смеси осуществляют с помощью хроматографии на сефадексе LH-20. Выход целевого продукта 80% Однако такой путь выделения продукта не удобен тем, что процесс хроматографии является трудоемким и не всегда возможным из-за труднодоступности сорбента.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа получения натриевой соли 2-нитро-4-сульфофенильного эфира биотина, не требующего дополнительной стадии хроматографического выделения продукта.

Предлагаемый способ заключается в том, что натриевую соль 2-нитро-4-сульфофенилового эфира биотина получают путем взаимодействия натриевой соли 2-нитро-4-сульфофенола с биотином в среде ДМФА в присутствии ДЦГК, при этом биотин и ДЦГК вводят в реакционную смесь постепенно (порциями) до достижения молярного соотношения указанных реагентов к натриевой соли 2-нитро-4-сульфофенола, равного 1:81,4-1,69):(1,3)-1,5) соответственно.

При проведении процесса в предлагаемых условиях натриевая соль 2-нитро-4-сульфофенола полностью расходуется на образование эфира биотина. Поскольку биотин не растворим в диметилформамиде, то избыток его остается в осадке, дициклогексилмочевина продукт превращения дициклогексилкарбодиимида выпадает в осадок. Таким образом, единственным соединением, находящемся в растворе, является искомый продукт, регистрируемый в УФ-свете при анализе аликвоты реакционной смеси методом тонкослойной хроматографии. Для получения его в кристаллически чистом виде достаточно профильтровать раствор реакционной смеси от осадка фильтрат упарить, а осадок растворить в метаноле и продукт осадить эфиром. Выход продукта увеличивается до 92% по сравнению с прототипом. При проведении процесса в условиях, когда исходные реагенты в указанных выше соотношениях сразу вводятся в реакционную смесь, т.е. не порциями, идет образование трудноотделимого побочного продукта.

Уменьшение конечного количества биотина (молярное соотношение натриевой соли 2-нитро-4-сульфофенола: биотин 1:(1,2-1,4)) не приводит к полному расходованию натриевой соли 2-нитро-4-сульфофенола, а увеличение количества дициклогексилкарбодиимида (конечное молярное соотношение натриевой соли 2-нитро-4-сульфофенола: дициклогексилкарбодиимид 1:(1,6-1,9)) приводит к появлению в реакционной смеси побочного продукта, который регистрируют в УФ-свете с помощью метода тонкослойной хроматографии.

Пример 1 (по прототипу). Синтез проводят по методике, описанной в [6-7] Для этого 41,5 мк моль натриевой соли 2-нитро-4-сульфофенола сушат 30 минут в вакууме при 60oC растворяют в 62 мкл диметилформамида, а затем добавляют 44,6 мк моль биотина. К охлажденной во льду реакционной смеси добавляют 43,2 мк моль дициклогексилкарбодиимида и выдерживают в 1 час при 0oC и 21 час при комнатной температуре при перемешивании. Аликвоту реакционной смеси наносят на тонкослойную пластинку с силикагелем и проводят хроматографию в системе этанол: хлороформ (6:4). Продукты, образующиеся в результате реакции, регистрируют в виде пятен на пластине в УФ свете. Анализ показывает, что при проведении реакции в таких условиях (молярное соотношение натриевой соли 2-нитро-4-сульфофенола, биотина и дициклогексилкарбодиимида равно 1:1, 08:1,04 соответственно) в реакционной смеси появляется продукт с Rf 0,35, а натриевая соль 2-нитро-4-сульфофенола расходуется не полностью.

Пример 2. Проводят те же процедуры с теми же количествами веществ, что и в примере 1, а затем реакционную смесь снова охлаждают в льду, добавляют 20,8 мк моль биотина, 18,4 мк моль дициклогексилкарбодиимида и снова выдерживают 1 час при 0oC, 21 час при комнатной температуре и 12-15 часов при +5oC. (Конечное молярное соотношение натриевой соли 2-нитро-4-сульфофенола, биотина и дициклогексилкарбодиимида равно 1:1, 58:1,49 соответственно). Анализ реакционной смеси проводят методом тонкослойной хроматографии так, как описано в примере 1. В этом случае анализ обнаруживает полное превращение натриевой соли 2-нитро-4-сульфофенола в продукт с Rf 0,35. Осадок дициклогексилмочевины и непрореагировашего биотина отделяют фильтрованием, фильтрат упаривают до маслянистого остатка, остаток растворяют в 50 мкл метанола. Продукт осаждают их метанола серным эфиром и сушат над P2O5 в вакууме. Выход 80%
Пример 3. Выполняют все те же стадии, что и в примерах 1 и 2, за исключением того, что реакционная смесь в объеме 420 мкл содержит изначально 264 мк моль натриевой соли 2-нитро-4-сульфофенола, 278 мк моль биотина и 269 мк моль дициклогексилкарбодиимида, а затем в нее было добавлено 96 мк моль биотина и 102 мк моль дициклогексилкарбодиимида. (Конечное молярное соотношение натриевой соли 2-нитро-4-сульфофенола, биотина и дициклогексилкарбодиимида равно 1:1, 4:1,39 соответственно).

Полученный продукт был проанализирован методом тонкослойной хроматографии в трех системах растворителей: А этанол-хлороформ (6:4), Б этанол-вода (9: 1, В н-бутанол:уксусная кислота:вода (4:1:1). Анализ показывает, что во всех системах растворителей продукт представлен одним пятном с Rf 0,35, 0,69 и 0,55 в системах А, Б и В соответственно. Строение полученного продукта было доказано с помощью метода 1H-ЯМР-спектроскопии. Отнесение сигналов было проведено с использованием метода двойного резонанса1H}1H -1H. 1H-ЯМР-спектр (400мГц, D2O, δ м.д.) 1,59(м, 2H, H-7, H-7'); 1,68 (м, 1H,H-6); 1,82 (м, 3H, H-6', H-8H-8'); 2,83 (м, 3H,H-3,H-9,H-9'); 3,04 (дд, 1H,H-2); 3,41 (м, 1H, H-4); 4,48 (дд, 1H,H-5); 4,65 (м, 1H,H-1); 7,57 (д, 1H,H-12); 8,21 (дд, 1H, H-11); 8,57 (д, 1H,H-10). Выход 92%
Пример 4. Синтез продукт проводят аналогично тому, как описано в примерах 1 и 2, за исключением того, что конечное молярное соотношение натриевой соли 2-нитро-4-сульфофенола, биотина и дициклогексилкарбодиимида рано 1:1, 42: 1,32 соответственно. Анализ аликвоты реакционной смеси, проведенной так, как описано в примере 1, обнаруживает полное расхождение натриевой соли 2-нитро-4-сульфофенола на образование натриевой соли 2-нитро-4-сульфофенилового эфира биотина.

Пример 5. Условия синтеза аналогичны условиям, приведенным в примерах 1 и 2, за исключением того, что конечное молярное соотношение натриевой соли 2-нитро-4-сульфофенола, биотина и дициклогексилкарбодиимида равно 1:1, 41: 1,47 соответственно. Анализ аликвоты реакционной смеси, проведенный так, как описано в примере 1, показывает полное расходование натриевой соли 2-нитро-4-сульфофенола на образование натриевой соли 2-нитро-4-сульфофенилового эфира биотина.

Пример 6. Условия синтеза аналогичны условиям, описанным в примерах 1 и 2, за исключением того, что конечное молярное соотношение натриевой соли 2-нитро-4-сульфофенола, биотина и дициклогексилкарбодиимида равно 1:1,48: 1,31 соответственно. Анализ аликвоты реакционной смеси, приведенный так, как описано в примере 1, обнаруживает полное расходование натриевой соли 2-нитро-4-сульфофенола на образование натриевой соли 2-нитро-4-сульфофенилового эфира биотина.

Пример 7. Условия синтеза аналогичны условиям, описанным в примерах 1 и 2, за исключением того, что конечное молярное соотношение натриевой соли 2-нитро-4-сульфофенола, биотина и дициклогексилкарбодиимида равно 1:1,52: 1,44 соответственно. Анализ аликвоты реакционной смеси, проведенный так, как описано в примере 1, обнаруживает полное расходование натриевой соли 2-нитро-4-сульфофенола на образование натриевой соли 2-нитро-4-сульфофенилового эфира биотина.

Пример 8. Условия синтеза аналогичны условиям, описанным в примерах 1 и 2, за исключением того, что конечное молярное соотношение натриевой соли 2-нитро-4-сульфофенола, биотина и дициклогексилкарбодиимида равно 1:1,49: 1,51 соответственно. Анализ аликвоты реакционной смеси, проведенный так, как описано в примере 1, обнаруживает полное расходование натриевой соли 2-нитро-4-сульфофенола на образование натриевой соли 2-нитро-4-сульфофенилового эфира биотина.

Пример 9. Условия синтеза аналогичны условиям, описанным в примерах 1 и 2, за исключением того, что конечное молярное соотношение натриевой соли 2-нитро-4-сульфофенола, биотина и дициклогексилкарбодимида равно 1:1,58:1,31 соответственно. Анализ аликвоты реакционной смеси, проведенный так, как описано в примере 1, обнаруживает полное расходование натриевой соли 2-нитро-4-сульфофенола на образование натриевой соли 2-нитро-4-сульфофенола на образование натриевой соли 2-нитро-4-сульфофенилового эфира биотина.

Пример 10. Условия синтеза аналогичны условиям, описанным в примерах 1 и 2, за исключением того, что конечное молярное соотношение натриевой соли 2-нитро-4-сульфофенола, биотина и дициклогексилкарбодиимида равно 1:1,57: 1,37 соответственно. Анализ аликвоты реакционной смеси, проведенный так, как описано в примере 1, обнаруживает полное расходование натриевой соли 2-нитро-4-сульфофенола на образование натриевой соли 2-нитро-4-сульфофенола на образование натриевой соли 2-нитро-4-сульфофенилового эфира биотина.

Исследования по данной заявке были выполнены при поддержке Международного Научного фонда и Правительства России (гранты RBN000 и RBN300).

Источники информации:
1. Bayer E.A. Wilchek M. Methods of biochemical analysis, 1980, v.26, p. 1-45.

2. Pantano P. Kuhr W.G. Anal.Chem. 1993, v.65, N5, p.623-630.

3. Бадашкеева А.Г. Зарытова В.Ф. Молекул. биологии, 1989, т.23, вып.5, с.1221-1226.

4. Bayer E.A. Wilchek M. Methods in enzymolrgy, 1974, v.XXXIV, p.265-267.

5. Costello S. M. Felix R.T. Gieje R.W. Clin.Chem. 1979, v.25, N8, p. 1572-1580.

6. Гершкович А. А. Серебряный С.Б. Биоорган. химия, 1979, т.5, N8 с. 1125-1132.

Похожие патенты RU2102395C1

название год авторы номер документа
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОТИНМЕЧЕННЫХ ОЛИГОДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОТИДОВ 1994
  • Годовикова Т.С.
  • Орлова Т.Н.
  • Абрамова Т.В.
  • Куликова В.Ф.
  • Залите И.К.
  • Медведкин В.Н.
RU2083584C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДЕЗОКСИНУКЛЕОЗИД-5'-ТРИФОСФАТОВ 1994
  • Богачев В.С.
RU2080325C1
3'-ФОСФАТ, N, P-НЕЗАЩИЩЕННЫЕ ФОСФОТИОАТНЫЕ ОЛИГОДЕЗОКСНУКЛЕОТИДЫ В КАЧЕСТВЕ ИСХОДНЫХ СОЕДИНЕНИЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ФОСФОТИОАТНЫХ, ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ РЕАГЕНТОВ ДЛЯ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ, ФОСФОТИОАТНЫЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ, СОДЕРЖАЩИЕ 3'- И/ИЛИ 5'-СВЯЗАННЫЕ ХИМИЧЕСКИЕ ГРУППИРОВКИ В КАЧЕСТВЕ ФОСФОТИОАТНЫХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ РЕАГЕНТОВ ДЛЯ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ И СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ 1994
  • Амирханов Н.В.
  • Зарытова В.Ф.
RU2069214C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 3'-ФОСФАТ,N,P-НЕЗАЩИЩЕННЫХ ФОСФОТИОАТНЫХ АНАЛОГОВ ОЛИГОДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОТИДОВ 1997
  • Амирханов Н.В.
RU2131881C1
Н-ФОСФОНАТЫ ГИДРОКСИЛСОДЕРЖАЩИХ СТЕРОИДОВ В КАЧЕСТВЕ РЕАГЕНТА ДЛЯ ТВЕРДОФАЗНОГО СИНТЕЗА СТЕРОИДНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ИЛИ ИХ АНАЛОГОВ 1991
  • Веньяминова А.Г.
  • Сергеева З.А.
  • Баширова В.З.
RU2009147C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСПОРТНОЙ РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ (ТРНК) ИЗ ПРЕПАРАТА СУММАРНОЙ ТРНК ПЛАЦЕНТЫ ЧЕЛОВЕКА 1992
  • Мундус Д.А.
  • Грайфер Д.М.
  • Карпова Г.Г.
RU2034292C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 1R,3S-2,2-ДИМЕТИЛ-3-(2-ОКСОПРОПИЛ)-ЦИКЛОПРОПАНАЦЕТОНИТРИЛА 1989
  • Рукавишников А.В.
  • Ткачев А.В.
  • Володарский Л.Б.
  • Пентегова В.А.
RU1689376C
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 2-МЕТИЛ-1,4-НАФТОХИНОНА 1990
  • Матвеев К.И.
  • Крысин А.П.
  • Титова Т.Ф.
  • Хлебников Б.М.
  • Одяков В.Ф.
  • Егорова Т.Г.
  • Жижина Е.Г.
  • Пармон В.Н.
RU2022958C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ХЛОРАЗИНОВ, СОДЕРЖАЩИХ О-ГИДРОКСИФЕНИЛЬНУЮ ГРУППУ 1991
  • Кривопалов В.П.
  • Николаенкова Е.Б.
  • Мамаев В.П.
RU2026295C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АЛКИЛОВЫХ ЭФИРОВ О- ИЛИ П-НИТРОФЕНОЛОВ 1993
  • Малыхин Е.В.
  • Василевская Т.Н.
  • Штейнгарц В.Д.
RU2084444C1

Реферат патента 1998 года СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НАТРИЕВОЙ СОЛИ 2-НИТРО-4-СУЛЬФОФЕНИЛОВОГО ЭФИРА БИОТИНА

Изобретение относится к области биоорганической химии и молекулярной биологии и может быть использовано для получения олиго(поли)нуклеотидов и биологически активных белков, несущих биоотиновую группу. Предлагаемый способ заключается в том, что натриевую соль 2-нитро-4-сульфофенилового эфира биотина получают путем взаимодействия натриевой соли 2-нитро-4-сульфофенола с биотином в среде диметилформамида в присутствии дициклогексилкарбодиимида (ДЦГК), при этом биотин и ДЦГК вводят в реакционную смесь постепенно (порциями) до достижения молярного соотношения указанных реагентов в соли, равного 1 : (1,4-1,6) : (1,3-1,5) соответственно.

Формула изобретения RU 2 102 395 C1

Способ получения натриевой соли 2-нитро-4-сульфофенилового эфира биотина, отличающийся тем, что натриевую соль 2-нитро-4-сульфофенола вводят во взаимодействия с биотином в среде диметилформамида в присутствии дициклогексилкарбодиимида (ДЦГК), причем биотин и ДЦГК вводят в реакционную смесь порциями до достижения молярного соотношения указанных реагентов к натриевой соли 2-нитро-4-сульфофенола 1 1,4 1,6 1,3 1,5 соответственно.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 1998 года RU2102395C1

Печь для непрерывного получения сернистого натрия 1921
  • Настюков А.М.
  • Настюков К.И.
SU1A1
Bayer E.A., Wilchek M
Methods of biockemical analysis
Способ получения фтористых солей 1914
  • Коробочкин З.Х.
SU1980A1
Прибор для получения стереоскопических впечатлений от двух изображений различного масштаба 1917
  • Кауфман А.К.
SU26A1
Печь для непрерывного получения сернистого натрия 1921
  • Настюков А.М.
  • Настюков К.И.
SU1A1
Аппарат для очищения воды при помощи химических реактивов 1917
  • Гордон И.Д.
SU2A1
Pantano P., Kuhr W.G
Anal.Chem
Способ изготовления фанеры-переклейки 1921
  • Писарев С.Е.
SU1993A1
Разборное приспособление для накатки на рельсы сошедших с них колес подвижного состава 1920
  • Манаров М.М.
SU65A1
ТРАНСПОРТЕР ДЛЯ ТОРФА 1922
  • Гехт Р.И.
SU623A1
Переносная печь для варки пищи и отопления в окопах, походных помещениях и т.п. 1921
  • Богач Б.И.
SU3A1
Бадашкеева А.Г., Зарытова В.Ф
Молекул.биология
Механизм для сообщения поршню рабочего цилиндра возвратно-поступательного движения 1918
  • Р.К. Каблиц
SU1989A1
Прибор для равномерного смешения зерна и одновременного отбирания нескольких одинаковых по объему проб 1921
  • Игнатенко Ф.Я.
  • Смирнов Е.П.
SU23A1
Кипятильник для воды 1921
  • Богач Б.И.
SU5A1
Способ устройства ванн, клозетных горшков, труб и т.п. принадлежностей канализации из армированного цементного бетона, снаружи асфальтируемого 1919
  • Курныгин П.С.
SU1221A1
Очаг для массовой варки пищи, выпечки хлеба и кипячения воды 1921
  • Богач Б.И.
SU4A1
Bayer E.A., Wilchek M
Methods in enzymology
ПРИБОР ДЛЯ ЗАПИСИ И ВОСПРОИЗВЕДЕНИЯ ЗВУКОВ 1923
  • Андреев-Сальников В.А.
SU1974A1
САННЫЙ ВЕЛОСИПЕД С ВЕДУЩИМ КОЛЕСОМ, СНАБЖЕННЫМ ШИПАМИ 1921
  • Аркадьев К.И.
SU265A1
Кипятильник для воды 1921
  • Богач Б.И.
SU5A1
Costello S.M., Felix R.T
и др
Clin.Chum
Дверной замок, автоматически запирающийся на ригель, удерживаемый в крайних своих положениях помощью серии парных, симметрично расположенных цугальт 1914
  • Федоров В.С.
SU1979A1
Видоизменение пишущей машины для тюркско-арабского шрифта 1923
  • Мадьяров А.
  • Туганов Т.
SU25A1
Щипцы для завивки волос 1924
  • Субботин В.Ф.
SU1572A1
Приспособление для точного наложения листов бумаги при снятии оттисков 1922
  • Асафов Н.И.
SU6A1
Гершкович А., Серебряный С.В
Биоорганич.химия
Дверной замок, автоматически запирающийся на ригель, удерживаемый в крайних своих положениях помощью серии парных, симметрично расположенных цугальт 1914
  • Федоров В.С.
SU1979A1
Кипятильник для воды 1921
  • Богач Б.И.
SU5A1
КОЛЕСНЫЙ ТРАКТОР 1923
  • Мамин Я.В.
  • Мамин Н.Я.
SU1125A1

RU 2 102 395 C1

Авторы

Беклемишев А.Б.

Пичко Н.П.

Карягин А.Ю.

Даты

1998-01-20Публикация

1996-01-24Подача