СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНГИБИТОРА ПРОЛИФЕРАЦИИ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК Российский патент 1995 года по МПК A61K38/00 A61K31/215 A61K31/765 

Изобретение относится к способу получения ингибитора пролиферации опухолевых клеток у животных, в том числе у человека.

Несмотря на то, что исследования развития карциностатических средств энергично проводятся во всем мире, ни одно из современных карциностатических средств не является полностью свободным от побочного действия, вызываемого этими средствами. Также, учитывая существующее в настоящее время мнение, что радиотерапия в малых дозах неэффективна, имеется потребность в скорейшем создании удовлетворительных карциностатических средств.

Принимая во внимание эти соображения, авторы настоящего изобретения ранее предложили ингибитор пролиферации злокачественных опухолевых клеток человека в патентах США N 4, 810, 495 и 4, 963, 358, а также способ получения ингибитора пролиферации злокачественных опухолевых клеток у животных в патенте США N 4, 595, 657.

Однако в этих патентах не раскрыты конкретные вещества, ингибирующие пролиферацию клеток злокачественной опухоли.

Кроме того, ранее предлагался ингибитор пролиферации злокачественных опухолевых клеток у человека, включающий 2-гидрокси-1(Р-гидроксифенил)-5-метилгек- сан-3-он в патенте Японии 2-247121 (выложенная заявка N 247121/1995 того же заявителя) ингибитор пролиферации злокачественных опухолевых клеток у человека, включающий моноглицерид в патенте Японии N 2-247125 (выложенная заявка N 247125/1995 того же заявителя), и ингибитор пролиферации злокачественных опухолевых клеток у человека, включающий 2-гептадеканол, в патенте Японии 2-247120 (выложенная заявка N 247120/1995 того же заявителя).

Задача изобретения заключается в создании способа получения ингибитора пролиферации опухолевых клеток, который бы отличался от веществ, которые были предложены в перечисленных выше документах, практически не оказывал бы воздействия на пролиферацию нормальных клеток в тестах на токсичность с использованием нормальных клеток; и чтобы далее в тесте на ингибирование пролиферации опухолевых клеток человека, трансплантированных голым мышам, этот ингибитор останавливал бы пролиферацию через несколько дней после введения ингибитора, так же как и приводил к значительному уменьшению опухоли без дополнительного введения препарата, показывал стабильную эффективность при подкожном введении и обладал стабильным пролонгированным действием в организме пациента.

Способ предусматривает смешивание низкомолекулярного конденсационного полимера альфа-гидроксикислоты, олигопептида, содержащего, по меньшей мере, один остаток проглутаминовой кислоты, стабилизатора, включающего сахарид или сахароспирт и соли металла альфа-гидропропионовой кислоты, в качестве катализатора в соотношении 10=(1-4):(1-3):(0,5-1).

Предпочтительный вариант осуществления изобретения.

П р и м е р 1. Получение олигомера молочной кислоты (низкомолекулярного конденсационного полимера α-гидроксипропионовой кислоты).

Молочная кислота ( α-гидроксипропионовая кислота) химически характеризуется высокой реакционной способностью и отверждается при нагревании при 140^оС в течение 100 мин. После того как твердый продукт растворяют в воде и добавляют к нему щелочь, выпадает осадок, с трудом растворяющийся даже при добавлении кислоты. После нагревания осадка в течение 2 ч при 175^оС он превращается в вещество, которое не растворяется в воде, но растворяется в метаноле. Требование, которое сформулировано здесь, состоит в том, чтобы создать вещество, которое было бы растворимо в воде и было бы стабильно. Способ получения такого вещества, которое удовлетворяет этим условиям, описан ниже: 1) 0,7 мл 6N хлористоводородной кислоты добавляют к 50 мл L-молочной кислоты и смесь нагревают с обратным холодильником в течение 100 мин от 120 до 160^оС или кипятят в течение 2 ч
2) 0,5 г NaHCO₃ растворяют в 50 мл L-молочной кислоты, затем туда добавляют 150 мл толуола, и смесь нагревают в течение 2 часов от 140 до 160^оС.

3) 2 мл лактата натрия добавляют к 50 мл L-молочной кислоты, затем добавляют 100 мл бензола, и смесь нагревают от 3 до 6 часов при 140^оС.

4) 0,2 г MgCl₂ (или CaCl₂) и 150 мл толуола добавляют к 50 мл L-молочной кислоты, и смесь нагревают при кипении от 2 до 4 часов.

В результате вышеперечисленных процессов получают соединение, включающее конденсационный полимер L-гидроксипропионовой кислоты.

П р и м е р 2. Низкомолекулярный конденсационный полимер для олигомер α-гидроксипропионовой кислоты, описанный в вышеприведенном примере 1, олигопептид, содержащий, по меньшей мере, один остаток пироглутаминовой кислоты, и стабилизатор, включающий сахарид или сахароспирт, смешивают в массовом отношении (10:1)-4:(1-3), и к этой смеси добавляют небольшое количество соли металла L-гидроксипропионовой кислоты в качестве катализатора для получения ингибитора пролиферации опухолевых клеток.

Результаты эксперимента. Эксперимент 1. Тест на острую токсичность. 10 мл каждого ингибитора, содержащего соответствующие дозы (стабилизатор на основе сорбитола), добавили к 990 мл коммерчески доступной синтетической среды Eagle's МЕМ, к которой добавлено 10% эмбриональной сыворотки теленка, каждый из них как среда был добавлен в пластмассовую чашку диаметром 15 мм с 24 лунками, имплантированными 1х10⁵ кожных фибробластов и после культивации при 37^оС в течение 72 ч в атмосфере СО₂, измерили поглощение красителя метиленового синего в клетках при длине волны 620 нм.

По величине поглощения в этот момент времени рассчитывали степень выживания. Взаимосвязь между степенью выживания и дозами ингибитора приведены ниже:
Доза ингибитора, мг 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
Степень выживания, 99,9 99,0 98,5 98,0 97,4 96,2
Эксперимент 2. Эксперимент по ингибированию полиферации злокачественных опухолевых клеток А:Метод:1х10⁷ клеток установленной культуры, HelaS-3 выделенных их карциномы шейки матки, были трансплантированы в дорсальную область каждой или голой мыши (ICRNU)NU; возраст 5 недель, затем на 5 день после трансплантации экспериментальной группе мышей ввели 20 мг ингибитора (с сорбитолом в качестве стаби-лизатора) в 0,5 мл Н₂О, введение проводили раз в сутки в течение 10 дней непрерывно, а контрольной группе аналогичным образом вводили 0,5 физиологического раствора. После этого введения прекратили и к седьмой недели после трансплантации опухоли были удалены и взвешены.

Доза: 20 мг/0,5 мл Н₂О для введения
Метод введения подкожная инъекция (SC)
Результаты: массы опухолей из каждой экспериментальной и контрольной группы приведены ниже:
N Контрольная группа (г) Экспериментальная группа (г)
1 3,25 0,25
2 3,15 0,63
3 4,13 0,54
4 3,46 0,62
5 3,27 0,64
Σх 17,26 2,68
Х₁ 3,45₂ 0,53₆
Эффективность ингибирования: 84,5%
Эффективность ингибирования определяли по следующей формуле:
1 100
В) Был повторен метод (А) за одним исключением, введение препарата (стабилизатор-глюкоза) осуществляли два раза в сутки и, следовательно, число инъекций составило 20. Массы образцов пяти опытов из каждой контрольной и экспериментальной группы, представлены ниже:
N Контрольная группа, г Экспериментальная группа
1 3,41 0,28
2 3,26 0,31
3 4,38 0,41
4 3,81 0,37
5 4,20 0,29
ΣХ 19,06 1,00
X 3,82₁ 0,32₈
Эффективность ингибирования: 91,4%
С) был повторен метод (А) за одним исключением, в качестве культуры клеток были использованы клетки МКN-1, выделенные из раковой опухоли желудка человека. (В качестве стабилизатора, в препарате использовали глюкозу).

Результаты: массы опухолей образцов каждой контрольной и экспериментальной группы приведены ниже:
N Контрольная группа, г Экспериментальная группа, г
1 5,04 0,73
2 4,41 0,55
3 5,67 0,81
4 4,90 0,69
5 4,93 0,67
ΣХ 24,95 3,45
Х 4,99 0,86
Эффективность ингибирования: 86,2%
Промышленная применимость. Ингибитор пролиферации опухолевых клеток, полученный по предлагаемому способу, представляет собой низкомолекулярное производное вещество, существующее в организмах или пищевых добавках, и не оказывает вредного воздействия на пролиферацию нормальных клеток, что было доказано во всех тестах на токсичность с использованием нормальных клеток. Далее в тестах по ингибированию пролиферации злокачественных опухолевых клеток, трансплантированным белым мышам, было установлено, что через несколько дней после введения ингибитора по предлагаемому способу пролиферация злокачественных клеток останавливалась, а сама опухоль даже без дополнительного введения ингибитора значительно уменьшалась. При введении предлагаемого ингибитора подкожно, поскольку в этом случае его эффективность стабильна, он представляет собой вещество, которое оказывает стабильное пролонгирующее действие на организм. В экспериментах на животных не наблюдалось никаких побочных эффектов, и, следовательно, ингибитор предлагаемого изобретения подходит для использования в качестве эффективного карциностатического средства, которое можно будет использовать без опасений.

Клинические испытания. Метод:1d л раствора (раствора ингибитора) получили растворением 90 г олигомера нейтрализованной соли j-оксипропионовой кислоты и 10 г пироглутаминовой кислоты, содержащей нейтрализованную соль олигопептида в 10% -ном растворе декстрозы. 16 мл этого полученного раствора ингибитора смешали с 500 мл раствора глюкозы, предназначенной для капельного вливания, для использования полученного раствора эффективен метод внутривенного капельного вливания.

П р и м е р 1. Больной раком желудка. При введении вышесказанным путем препарата раз в день в течение десяти дней больному раку желудка (мужчина в возрасте 55 лет), с метастазами в лимфатические узлы и кровотечением через пять дней после введения препарата кровотечение прекратилось, а через 10 дней истощенный организм стал восстанавливаться. Рентгенографическое обследование и обследование в гастрокамере, проведенное через месяц, показало наличие улучшений, например, уменьшение раковой опухоли, разрушившей серозную мембрану и растущей, сплющивание окружной стенки опухоли, а также сглаживание основания язвы.

П р и м е р 2. Больной раком легких (бронхиальный рак). При введении препарата тем же образом раз в день в течение десяти дней раком больному (мужчина в возрасте 45 лет) жаловавшемуся на кровянистую мокроту и раздражающий сухой кашель, рентгеновское обследование которого показало наличие влажного затемнения, а при цитодиагнозе мокроты в ней были обнаружены раковые клетки, установлено, что через шесть дней после начала введения препарата прекратилось кровотечение, смягчился кашель и улучшилось общее состояние. Через два месяца отмечены заметные улучшения в общем состоянии и сокращение затемнения.

Использование: изобретение относится к медицине и иммунохимии и может быть использовано для получения ингибитора пролиферации опухолевых клеток. Сущность изобретения: смешивают низкомолекулярный конденсационный полимер α -гидроксипропионовой кислоты, олигопептид, содержащий, по крайней мере, один остаток пироглутаминовой кислоты, и стабилизатор, включающий сахарид или сахароспирт, и соли металла a -гидрокпропионовой кислоты в качестве катализатора в соотношении (10:1)-(4:1)-(3:05)-1,0. 4 з.п. ф-лы.

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНГИБИТОРА ПРОЛИФЕРАЦИИ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК, отличающийся тем, что он предусматривает смешивание низкомолекулярного конденсационного полимера α -гидроксипропионовой кислоты, олигопептида, содержащего по крайней мере один остаток пироглутаминовой кислоты, стабилизатора, включающего сахарид или сахароспирт, и соли металла a -гидропропионовой кислоты в качестве катализатора в соотношении 10:1-4:1-3:0,5-1,0. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что низкомолекулярный конденсационный полимер a -гидроксипропионовой кислоты получают добавлением 0,7 мл 6 Н. хлористоводородной кислоты к 50 мл L-молочной кислоты и нагреванием с обратным холодильником в течение 2 ч или нагреванием в течение 100 мин при 120 160^oС. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что низкомолекулярный конденсационный полимер a -гидроксипропионовой кислоты получают растворением 0,5 г NaHCO₃ в 50 мл L-молочной кислоты с последующим добавлением толуола и нагреванием полученной смеси в течение 2 ч при 140 160^oС. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что низкомолекулярный конденсационный полимер a -гидроксипропионовой кислоты получают добавлением 2 мл лактата натрия к 50 мл L-молочной кислоты, последующим добавлением 100 мл бензола и нагреванием смеси в течение 3 6 ч при 140^oС. 5. Способ по п.1, отличающийся тем, что низкомолекулярный конденсационный полимер a -гидроксипропионовой кислоты получают добавлением 0,2г MgCl₂ (или CaCl₂) и 150 мл толуола к 50 мл L-молочной кислоты и нагреванием с обратным холодильником смеси в течение 4 ч.