Показать метаданные Скрыть метаданные

(19)

(11)

2 739 201

(13)

(51)

МПК

A61K31/282(2006-01-01)

A61K33/24(2006-01-01)

A61K38/08(2006-01-01)

A61K38/10(2006-01-01)

A61K39/395(2006-01-01)

A61P35/00(2006-01-01)

(21) (22)

Заявка

2018118771, 2016-10-24

(24)

Дата начала отсчета патента

2016-10-24

(22)

дата подачи заявки

2016-10-24

(45)

опубликовано

2020-12-21

(72)

авторы

Кавабе, Такуми

(73)

патентообладатели

Кэнбас Ко., Лтд.

(56)

Документы, цитированные в отчете о поиске

MAHONEY K.Met al., Combination cancer immunotherapy and new immunomodulatory targets., Nature Reviews, 2015.08, Vol.14, p.561-584

ПЕПТИДЫ И ПЕПТИДОМИМЕТИКИ В КОМБИНАЦИИ С АГЕНТАМИ, ИНГИБИРУЮЩИМИ КОНТРОЛЬНЫЕ ТОЧКИ, ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА Российский патент 2020 года по МПК A61K31/282 A61K33/24 A61K38/08 A61K38/10 A61K39/395 A61P35/00

Описание патента на изобретение RU2739201C2

ИНФОРМАЦИЯ О РОДСТВЕННЫХ ЗАЯВКАХ

По этой заявке испрашивается приоритет временной заявки на патент США 62/245, 899, поданной 23 октября 2015, временной заявки на патент США 62/345,416, поданной 3 июня 2016, и заявки на полезную модель в США 15/331,478; поданной 21 октября 2016. Все содержание предшествующих заявок включено в настоящее описание ссылкой, включая весь текст, таблицы и фигуры.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Это изобретение относится к соединениям, включая пептиды и пептидомиметики, имеющим антипролиферативную активность в отношении клеток, индивидуально и в комбинации с лечениями, которые либо активируют Т-клетки, либо ингибируют контрольную точку. Соединения по изобретению могут быть поэтому использованы для ингибирования пролиферации клеток и как таковые для лечения нарушений, связанных с пролиферацией клеток, включая рак.

ВВЕДЕНИЕ

Клеточный цикл включает S-фазу (репликация ДНК), M-фазу (митоз) и две фазы промежутка (фазы G1 и G2) между S- и M-фазами. Контрольные точки в клеточном цикле обеспечивают точную прогрессию, такую как контроль состояния целостности ДНК, репликации ДНК, размера клетки и окружающей среды (Maller, J.L. Curr. Opin. Cell Biol., 3:26 (1991)). Для многоклеточных организмов особенно важно поддерживать целостность генома, и существуют множественные контрольные точки, контролирующие состояние генома. Среди них можно назвать контрольные точки G1 и G2, существующие перед репликацией ДНК и митозом, соответственно. Критически важно осуществить исправление повреждений ДНК до вступления в S-фазу, поскольку репликация однажды поврежденной ДНК часто дает начало мутациям (Hartwell, L. Cell, 71:543 (1992)). Прохождение через контрольные точки G1 и G2 без репарации обширных повреждений ДНК вызывает апоптоз и/или катастрофу.

Большинство раковых клеток несет патологии в связанных с контрольной точкой G1 белках, таких как p53, Rb, MDM-2, p16^INK4 и p19^ARF (Levine, A.J. Cell, 88:323 (1997)). Также мутации могут вызвать суперэкспрессию и/или сверхактивацию онкогенных продуктов, например, Ras, MDM-2 и циклина D, которые уменьшают точность контрольной точки G1. В дополнение к этим мутациям, чрезмерная сигнализация фактора роста может быть вызвана суперэкспрессией факторов роста и может уменьшать точность контрольной точки G1. Вместе с мутациями с потерей и приобретением функции, непрерывная активация рецепторов фактора роста или даунстрим медиаторов может вызывать трансформацию клетки путем игнорирования контрольной точки G1. Подавленная контрольная точка G1 способствует более высоким частотам мутаций и многим мутациям, наблюдаемым в раковых клетках. В результате большинство раковых клеток зависит от контрольной точки G2 для выживания против чрезмерного повреждения ДНК (O'Connor and Fan, Prog. Cell Cycle Res., 2:165 (1996)).

Считается, что механизм, вызывающий остановку клеточного цикла G2 после повреждения ДНК, является консервативным среди всех видов от дрожжей до человека. В присутствии поврежденной ДНК Cdc2/Циклин B киназа сохраняется неактивной из-за ингибирующего фосфорилирования остатков треонина-14 и тирозина-15 на киназе Cdc2 или содержание белка Циклина B снижается. В начале митоза фосфатаза двойной специфичности Cdc25 удаляет эти ингибирующие фосфаты и таким образом активирует Cdc2/Циклин B киназу. Активация Cdc2/Циклина B эквивалентна началу M-фазы.

В делящихся дрожжах протеинкиназа Chk1 требуется для остановки клеточного цикла в ответ на поврежденную ДНК. Киназа Chk1 действует вниз от нескольких продуктов гена rad и модифицируется фосфорилированием после повреждения ДНК. Известно, что киназы Rad53 почкующихся дрожжей и Cds1 делящихся дрожжей проводят сигналы от нереплицировавшейся ДНК. По-видимому, существует некоторое дублирование между Chk1 и Cds1, поскольку удаление как Chk1, так и Cds1 приводило к отмене остановки G2, вызванной поврежденным ДНК. Интересно, что и Chk1, и Cds1 фосфорилируют Cdc25 и промотируют связывание Rad24 с Cdc25, которое изолирует Cdc25 в цитозоле и предотвращает активацию Cdc2/Циклина B. Поэтому Cdc25, по-видимому, является общей мишенью этих киназ, что подразумевает, что эта молекула является обязательным фактором в контрольной точке G2.

У человека как hChk1, человеческий гомолог Chk1 у делящихся дрожжей, так и Chk2/HuCds1, человеческий гомолог Rad53 почкующихся дрожжей и Cds1 делящихся дрожжей, фосфорилируют Cdc25C по серину 216, критическому регуляторному сайту, в ответ на повреждение ДНК. Это фосфорилирование создает связывающий участок для малых кислых белков 14-3-3s, человеческих гомологов Rad24 и Rad25 делящихся дрожжей. Регуляторная роль этого фосфорилирования была ясно показана тем фактом, что замена серина 216 на аланин на Cdc25C отменяла остановку клеточного цикла G2 в клетках человека. Однако механизм контрольной точки G2 не полностью понятен.

Микроокружение опухоли также играет роль в предупреждении или промотировании роста раковых клеток, инвазии, метастазирования и противоопухолевого иммунитета, оказывающую влияние на прогноз для пациента. Было показано, что макрофаги, которые, как когда-то ожидалось, будут работать против раковых клеток, играют как ингибирующую, так и промотирующую роли в развитии опухоли. Макрофаги с классическим противоопухолевым фенотипом, называемым M1, являются провоспалительными, а макрофаги с проопухолевыми и противовоспалительными типами упоминаются как M2 по меньшей мере с тремя главными подтипами в этой категории (Martinez and Gordon, F1000Prime Reports 6:13 (2014)).

Нейтрофильные внеклеточные ловушки (NETs) представляют собой другой элемент микроокружения опухоли вместе с лейкоцитами. В то время как формирование NETs полезно для нейтрофилов с точки зрения борьбы против внедрившихся микроорганизмов, они могут способствовать тромбозу глубоких вен (DVT)(Martinnod and Wanger, Blood (2013)) и метастазированию опухолевых клеток (Cools-Lartigue, J., et al. J. Clin. Invest. (2013)) в больных раком. Таким образом, NETs могут оказывать негативное влияние на выживание пациента. DVT распространен и потенциально летален у больных раком, и лейкоцитоз (который приводит к высокому WBC) является главным фактором риска (Pabinger, I., et al. Blood 122:12 (2013); Blix, K., et al. PLOS One 4:8 (2013); Wang, T.F., et al. Thromb. Res. 133(1):25 (2014)).

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к способам и применениям комбинаций соединений, имеющих одну или более активностей в отношении ингибирования пролиферации клеток, стимуляции апоптоза или катастрофы или подавления контрольной точки G2 клеточного цикла в клетке; или лечения нежелательной пролиферации или выживания клеток, такой(ого) как нарушение, характеризуемый пролиферацией клеток. например, изобретение относится к способам и применениям ингибирования пролиферации клеток; подавления контрольной точки G2 клеточного цикла в клетке; увеличения чувствительности клетки к агенту или лечению, разрушающему нуклеиновую кислоту; увеличения повреждения нуклеиновой кислоты в клетке.

В одном варианте осуществления способ или применение для увеличения повреждения нуклеиновой кислоты гиперпролиферирующей клетки или для профилактики или лечения пролиферативное нарушение у млекопитающего включает введение млекопитающему агента, активирующего Т-клетки, и ингибитора иммунных контрольных точек.

В другом варианте осуществления способ или применение для увеличения повреждения нуклеиновой кислоты гиперпролиферирующей клетки или для профилактики или лечения пролиферативного нарушения у млекопитающего (например, человека), включает введение агента, активирующего Т-клетки, и/или ингибитора иммунных контрольных точек и пептидного соединения, причем пептидное соединение включает любую из следующих последовательностей: A) пептид, включающий остатки, обозначенные P1-P6, со структурой P1, P2, P3, P4, P5, P6 или P6, P5, P4, P3, P2, P1; причем P1 обозначает Cha, Nal(2), (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F), (Phe-4CF3), аминокислоту, занимающую подобное место боковой цепи или любую аминокислоту с одной или двумя группой(ами) из числа ароматической, пиперидина, пиразина, пиримидина, пиперазина, морфолина или пиримидина, или одной группой индола, амилнафталина, индена, нафталина, бензофурана, бензотиофена, хинолина, индолина, хромана, хиноксалина, хиназолина в боковой цепи; причем P2 обозначает Cha, Nal(2), (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F), (Phe-4CF3), Bpa, Phe4NO2, аминокислоту, занимающую подобное место боковой цепи или любую аминокислоту с одной или двумя группой(ами) из числа ароматической, пиперидина, пиразина, пиримидина, пиперазина, морфолина или пиримидина, или одной группой индола, амилнафталина, индена, нафталина, бензофурана, бензотиофена, хинолина, индолина, хромана, хиноксалина или хиназолина в боковой цепи; причем P3, P4, P5 являются любой аминокислотой, или причем один или более P3, P4, P5 является простой углеродной цепью, таким образом, что расстояние между P2 и P6 является приблизительно таким же, как расстояние, когда каждый из P3, P4, P5 является аминокислотой; причем P6 обозначает Bpa, Phe4NO2, любую аминокислоту и Tyr, любую аминокислоту и Phe, любую аминокислоту или ничего; B) или пептид согласно A), в котором аминокислота, имеющая простую углеродную цепь, является 11-аминоундекановой кислотой, 10-аминодекановой кислотой, 9-аминононановой кислотой, 8-аминокаприловой кислотой, 7-аминогептановой кислотой, 6-аминокапроновой кислотой или подобной структурой с одной или более ненасыщенными углеродными связями, и/или причем любая аминокислота представляет собой Ser, и/или причем P4 обозначает Trp, и/или причем аминокислотой, занимающей подобное место боковой цепи, является Tyr или Phe; или пептид, включающий остатки, обозначенные P1-P12, с любой из следующих структур:

P1, P2, P3, P4, P5, P6; P6, P5, P4, P3, P2, P1; P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9, P10, P11, P12; P1, P2, P3, P4, P5, P6, P12, P11, P10, P9, P8, P7; P6, P5, P4, P3, P2, P1, P7, P8, P9, P10, P11, P12; P6, P5, P4, P3, P2, P1, P12, P11, P10, P9, P8, P7; P7, P8, P9, P10, P11, P12, P1, P2, P3, P4, P5, P6; P7, P8, P9, P10, P11, P12, P6, P5, P4, P3, P2, P1; P12, P11, P10, P9, P8, P7, P1, P2, P3, P4, P5, P6; P12, P11, P10, P9, P8, P7, P6, P5, P4, P3, P2, P1; P12, P11, P6, P9, P8, P7, P2, P1; P12, P11, P10, P6, P9, P4, P7, P2, P1; P1, P2, P7, P8, P9, P6, P11, P12; или P1, P2, P7, P4, P9, P6, P10, P11, P12; причем P1 обозначает Cha, Nal(2), (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F), (Phe-4CF3), Bpa, Phe4NO2, аминокислоту, занимающую подобное место боковой цепи (например, d- или l-Tyr, d- или l-Phe), или любую аминокислоту с одной или двумя группой(ами) из числа ароматической, пиперидина, пиразина, пиримидина, пиперазина, морфолина или пиримидина, или одной группой индола, амилнафталина, индена, нафталина, бензофурана, бензотиофена, хинолина, индолина, хромана, хиноксалина или хиназолина в боковой цепи; причем P2 обозначает Cha, Nal(2), (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F), (Phe-4CF3) или аминокислоту, занимающую подобное место боковой цепи, или любую аминокислоту с одной или двумя группой(ами) из числа ароматической, пиперидина, пиразина, пиримидина, пиперазина, морфолина или пиримидина, или одной группой индола, амилнафталина, индена, нафталина, бензофурана, бензотиофена, хинолина, индолина, хромана, хиноксалина, хиназолина в боковой цепи; причем P3, P4, P5 являются любой аминокислотой, или причем один или более P3, P4, P5 является простой углеродной цепью, таким образом, что расстояние между P2 и P6 является приблизительно таким же, как расстояние, когда каждый из P3, P4, P5 является аминокислотой; причем P6 обозначает Bpa, Phe4NO2, любую аминокислоту и Tyr, любую аминокислоту и Phe; и причем по меньшей мере три из P7, P8, P9, P10, P11, P12 являются основными аминокислотами, а остальные являются любой аминокислотой или отсутствуют; или пептид C), в котором аминокислота, имеющая простую углеродную цепь, является 11-аминоундекановой кислотой, 10-аминодекановой кислотой, 9-аминононановой кислотой, 8-аминокаприловой кислотой, 7-аминогептановой кислотой, 6-аминокапроновой кислотой или подобной структурой с одной или более ненасыщенными углеродными связями, и/или в котором любая аминокислота представляет собой Ser, и/или в котором P4 обозначает Trp, и/или в котором аминокислотой, занимающей подобное место боковой цепи, является Tyr или Phe; или пептид, включающий остатки, обозначенные P1-P12 с любой из следующих структур: P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9, P10, P11, P12; P12, P11, P10, P9, P8, P7, P6, P5, P4, P3, P2, P1; P12, P11, P10, P6, P9, P4, P7, P2, P1; или P1, P2, P7, P4, P9, P6, P10, P11, P12; причем P1 обозначает Cha, Nal(2), (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F), (Phe-4CF3), Bpa, Phe4NO2, аминокислоту, занимающую подобное место боковой цепи, или любую аминокислоту с одной или двумя группой(ами) из числа ароматической, пиперидина, пиразина, пиримидина, пиперазина, морфолина или пиримидина, или одной группой индола, амилнафталина, индена, нафталина, бензофурана, бензотиофена, хинолина, индолина, хромана, хиноксалина или хиназолина в боковой цепи; причем P2 обозначает Cha, Nal(2), (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F), (Phe-4CF3), аминокислоту, занимающую подобное место боковой цепи, или любую аминокислоту с одной или двумя группой(ами) из числа ароматической, пиперидина, пиразина, пиримидина, пиперазина, морфолина или пиримидина, или одной группой индола, амилнафталина, индена, нафталина, бензофурана, бензотиофена, хинолина, индолина, хромана, хиноксалина, хиназолина в боковой цепи; причем P3, P4, P5 являются любой аминокислотой, или причем один или более P3, P4, P5 является простой углеродной цепью, таким образом, что расстояние между P2 и P6 является приблизительно таким же, как расстояние, когда каждый из P3, P4, P5 является аминокислотой; причем P6 обозначает Bpa, Phe4NO2, любую аминокислоту и Tyr, любую аминокислоту и Phe, любую аминокислоту или ничего; и причем по меньшей мере три из P7, P8, P9, P10, P11, P12 являются основными аминокислотами, а остальные являются любой аминокислотой или отсутствуют; или пептид E), в котором аминокислота, имеющая простую углеродную цепь, является аминоундекановой кислотой или 8-аминокаприловой кислотой, и/или в котором любая аминокислота представляет собой Ser, и/или в котором аминокислотой, занимающей подобное место боковой цепи, является Tyr или Phe; или пептид, включающий остатки, обозначенные P1-P12, с любой из следующих структур: P1, P2, P3, P4, P5, P6 или P6, P5, P4, P3, P2, P1, причем P1 обозначает Cha, Nal(2), (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F), (Phe-4CF3), Bpa, Phe4NO2, Tyr или Phe; причем P2 обозначает Cha, Nal(2), (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F), (Phe-4CF3), Bpa, Phe4NO2, Tyr или Phe; причем P3 обозначает Ser, Arg, Cys, Pro или Asn; причем P4 обозначает Trp; причем P5 обозначает Ser, Arg или Asn; или причем P3, P4, P5 является единственной аминоундекановой кислотой или единственной 8-аминокаприловой кислотой; и причем P6 обозначает Bpa, Phe4NO2, (Ser-Tyr) или (Ser-Phe); или

пептид, включающий остатки, обозначенные P1-P12, с любой из следующих структур:

P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9, P10, P11, P12; P1, P2, P3, P4, P5, P6, P12, P11, P10, P9, P8, P7; P6, P5, P4, P3, P2, P1, P7, P8, P9, P10, P11, P12; P6, P5, P4, P3, P2, P1, P12, P11, P10, P9, P8, P7; P7, P8, P9, P10, P11, P12, P1, P2, P3, P4, P5, P6; P7, P8, P9, P10, P11, P12, P6, P5, P4, P3, P2, P1; P12, P11, P10, P9, P8, P7, P1, P2, P3, P4, P5, P6; P12, P11, P10, P9, P8, P7, P6, P5, P4, P3, P2, P1; P12, P11, P6, P9, P8, P7, P2, P1; P12, P11, P10, P6, P9, P4, P7, P2, P1; P1, P2, P7, P8, P9, P6, P11, P12; или P1, P2, P7, P4, P9, P6, P10, P11, P12; причем P1 обозначает Cha, Nal(2), (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F), (Phe-4CF3), Bpa, Phe4NO2, Tyr или Phe; причем P2 обозначает Cha, Nal(2), (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F), (Phe-4CF3), Bpa, Phe4NO2, Tyr или Phe; причем P3 обозначает Ser, Arg, Cys, Pro или Asn; причем P4 обозначает Trp; причем P5 обозначает Ser, Arg или Asn; или причем P3, P4, P5 является единственной аминоундекановой кислотой или единственной 8-аминокаприловой кислотой; причем P6 обозначает Bpa, Phe4NO2, (d-Ser-d-Tyr) или (d-Ser-d-Phe); и причем по меньшей мере три из P7, P8, P9, P10, P11, P12 являются Arg или Lys, а остальные являются любой аминокислотой или отсутствуют; или

пептид, включающий остатки, обозначенные P1-P12, с любой из следующих структур:

P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9, P10, P11, P12; P12, P11, P10, P9, P8, P7, P6, P5, P4, P3, P2, P1; P12, P11, P10, P6, P9, P4, P7, P2, P1; или P1, P2, P7, P4, P9, P6, P10, P11, P12; причем P1 обозначает Cha или Nal(2); причем P2 обозначает (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F), (Phe-4CF3); причем P3 обозначает Ser; причем P4 обозначает Trp; причем P5 обозначает Ser или Asn; причем P6 обозначает Bpa, Phe4NO2, (Ser-Tyr) или (Ser-Phe); и причем по меньшей мере три из P7, P8, P9, P10, P11, P12 обозначают Arg, а остальные являются любой аминокислотой или отсутствуют; или пептид, включающий остатки, обозначенные P1-P12, с любой из следующих структур: P1, P2, P3, P4, P5, P6 или P6, P5, P4, P3, P2, P1; причем P1 обозначает Cha или Nal(2); причем P2 обозначает (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F) или (Phe-4CF3); причем P3 обозначает Ser; причем P4 обозначает Trp; причем P5 обозначает Ser; и причем P6 обозначает Bpa или (Ser-Tyr); или

пептид, включающий остатки, обозначенные P1-P12, с любой из следующих структур:

пептид K), в котором любая аминокислота представляет собой Ser или Pro; или

пептид, включающий остатки, обозначенные P1-P12, с любой из следующих структур:

его пролекарства или его фармацевтически приемлемой соли млекопитающему с увеличением, таким образом, повреждения нуклеиновой кислоты гиперпролиферирующей клетки или профилактикой или лечением пролиферативного нарушения.

В некоторых вариантах осуществления, в способе или применении используют пептидное соединение, включающее любую из следующих последовательностей: (d-Bpa)(d-Ser)( d-Trp)( d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)( d-Cha)( d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)( d-Arg)(d-Arg);

(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)( d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)( d-Ser)( d-Trp)( d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha);

(d-Bpa)(d-Ser)( d-Trp)( d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)( d-Cha)( d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg);

(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Ser)( d-Trp)( d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)( d-Cha);

(d-Cha)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Ser)( d-Trp)( d-Ser)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)( d-Arg)(d-Arg);

(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(d-Cha)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Bpa);

(d-Cha)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg);

(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Cha)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Ser)( d-Trp)( d-Ser)(d-Bpa);

(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Cha)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Bpa);

(d-Cha)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg);

(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Ser)( d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha);

(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg);

(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)( d-Cha);

(d-Cha)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)( d-Arg);

(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Trp)(d-Arg)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha);

(d-Cha)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Arg)(d-Trp)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg); (d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Trp)(d-Arg)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha); (d-Cha)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Arg)(d-Trp)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg);

(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha); или (d-Cha)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg).

В некоторых других вариантах осуществления, в способе или применении используют пептидное соединение, включающее или состоящее из любой из следующих последовательностей: (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(SEQ ID NO:1); (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg) или (d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha).

В некоторых других вариантах осуществления, в способе или применении используют агент, активирующий Т-клетки. Неограничивающие примеры агентов, активирующих Т-клетки, включают агенты, нацеливающиеся на CD28 (антиген клеточной дифференцировки 28, также известный как Tp44, специфичный для Т-клеток поверхностный гликопротеид, антиген CD28, молекула CD28), OX40 (Суперсемейство рецептора фактора некроза опухоли, член 4, TNFRSF4, также известный как Рецептор OX40L, Антиген OX40, TXGP1L), GITR (глюкокортикоид-индуцируемый рецептор фактора некроза опухоли), CD137 (также известный как 4-1BB), CD27 (также известный как TNFRSF7, Tp55), и HVEM (медиатор проникновения вируса герпеса, также известный как CD270, TNFRSF14).

Репрезентативные агенты, активирующие Т-клетки, включают лиганды, связывающиеся с такими мишенями, например, лиганды CD28, OX40, GITR, CD137, CD27 и HVEM. Репрезентативные агенты, активирующие Т-клетки, также включают антитела, связывающиеся с такими мишенями, например, антитела анти-CD28, анти-OX40, анти-GITR, анти-CD137, анти-CD27 и анти-HVEM.

В некоторых других вариантах осуществления, в способе или применении используют ингибитор иммунной контрольной точки. Неограничивающие примеры ингибиторов иммунной контрольной точки включают агенты, нацеливающиеся на CTLA-4 (цитотоксический Т-лимфоцит-ассоциированный белок 4, также известный как CD152), PD1 (Programmed Cell Death 1, также известный как CD279, SLEB2, HPD-1, HSLE1), PDL1 (Programmed death-ligand 1, также известный как CD274, B7-H1 (B7 гомолог 1), Programmed Cell Death 1 Лиганд 1, Лиганд PDCD1 1), PDL2 (Programmed Cell Death 1 лиганд 2), VISTA (супрессор V-области Ig активации Т-клеток, также известный как, B7-H5, Gi24, Dies1 и SISP1), TIM3 (область 3 иммуноглобулина и муцина Т-клетки), LAG 3 (Ген Активации лимфоцита 3, также известный как CD223) или BTLA (аттенюатор B- и Т-клеток, также известный как CD272).

Репрезентативные ингибиторы иммунной контрольной точки включают лиганды, связывающиеся с такими мишенями, например, лиганды CTLA-4, PD1, PDL1, PDL2, VISTA, TIM3, LAG 3 и BTLA. Репрезентативные ингибиторы иммунной контрольной точки также включают антитела, связывающиеся с такими мишенями, например, анти-CTLA-4, анти-PD1, анти-PDL1, анти-PDL2, анти-VISTA, анти-TIM3, анти-LAG-3 и анти-BTLA антитела.

В некоторых дополнительных вариантах осуществления, способ или применение практикуют на млекопитающем с количеством лейкоцитов в нормальном диапазоне; млекопитающем с количеством лейкоцитов менее чем приблизительно 11000 лейкоцитов на микролитр (БКК/мкл) крови; млекопитающем с количеством лейкоцитов от приблизительно 4000 до приблизительно 11000 лейкоцитов на микролитр (БКК/мкл) крови; млекопитающем с количеством лейкоцитов менее чем приблизительно 10000 лейкоцитов на микролитр (БКК/мкл) крови; млекопитающем с количеством лейкоцитов менее чем приблизительно 9000 лейкоцитов на микролитр (БКК/мкл) крови; млекопитающем с количеством лейкоцитов от приблизительно 4000 до приблизительно 9000 лейкоцитов на микролитр (БКК/мкл) крови; млекопитающем с количеством лейкоцитов менее чем приблизительно 8000 лейкоцитов на микролитр (БКК/мкл) крови; млекопитающем с количеством лейкоцитов менее чем приблизительно 7000 лейкоцитов на микролитр (БКК/мкл) крови; или млекопитающем с количеством лейкоцитов менее верхнего нормального предела содержания лейкоцитов на микролитр (БКК/мкл) крови согласно всем клиническим лабораториям.

Способы и применения включают пептидное соединение в фармацевтическом составе. Способы и применения также включают агент, активирующий Т-клетки, и/или ингибитор иммунной контрольной точки в фармацевтическом составе. Способы и применения по изобретению также включают введение любым путем. В некоторых вариантах осуществления пептидное соединение вводят локально, регионарно или системно.

Способы и применения включают фармацевтически приемлемую соль пептидного соединения. В некоторых аспектах фармацевтически приемлемая соль представляет собой любую из следующих или их комбинацию: ацетат, сульфонат, сульфат, пиросульфат, бисульфат, сульфит, бисульфит, фосфат, моногидрофосфат, дигидрофосфат, метафосфат, пирофосфат, хлорид, бромид, йодид, пропионат, деканоат, каприлат, акрилат, формиат, изобутират, капроат, гептаноат, пропиолат, оксалат, малонат, сукцинат, суберат, себацинат, фумарат, малеат, бутин-1,4-диоат, гексин-1,6-диоат, бензоат, хлорбензоат, метилбензоат, динитробензоаты, гидроксибензоаты, метоксибензоаты, фталаты, ксилолсульфонат, фенилацетат, фенилпропионат, фенилбутират, цитрат, лактат, γ-гидроксибутират, гликолят, тартрат, метан сульфонат, пропансульфонат, нафталин-1-сульфонат, нафталин-2-сульфонат и манделат.

Способы и применения включают пептидное соединение, включающее или состоящее из 6-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-40, 40-50, 50-75, 75-100, 100-150, 150-200 или 200-300 аминокислотных остатков в длину.

Способы и применения включают пептидное соединение, включающее или состоящее из молекулы проникновения в клетку, присоединенной или конъюгированной к нему. В некоторых неограничивающих аспектах молекула проникновения в клетку присоединена к пептидному соединению ковалентной связью или пептидным или непептидным линкером. В некоторых других неограничивающих аспектах пептид проникновения в клетку включает переменную структуру из полярных/заряженных аминокислот и неполярных гидрофобных аминокислот. В других частных неограничивающих аспектах пептид проникновения в клетку включает поликатионную или амфифильную структуру альфа-спирали. В других частных неограничивающих аспектах пептид проникновения в клетку включает последовательность полиаргинина (Arg)(например, пептид, включающий или состоящий из (d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)).

В других частных аспектах, пептидное соединение и/или пептид проникновения в клетку и/или агент, активирующий Т-клетки, и/или ингибитор иммунной контрольной точки включает или состоит из L- или D-изомера аминокислот или смеси L- и D-изомеров аминокислот.

В некоторых дополнительных вариантах осуществления, способ или применение включает введение агента, активирующего Т-клетки, и пептидного соединения. В некоторых дополнительных вариантах осуществления, способ или применение включает введение ингибитора иммунных контрольных точек и пептидного соединения. В некоторых дополнительных вариантах осуществления, способ или применение включает введение агента, активирующего Т-клетки, и ингибитора иммунных контрольных точек и пептидного соединения.

В некоторых других вариантах осуществления, способ или применение включает введение агента, разрушающего нуклеиновую кислоту, лечения, разрушающего нуклеиновую кислоту, антипролиферативного агента или антипролиферативного лечения. Неограничивающие примеры агента, разрушающего нуклеиновую кислоту, лечения, разрушающего нуклеиновую кислоту, антипролиферативного агента или антипролиферативного лечения включают или состоят из хирургической резекции, лучевой терапии, ионизирующей или химической радиационной терапии, химиотерапии, иммунотерапии, местной или регионарной тепловой (гипертермия) терапии, вакцинации, алкилирующего агента, антиметаболита, растительного экстракта, растительного алкалоида, нитрозомочевины, гормона или аналога нуклеотида или нуклеозида.

В некоторых дополнительных вариантах осуществления, способ или применение дополнительно включает или состоит из пептидного соединения, вводимого до, вместе с или после введения агента, активирующего Т-клетки. В некоторых дополнительных вариантах осуществления, способ или применение дополнительно включает или состоит из пептидного соединения, вводимого до, одновременно с или после введения ингибитора иммунных контрольных точек. В некоторых дополнительных вариантах осуществления, способ или применение дополнительно включает или состоит из пептидного соединения, вводимого в комбинации с агентом, активирующим Т-клетки. В некоторых дополнительных вариантах осуществления, способ или применение дополнительно включает или состоит из пептидного соединения, вводимого в комбинации с ингибитором иммунной контрольной точки. В некоторых дополнительных вариантах осуществления, способ или применение дополнительно включает или состоит из пептидного соединения, вводимого в комбинации с агентом, активирующим Т-клетки, и ингибитором иммунной контрольной точки.

В частных аспектах пептидное соединение вводят менее чем за 48 часов до или после введения агента, активирующего Т-клетки, и/или ингибитора иммунных контрольных точек; пептидное соединение вводят менее чем 24 часа до или после введения агента, активирующего Т-клетки, и/или ингибитора иммунных контрольных точек; пептидное соединение вводят менее чем за 12 часов до или после введения агента, активирующего Т-клетки, и/или ингибитора иммунных контрольных точек; пептидное соединение вводят менее чем за 6 часов до или после введения агента, активирующего Т-клетки, и/или ингибитора иммунных контрольных точек; пептидное соединение вводят менее чем 4 часа до или после введения агента, активирующего Т-клетки, и/или ингибитора иммунных контрольных точек, пептидное соединение вводят менее чем за 2 часа до или после введения агента, активирующего Т-клетки, и/или ингибитора иммунных контрольных точек; пептидное соединение вводят менее чем за 1 час до или после введения агента, активирующего Т-клетки, и/или ингибитора иммунных контрольных точек.

В некоторых дополнительных вариантах осуществления, способ или применение дополнительно включает или состоит из пептидного соединения, агента, активирующего Т-клетки, и/или ингибитора иммунных контрольных точек, вводимого до, одновременно с или после агента, разрушающего нуклеиновую кислоту, лечения, разрушающего нуклеиновую кислоту, антипролиферативного агента или антипролиферативного лечения. В частных аспектах, пептидное соединение, агент, активирующий Т-клетки, и/или ингибитор иммунной контрольной точки вводят менее чем за 48 часов до или после агента, разрушающего нуклеиновую кислоту, лечения, разрушающего нуклеиновую кислоту, антипролиферативного агента или антипролиферативного лечения; пептидное соединение, агент, активирующий Т-клетки и/или ингибитор иммунной контрольной точки вводят менее чем за 24 часа до или после агента, разрушающего нуклеиновую кислоту, лечения, разрушающего нуклеиновую кислоту, антипролиферативного агента или антипролиферативного лечения; пептидное соединение, агент, активирующий Т-клетки, и/или ингибитор иммунной контрольной точки вводят менее чем за 12 часов до или после агента, разрушающего нуклеиновую кислоту, лечения, разрушающего нуклеиновую кислоту, антипролиферативного агента или антипролиферативного лечения; пептидное соединение, агент, активирующий Т-клетки, и/или ингибитор иммунной контрольной точки вводят менее чем 6 часов до или после агента, разрушающего нуклеиновую кислоту, лечения, разрушающего нуклеиновую кислоту, антипролиферативного агента или антипролиферативного лечения; пептидное соединение, агент, активирующий Т-клетки, и/или ингибитор иммунной контрольной точки вводят менее чем за 4 часа до или после агента, разрушающего нуклеиновую кислоту, лечения, разрушающего нуклеиновую кислоту, антипролиферативного агента или антипролиферативного лечения; пептидное соединение, агент, активирующий Т-клетки, и/или ингибитор иммунной контрольной точки вводят менее чем за 2 часа до или после агента, разрушающего нуклеиновую кислоту, лечения, разрушающего нуклеиновую кислоту, антипролиферативного агента или антипролиферативного лечения; пептидное соединение, агент, активирующий Т-клетки, и/или ингибитор иммунной контрольной точки вводят менее чем за 1 час до или после агента, разрушающего нуклеиновую кислоту, лечения, разрушающего нуклеиновую кислоту, антипролиферативного агента или антипролиферативного лечения.

Неограничительные примеры агента, разрушающего нуклеиновую кислоту, или антипролиферативного агента включают лекарственное средство. Неограничительные примеры агента, разрушающего нуклеиновую кислоту, или антипролиферативного агента включают платина-содержащее лекарственное средство, такое как цисплатин, карбоплатин, недаплатин, митаплатин, сатраплатин, пикоплатин, триплатин, мириплатин или оксалиплатин.

В частности, способы и применения включают или состоят из введения платина-содержащего лекарственного средства, цисплатина, карбоплатина, оксалиплатина, пеметрекседа, гемцитабина, 5-фторурацила (5-FU), ребеккамицина, адриамицина (ADR), блеомицина (Bleo), пеплеомицина, цисплатина, цисплатины или цис-диаминдихлорплатины (II)(CDDP), оксалиплатина или камптотецина (CPT), циклофосфамида, азатиоприна, циклоспорина A, преднизолона, мелфалана, хлорамбуцила, мехлорэтамина, бисульфана, метотрексата, 6-меркаптопурина, тиогуанина, 5-фтороурацила, цитозин арабинозида, AZT, 5-азацитидина (5-AZC) или родственного 5-азацитидину соединения, актиномицина D, митрамицина, митомицина C, кармустина, ломустина, семустина, стрептозотоцина, гидроксимочевины, цисплатина, митотана, прокарбазина, дакарбазина, таксана, винбластина, винкристина, доксорубицина, дибромманнита, облучения или радиоизотопа.

Частные неограничивающие примеры облучения включают УФ-облучение, ИК-облучение, рентгеновское или альфа-, бета- или гамма-облучение. Частные неограничивающие примеры радиоизотопов включают I¹³¹, I¹²⁵, Sr⁸⁹, Sm¹⁵³, Y⁹⁰ или Lu¹⁷⁷.

Способы и применения по изобретению применимы к пролиферативному или гиперпролиферативному нарушению или нежелательной пролиферации клеток. В некоторых вариантах осуществления пролиферативное нарушение включает опухоль или рак. В более частных вариантах осуществления пролиферативное нарушение включает метастатическую опухоль или рак.

Частные неограничивающие примеры опухоли или рака включают опухоль или рак легкого, такой как мелкоклеточный или немелкоклеточный рак легких, или аденокарциному, плоскоклеточный рак или крупноклеточный рак. Другие частные неограничивающие примеры опухоли или рака включают рак, саркому, лимфому, лейкоз, аденому, аденокарциному, меланому, глиому, глиобластому, менингиому, нейробластому, ретинобластому, астроцитому, олигодендроцитому, мезотелиому, ретикулоэндотелиальную, лимфатическую или гематопоэтическую неоплазию, опухоль, рак или злокачественное образование. Дополнительными частными неограничивающими примерами опухоли или рака являются опухоль или рак легкого, щитовидной железы, головы или шеи, носоглотки, горла, носа или пазухов, мозга, позвоночного столба, молочной железы, надпочечника, гипофиза, щитовидной железы, лимфы, желудочно-кишечного тракта (рта, пищевода, желудка, двенадцатиперстной кишки, подвздошной кишки, тощей кишки (тонкой кишки), толстой кишки, прямой кишки), мочеполовой системы (матки, яичника, шейки, эндометрия, мочевого пузыря, яичка, члена, предстательной железы), почки, поджелудочной железы, печени, кости, костного мозга, лимфы, крови, мышц или неоплазия кожи. Другие частные неограничивающие примеры опухоли или рака включают рак молочной железы, рак предстательной железы, рак поджелудочной железы, рак желудка, плевральную мезотелиому, рак толстой кишки, рак прямой кишки, рак толстой кишки, рак тонкой кишки, рак пищевода, рак двенадцатиперстной кишки, рак языка, фарингеальный рак, рак слюнной железы, опухоль мозга, шванному, рак печени, рак почек, рак желчного протока, рак эндометрия, рак шейки матки, рак тела матки, рак яичника, рак мочевого пузыря, рак уретры, рак кожи, ангиому, злокачественную лимфому, злокачественную меланому, рак щитовидной железы, рак паращитовидной железы, рак носа, рак околоносовых пазух, рак органа слуха, карциному дна полости рта, рак гортани, рак околоушной железы, подчелюстной рак, опухоль кости, ангиофиброму, сетчаточную саркому, рак полового члена, опухоль яичек, педиатрический солидный рак, саркому Капоши, опухоль верхнечелюстной пазухи, фиброзную гистиоцитому, лейомиосаркому, рабдомиосаркому, лимфому, множественную миелому или лейкоз.

Частные неограничивающие примеры саркомы включают лимфосаркому, липосаркому, остеосаркому, хондросаркому, лейомиосаркому, рабдомиосаркому или фибросаркому. Частные неограничивающие примеры гематопоэтической опухоли, рака или злокачественного образования включают миелому, лимфому или лейкоз.

Способы и применения по изобретению включают введение количества пептидного соединения, эффективного для лечения опухоли или рака. В частных аспектах, способ или применение ингибирует или уменьшает рецидив, рост, прогрессию, ухудшение или метастаз опухоли или рака; приводит к частичной или полной деструкции неопластического образования, опухоли, массы раковых или злокачественных клеток, объема, размера или числа клеток, стимуляции, индукции или увеличения некроза, лизиса или апоптоза неопластического образования, опухоли, раковой или злокачественной клетки, ослаблению объема или размера неоплазии, опухоли, рака, злокачественного образования, клеточной массы, ингибирования или предотвращения прогрессии или увеличения неоплазии, опухоли, рака или объема неопластического образования, массы, размера или числа клеток или увеличению продолжительности жизни; приводит к ослаблению или уменьшению серьезности, продолжительности или частоты неблагоприятного симптома или осложнений, связанных с или вызванных неоплазией, опухолью, раком или злокачественным образованием; или способ приводит к ослаблению или уменьшению боли, дискомфорта, тошноты, слабости или летаргии или приводит к увеличению энергии, аппетита, улучшению мобильности или психологического самочувствия.

В некоторых других аспектах, способ или применение стимулирует, индуцирует или увеличивает популяцию CD8 (=CD45+CD8+) Т-клеток при неоплазии, опухоли, раке или злокачественном образовании. Стимулированная, индуцированная или увеличенная популяция Т-клеток при неоплазии, опухоли, раке или злокачественном образовании может быть последствием большего выживания и/или инфильтрации CD8 (=CD45+CD8+) Т-клеток.

В некоторых других аспектах, способ или применение снижает или уменьшает популяцию макрофагов M2 (=F4/80+ CD206+) при неоплазии, опухоли, раке или злокачественном образовании. Сниженная или уменьшенная популяция макрофагов M2 (=F4/80+ CD206+) при неоплазии, опухоли, раке или злокачественном образовании может быть следствием меньшего выживания и/или инфильтрации макрофагов M2 (=F4/80+ CD206+).

Кроме того, изобретение относится к наборам, включающим пептидные соединения, агенты, активирующие Т-клетки, и/или ингибиторы иммунной контрольной точки, в случае необходимости в комбинации с лечением, разрушающим нуклеиновую кислоту (например, агентом, разрушающий нуклеиновую кислоту), или антипролиферативным агентом. В одном варианте осуществления набор включает пептидное соединение и инструкции по использованию в осуществлении способа по изобретению. В другом варианте осуществления набор включает пептидное соединение, агент, активирующий Т-клетки, и/или ингибитор иммунной контрольной точки и инструкции по использованию в осуществлении способа по изобретению. В другом варианте осуществления набор включает пептидное соединение, ингибитор иммунной контрольной точки и/или агент, активирующий Т-клетки, и инструкции по использованию в осуществлении способа по изобретению. В дополнительном варианте осуществления набор включает пептидное соединение, агент, активирующий Т-клетки, и/или ингибитор иммунной контрольной точки и инструкции по использованию в осуществлении способа по изобретению. В другом варианте осуществления набор включает пептидное соединение, агент, активирующий Т-клетки, и ингибитор иммунной контрольной точки и инструкции по использованию в осуществлении способа по изобретению.

ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фигура 1 показывает кривую доза-эффект каждого соединения, используемого против обработанных блеомицином клеток Jurkat. Ось X показывает дозу, и Ось Y показывает %G2/M клеток после лечения.

Фигура 2 показывает кривую доза-эффект каждого соединения, используемого против обработанных колхицином клеток Jurkat. Ось X показывает дозу, и Ось Y показывает %G2/M клеток после лечения.

Фигуры 3A и 3B клеточная линия MIAPaCa2, полученная из клеток рака поджелудочной железы человека, обработанная (A) блеомицином (Bleo) или (B) адриамицином (ADR) с различными дозами соединений. Собранные клетки окрашивали для визуализации ДНК и анализировали проточной цитометрией. % популяции sub-G1 клеток обозначен как мертвые клетки.

Фигуры 4А - 4C являются схематической диаграммой отношения структура-активность ингибитора контрольной точки G2 (l-Gly)(l-Arg)(l-Lys)(l-Lys)(l-Arg)(l-Arg)(l-Gln)(l-Arg)(l-Arg)(л-Cha)(l-Phe-2,3,4,5,6-F)(l-Arg)(l-Ser)(l-Pro)(l-Ser)(l-Tyr)(l-Tyr)(SEQ ID NO:78): (A) активность ингибирования контрольной точки G2 аминокислотных замен для l-Cha в обработанных блеомицином клетках Jurkat представлена в следующем порядке: [l-Cha=l-Nal(2)] > [l-Ala(3-Bzt)=l-Nal(1)=l-Trp=l-Dph] > [l-Ala(tBu)=Cys(tBu)=Leu]; (B) активность ингибирования контрольной точки M фазы и/или неспецифическая токсичность аминокислотных замен для l-Cha в обработанных холхицином клетках Jurkat в следующем порядке: [Ala(3-Bzt)=l-Nal(1)=l-Dph] > [l-Cha=l-Nal(2)]; (C) Активность ингибирования контрольной точки G2 аминокислотных замен для l-Phe-2,3,4,5,6-F в следующем порядке: l-(Phe-2,3,4,5,6-F)=l-(Phe-3,4,5-F)=l-(Phe-4CF3)] > [l-(Phe-3Br,4Cl,5Br) =l-(Phe-4Cl)=l-Tyr].

Фигура 5 показывает активность ингибирования G2 различных богатых аргинином последовательностей. Обозначенные пептиды были добавлены к клеткам Jurkat с или без блеомицина. %G2/M клеток показан на Оси Y. Ось X является следующей: 1, только блеомицин; 2, 0,2 мкг/мл; 3, 0,39 мкг/мл; 4, 0,78 мкг/мл; 5, 1,56 мкг/мл; 6, 3,125 мкг/мл; 7, 6,25 мкг/мл; 8, 12,5 мкг/мл; 9, 25 мкг/мл; и 10, 50 мкг/мл. Пептидные последовательности являются следующими: rrrqrrkkr, (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(d-Lys)(d-Lys)(d-Arg) (SEQ ID NO:79); CBP501, (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg) (SEQ ID NO:80); без TAT, (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (SEQ ID NO:81); rqrr, (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg) (SEQ ID NO:82); rrqrr, (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg) (SEQ ID NO:83); rrrq, (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln) (SEQ ID NO:84); и rrrqr, (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg) (SEQ ID NO:85).

Фигура 6 показывает активность ингибирования G2 различных пептидов без (d-Bpa). Обозначенные пептиды были добавлены к клеткам Jurkat с или без блеомицина. %G2/M клеток показан на Оси Y. Ось X является следующей: 1, только блеомицин; 2, 0,2 мкг/мл; 3, 0,39 мкг/мл; 4, 0,78 мкг/мл; 5, 1,56 мкг/мл; 6, 3,125 мкг/мл; 7, 6,25 мкг/мл; 8, 12,5 мкг/мл; 9, 25 мкг/мл; и 10, 50 мкг/мл. Пептидные последовательности являются следующими: CBP0, (d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg) (SEQ ID NO:86); CBP451, (d-Tyr)(d-Ser)(d-Pro)(l-Trp)(l-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg) (SEQ ID NO:87); CBP452, (d-Tyr)(d-Ser)(l-Pro)(l-Trp)(l-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg) (SEQ ID NO:88); и CBP501, (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg) (SEQ ID NO:80).

Фигура 7 показывает активность ингибирования G2 различных богатых аргинином и богатых лизином пептидных последовательностей. Обозначенные пептиды добавляли к клеткам Jurkat, как описано выше, и вычисляли %G2/M клеток (Ось Y). Пептидные последовательности являются следующими: CBP603, (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe4NO2)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg) (SEQ ID NO:89); CBP607, (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg) (SEQ ID NO:90); CBP608, (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg) (SEQ ID NO91:); и CBP609, (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Lys)(d-Lys)(d-Lys)(d-Lys)(d-Lys)(d-Lys)(SEQ ID NO:92).

Фигура 8 показывает, что местоположение богатой аргинином части последовательности может варьировать. Обозначенные пептиды добавляли к клеткам Jurkat, как описано выше, и вычисляли %G2/M клеток (Ось Y). Пептидные последовательности являются следующими: CBP501, (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg) (SEQ ID NO:80); CBP510, (d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Cha)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Bpa) (SEQ ID NO:93); CBP511, (d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (SEQ ID NO:94); и CBP512, (d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Cha)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Bpa) (SEQ ID NO:95).

Фигура 9 показывает структуру нескольких изученных замещенных пептидных последовательностей. Активность ингибирования G2 увеличивалась в случае обозначенных более светлым цветом замещений (*),активность ингибирования контрольной точки M фазы и/или неспецифическая токсичность увеличивалась в случае обозначенных более темным цветом замещений (**) и оставалась приблизительно такой же для остальной части замещений.

Фигура 10 показывает ингибирование роста опухоли (человеческий рак поджелудочной железы) у scid мышей после лечения CBP501 и цисплатином. День 0 показывает инициацию лечения. Средние размеры опухоли со стандартным отклонением для каждой контрольной группы обозначены на Оси Y, и число дней после инициации лечения обозначено на Оси X.

Фигура 11 показывает активность ингибирования G2 пептидов, имеющих область ингибирующей киназу последовательности и область последовательности, основанную на последовательности трансдукции HIV-TAT, как описано выше. %G2/M клеток показан на Оси Y. Ось X является следующей: 1, только блеомицин; 2, 0,2 мкг/мл; 3, 0,39 мкг/мл; 4, 0,78 мкг/мл; 5, 1,56 мкг/мл; 6, 3,125 мкг/мл; 7, 6,25 мкг/мл; 8, 12,5 мкг/мл; 9, 25 мкг/мл; и 10, 50 мкг/мл. Пептидные последовательности являются следующими: CBP501, (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg) (SEQ ID NO:80); CBP700, (d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (SEQ ID NO:96); CBP701, (d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Trp)(d-Arg)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (SEQ ID NO:97); CBP702, (d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Trp)(d-Arg)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (SEQ ID NO:98); CBP703, (d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (SEQ ID NO:99).

Фигура 12 показывает сравнение между активностью ингибирования G2 и активностью ингибирования М и/или неспецифической токсичностью пептидов с блеомицином для анализа ингибирования G2 и колхицином для активности ингибирования M и/или неспецифической токсичности. Обозначенные пептиды добавляли к клеткам Jurkat с блеомицином или колхицином. %G2/M клеток представлен на Оси Y. Ось X является следующей: 1, только блеомицин или только колхицин; 2, 0,2 мкг/мл; 3, 0,39 мкг/мл; 4, 0,78 мкг/мл; 5, 1,56 мкг/мл; 6, 3,125 мкг/мл; 7, 6,25 мкг/мл; 8, 12,5 мкг/мл; 9, 25 мкг/мл; и 10, 50 мкг/мл. Пептидные последовательности являются следующими: CBP501, (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg).

Фигура 13 показывает молекулярную структуру CBP501, (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg).

Фигура 14 показывает анализ Кэплан-Мейера полного выживания у всех получавших лечение пациентов относительно начального WBC: кривые выживания Кэплан-Мейера, Медиану ОВ и Отношение риска относительно начального WBC у всех получавших лечение пациентов. Отношение риска улучшается по мере уменьшения уровня отсечки и выходит на пик при WBC 8000/мкл как уровень отсечки.

Фигура 15 показывает анализ Кэплан-Мейера полного выживания у ICON зарегистрированных пациентов относительно начального WBC: кривые выживания Кэплан-Мейера, Медиану ОВ и Отношение риска относительно начального WBC у ICON зарегистрированных пациентов. Отношение риска улучшается по мере уменьшения уровня отсечки и выходит на пик при WBC 8000/мкл как уровень отсечки, и различие между Кривой A и Кривой B было статистически значимым на пике.

Фигура 16 показывает кривые выживания Кэплан-Мейера, Медиану ОВ, число пациентов, отношение риска и значения p согласно лог-ранговому критерию (Mantel-Cox) относительно WBC, >8000 или <8000, в скрининге на всей получавшей лечение популяции, показанной на кривых.

Фигура 17 показывает увеличенное формирование NET активированными нейтрофилами при обработке CBP501.

Фигура 18 показывает увеличенные комплексы тромбина/антитромбина CBP501 in vivo.

Фигуры 19A и 19B показывают ингибируемый CBP501 фагоцитоз макрофагов M1 и M2 in vitro.

Фигура 20 показывает супрессию высвобождения TNF из клеточной линии макрофагой мышей (RAW264,7).

Фигуры 21A-21C показывают, что CBP501 усиливает эффект CDDP на распределение фаз клеточного цикла в клетках CT26 WT. Клетки CT26WT (мышиная колоректальная клеточная линия) были обработаны множественными дозами CDDP (Ось X, мкг/мл) в комбинации с множественными дозами CBP501 (0,0625 мкМ, 0,125 мкМ, 0,25 мкМ, 0,5 мкМ и 1 мкМ) в течение 3 часов с последующей промывкой PBS и заменой среды. Два дня спустя распределение фаз клеточного цикла (Ось Y) и некроз клеток анализировали BD FACSCalibur с окрашиванием пропидий йодидом.

Фигуры 22A и 22B показывают, что CBP501 усиливает CDDP-индуцированное фосфорилирование eIF2-альфа. Клетки CT26WT обрабатывали 10-20 мкМ CDDP в комбинации с 0,5 мкМ CBP501 в течение 45 минут с последующей промывкой PBS и добавлением новой среды. День спустя клетки собирали и анализировали иммуноблоттингом с использованием специфического антитела к фосфо-eIF2-альфа (n=8)(Фиг. 2A), и количество относительного фосфо-eIF2-альфа определяли количественно (Фиг. 2B). Образцы сравнивали с помощью t-теста Стьюдента. *P <0,05 **P <0,01, по сравнению с необработанными клетками и ^†P <0,05, ^††P <0,01, по сравнению с одним соответствующим CDDP.

Фигура 23 показывает, что CBP501 усиливает CDDP-индуцированное экспонирование поверхности клеток к калретикулину. Клетки CT26WT обрабатывали 10-20 мкМ CDDP в комбинации с 0,5 мкМ CBP501 в течение 45 минут с последующей промывкой PBS и добавлением новой среды. Два дня спустя клетки собирали и анализировали FACS со специфическим к калретикулину антителом и пропидий йодидом (n=3). Образцы сравнивали с помощью t-теста Стьюдента. *P <0,05 **P <0,01 по сравнению с необработанными клетками и ^†P <0,05, ^††P <0,01 по сравнению с одним соответствующим CDDP.

Фигура 24 показывает, что CBP501 потенцирует CDDP-индуцированную секрецию HMGB1. Клетки CT26WT обрабатывали с 20 мкМ CDDP в комбинации с 0,5 мкМ CBP501 в течение 45 минут с последующей промывкой PBS и добавлением новой среды. Секретированный в среду HMGB1 собирали через 24, 48 и 72 часов после обработки (n=3). Определение количества секретированного HMGB1 проводили с использованием набора HMGB1 ELISA kit II. Образцы сравнивали с помощью t-теста Стьюдента. *P <0,05 **P <0,01 по сравнению с необработанными контрольными клетками и ^†P <0,05, ^††P <0,01 по сравнению с одним соответствующим CDDP.

Фигура 25 показывает, что CBP501 усиливает противоопухолевую активность CDDP, и что CDDP плюс CBP501 потенцирует противоопухолевую активность антитела анти-PD1. Сингенную модель опухоли мыши CT26WT п/к обрабатывали CBP501, CDDP и антителом анти-PD1. Относительные размеры опухолей выстраивали против числа дней после инициации лечения. Средний размер опухоли сосотавлял 0,1 см³ в день 1 (n=6) стрелки, дни лечения (синяя стрелка/дни 1, 2, 8, 9, 15 и 16 для 7,5 мг/кг CBP501, красная стрелка/дни 2, 9 и 16 для 5 мг/кг CDDP и розовая стрелка/дни 3, 10 и 17 для 200 мкг анти-PD1). Смерть наблюдалась у 1 мыши в группе 2 в день 23, 1 мыши в группе 5 в день 26 и 1 мыши в группе 5 в день 28.

Фигура 26 показывает супрессию роста опухоли в сингенной модели ксенотрансплантата мыши CBP501 цисплатином и антителом анти-PD1, индивидуально, и комбинацией CBP501, цисплатина и антитела анти-PD1.

Фигура 27 показывает изменение массы тела и рост отдельных опухолей в исследовании ксенотрансплантата.

Фигура 28 показывает супрессию роста опухоли в сингенной модели мыши ксенотрансплантата CBP501 цисплатином и анти-PDL1 антителом, индивидуально и в комбинации.

Фигура 29 показывает изменение массы тела и рост отдельных опухолей в исследовании ксенотрансплантата.

Фигура 30 показывает супрессию роста опухоли в сингенной модели мыши ксенотрансплантата CBP501 карбоплатином и антителом анти-PD1, индивидуально и в комбинации.

Фигура 31 показывает изменение массы тела и рост отдельных опухолей в исследовании ксенотрансплантата.

Фигура 32 показывает анализ на инфильтрирующих опухоль лимфоцитах (TIL).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Изобретение относится к соединениям в комбинациях, и к способам и применениям соединений, индивидуально и в различных комбинациях. Одна такая комбинация, способ или применение включают агент, активирующий Т-клетки, и пептид или пептидомиметик, как указано здесь. Другая такая комбинация, способ или применение включают ингибитор иммунной контрольной точки и пептид или пептидомиметик, как указано здесь. Еще одна такая комбинация, способ или применение включают агент, активирующий Т-клетки, и ингибитор иммунной контрольной точки, как указано здесь. Другая такая комбинация, способ или применение включают агент, активирующий Т-клетки, и ингибитор иммунной контрольной точки и пептид или пептидомиметик, как указано здесь. Соединения по изобретению в комбинациях, и способы и применения соединений, индивидуально и в различных комбинациях, поэтому могут быть использованы для лечения пролиферативных нарушений или физиологических состояний, характеризующихся нежелаемой или нежелательной пролиферацией клеток, таких как доброкачественные и злокачественные опухолевые клетки.

Комбинации включают пептиды и пептидомиметики, которые ингибируют пролиферацию клеток. Способность пептидов и пептидомиметиков к ингибированию пролиферации клеток, по-видимому, является следствием, по меньшей мере частично, отмены контрольной точки клеточного цикла G2. Поскольку клетки могут быть индуцированы к вступлению в контрольную точку G2 клеточного цикла в ответ на повреждение нуклеиновой кислоты, чтобы обеспечить репарацию в клетке перед репликацией ДНК и клеточным делением путем ингибирования контрольной точки G2, пептиды и пептидомиметики по изобретению сенсибилизируют клетки к агентам и протоколам лечения, разрушающим нуклеиновую кислоту. Клетки, накапливающие достаточно повреждений нуклеиновой кислоты, будут неспособны к репарации поврежденной нуклеиновой кислоты, потому что контрольная точка G2 разрушена. Такие клетки будут демонстрировать уменьшенную пролиферацию (например, вследствие мутации гена, критически важного для выживания, который не был подвергнут репарации), и в конечном счете, перенесут апоптоз.

Клетки, имеющие нормальный G1, менее подвержены аккумуляции поврежденной нуклеиновой кислоты, так как репарация нуклеиновой кислоты может также иметь место во время G1. Таким образом нормальные клетки являются менее чувствительны к эффектам соединений по изобретению. Однако клетки, имеющие сниженную или разрушенную контрольную точку G1 клеточного цикла, с болеьшей вероятностью аккумулируют поврежденную нуклеиновую кислоту, потому что контрольная точка G1 повреждена или разрушена, делая менее вероятным, что клетки могут полностью восстановить поврежденную нуклеиновую кислоту. Таким образом, обработка клеток с поврежденной или разрушенной G1 пептидом или пептидомиметиком по изобретению, разрушающим контрольную точку G2, делает еще менее вероятным, что клетки будут в состоянии осуществить репарацию поврежденной нуклеиновой кислоты. Клетки с поврежденной или разрушенной G1 поэтому особенно чувствительны к таким пептидам по изобретению и пептидомиметикам. Таким образом соединения по изобретению, включая пептиды и пептидомиметики, могут использоваться для ингибирования или предотвращения пролиферации клеток в целом, и в частности, ингибирования пролиферации клеток, имеющих сниженную или разрушенную контрольную точку G1.

Клетки, имеющие сниженную или разрушенную контрольную точку клеточного цикла G1, включают, но не ограничены ими, быстро пролиферирующие клетки. Пролиферативные нарушения и физиологические состояния, характеризующиеся быстрым ростом клеток, нежелательнам ростом клеток или клетками, остающимися в живых вместо того, чтобы переносить апоптоз, часто имеют поврежденную или разрушенную контрольную точку клеточного цикла G1. Таким образом, поскольку, по-видимому, способность пептидов и пептидомиметиков по изобретению ингибировать пролиферацию или стимулировать апоптоз является следствием, по меньшей мере частично, разрушения контрольной точки клеточного цикла G2, клетки, быстро или нежелательно пролиферирующие вследствие поврежденной или разрушенной контрольной точки G1, являются особенно привлекательными мишенями.

CBP501 является ингибирующим контрольную точку клеточного цикла G2 пептидом TAT-S216A (Suganuma, M., et al. Cancer Res. 59:5887 (1999)). Способ скрининга, основанный на фенотипе клеточного цикла, использовался для оптимизации TAT-S216A для уменьшения аккумуляции раковых клеток в фазе G2 клеточного цикла в ответ на агенты, разрушающие ДНК, не оказывая влияние на фенотип клеточного цикла нормальных клеток (Sha, S., et al. Mol. Cancer Ther. 6:147 (2007)). Было обнаружено, что CBP501 увеличивает концентрацию платины и формирование аддукта платина-ДНК в CBP501-чувствительных опухолевых клетках и может действовать, альтернативно или в дополнение к ингибированию/разрушению контрольной точки G2, через ингибирование кальмодулина (Mine, N., et al. Mol. Cancer Ther. 10:1929 (2011)).

Соединения по изобретению, включая пептиды и пептидомиметики, могут подавлять пролиферацию клеток сами по себе без последующих обработок, повреждающих нуклеиновую кислоту или имеющих антипролиферативную активность, поскольку разрушение контрольной точки G2, вероятно, будет приводить к аккумуляции повреждений нуклеиновой кислоты при делении клеток. Соответственно, патологические или нежелательно пролиферирующие или выживающие клетки могут быть обработаны соединением по изобретению, индивидуально или в комбинации с лечением, разрушающим нуклеиновую кислоту (например, химическим агентом или протоколом лечения), чтобы ингибировать или предотвратить пролиферацию клеток или стимулировать апоптоз/катастрофу клеток.

В отличие от стандартных антипролиферативных агентов, нацеленных на быстро пролиферирующие клетки независимо от того, являются ли клетки нормальными или патологическими (например, раковыми клетками), соединения по изобретению избирательно нацеливается на клетки, имеющие поврежденную или разрушенную контрольную точку клеточного цикла G1. например, CBP501 не оказывает влияние на рост клеток HUVEC (см., например, Таблицу 3). CBP501 также не оказывает влияние на остановку клеточного цикла фазы M и/или неспецифическую токсичность, вызванную колхицином (см., например, Фигуру 12). Следовательно, соединения по изобретению с меньшей вероятностью будут производить избыточные нежелательные побочные эффекты, ассоциируемые со стандартными агентами для антипролиферативного лечения, такие как супрессия костного мозга, тошнота, потеря аппетита, диарея и потеря волос. Кроме того, поскольку подавляющее большинство раковых клеток имеют поврежденную или разрушенную контрольную точку клеточного цикла G1, раковые клетки демонстрируют увеличенную чувствительность к соединениям по изобретению, ингибирующим контрольную точку клеточного цикла G2. То, что нормальные клетки менее восприимчивы, также означает, что соединения по изобретению, включая пептиды и пептидомиметики, могут использоваться в больших количествах.

Изобретение относится к соединениям, включая пептиды и пептидомиметики, имеющим антипролиферативную активность и/или которые ингибируют контрольную точку клеточного цикла G2. Пептиды или пептидомиметики включают последовательности, ингибирующие пролиферацию клетки или стимулирующие апоптоз клетки. Пептиды или пептидомиметики также включают последовательности, ингибирующие контрольную точку клеточного цикла G2. В одном варианте осуществления, последовательная последовательность пептида или пептидомиметика включает следующую структуру: P1, P2, P3, P4, P5, P6 (SEQ ID NO:1) или P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:2); причем P1 является d- или l-Cha, d- или l-Nal(2), d- или l-(Phe-2,3,4,5,6-F), d- или l-(Phe-3,4,5F), d- или l-(Phe-4CF3), аминокислотой, занимающей подобное место боковой цепи (например, d- или l-Tyr, d- или l-Phe), или любой аминокислотой с одной или двумя группами из числа ароматической, пиперидина, пиразина, пиримидина, пиперазина, морфолина или пиримидина, или одной группой индола, амилнафталина, индена, нафталина, бензофурана, бензотиофена, хинолина, индолина, хромана, хиноксалина, хиназолина в боковой цепи; P2 обозначает d- или l-Cha, d- или l-Nal(2), d- или l-(Phe-2,3,4,5,6-F), d- или l-(Phe-3,4,5F), d- или l-(Phe-4CF3), d- или l-Bpa, d- или l-Phe4NO2, аминокислоту, занимающую подобное место боковой цепи (например, d- или l-Tyr, d- или l-Phe), или любую аминокислоту с одной или двумя группами из числа ароматической, пиперидина, пиразина, пиримидина, пиперазина, морфолина или пиримидина, или одной группой индола, амилнафталина, индена, нафталина, бензофурана, бензотиофена, хинолина, индолина, хромана, хиноксалина или хиназолина в боковой цепи; P3, P4, P5 являются любой аминокислотой или один или болееиз P3, P4, P5 является простой углеродной цепью, таким образом, что расстояние между P2 и P6 является приблизительно таким же, как расстояние, когда каждый из P3, P4, P5 является аминокислотой (d- или l-Trp является примером в P4; P6 обозначает d- или l-Bpa, d- или l-Phe4NO2, любую аминокислоту и d- или l-Tyr (например, d-Ser-d-Tyr), любой аминокислотой и d- или l-Phe (например, d-Ser-d-Phe), любой аминокислотой или ничем. В различных аспектах аминокислота, имеющая простую углеродную цепь, является d- или l-11-аминоундекановой, d- или l-10-аминодекановой кислотой, d- или l-9-аминононановой кислотой, d- или l-8-аминокаприловой кислотой, d- или l-7-аминогептановой кислотой, d- или l-6-аминокапроновой кислотой или подобной структурой с одной или более ненасыщенными углеродными связями.

В другом варианте осуществления, последовательная последовательность пептида или пептидомиметика включает следующую структуру: P1, P2, P3, P4, P5, P6 (SEQ ID NO:3); P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:4); P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9, P10, P11, P12 (SEQ ID NO:5); P1, P2, P3, P4, P5, P6, P12, P11, P10, P9, P8, P7 (SEQ ID NO:6); P6, P5, P4, P3, P2, P1, P7, P8, P9, P10, P11, P12 (SEQ ID NO:7); P6, P5, P4, P3, P2, P1, P12, P11, P10, P9, P8, P7 (SEQ ID NO:8); P7, P8, P9, P10, P11, P12, P1, P2, P3, P4, P5, P6 (SEQ ID NO:9); P7, P8, P9, P10, P11, P12, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:10); P12, P11, P10, P9, P8, P7, P1, P2, P3, P4, P5, P6 (SEQ ID NO:11); P12, P11, P10, P9, P8, P7, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:12); P12, P11, P6, P9, P8, P7, P2, P1 (SEQ ID NO:13); P12, P11, P10, P6, P9, P4, P7, P2, P1 (SEQ ID NO:14); P1, P2, P7, P8, P9, P6, P11, P12 (SEQ ID NO:15); или P1, P2, P7, P4, P9, P6, P10, P11, P12 (SEQ ID NO:16); причем P1 обозначает d- или l-Cha, d- или l-Nal(2), d- или l-(Phe-2,3,4,5,6-F), d- или l-(Phe-3,4,5F), d- или l-(Phe-4CF3), d- или l-Bpa, d- или l-Phe4NO2, аминокислоту, занимающую подобное место боковой цепи (например, d- или l-Tyr, d- или l-Phe), или любую аминокислоту с одной или двумя группами из числа ароматической, пиперидина, пиразина, пиримидина, пиперазина, морфолина или пиримидина, или одной группой индола, амилнафталина, индена, нафталина, бензофурана, бензотиофена, хинолина, индолина, хромана, хиноксалина или хиназолина в боковой цепи; P2 обозначает d- или l-Cha, d- или l-Nal(2), d- или l-(Phe-2,3,4,5,6-F), d- или l-(Phe-3,4,5F), d- или l-(Phe-4CF3) или аминокислоту, занимающую подобное место боковой цепи (например, d- или l-Tyr, d- или l-Phe), или любую аминокислоту с одной или двумя группами из числа ароматической, пиперидина, пиразина, пиримидина, пиперазина, морфолина или пиримидина, или одной группой индола, амилнафталина, индена, нафталина, бензофурана, бензотиофена, хинолина, индолина, хромана, хиноксалина, хиназолина в боковой цепи; P3, P4, P5 являются любой аминокислотой или один или более из P3, P4, P5 является простой углеродной цепью, таким образом, что расстояние между P2 и P6 является приблизительно таким же, как расстояние, когда каждый из P3, P4, P5 является аминокислотой (d- или l-Trp является примером в P4); P6 обозначает d- или l-Bpa, d- или l-Phe4NO2, любую аминокислоту и d- или l-Tyr (например, d-Ser-d-Tyr), любую аминокислоту и d- или l-Phe (например, d-Ser-d-Phe), и по меньшей мере три из P7, P8, P9, P10, P11, P12 являются основными аминокислотами, а остальные являются любой аминокислотой или отсутствуют. В различных аспектах аминокислота, имеющая простую углеродную цепь, является d- или l-11-аминоундекановой, d- или l-10-аминодекановой кислотой, d- или l-9-аминононановой кислотой, d- или l-8-аминокаприловой кислотой, d- или l-7-аминогептановой кислотой, d- или l-6-аминокапроновой кислотой или подобной структурой с одной или более ненасыщенными углеродными связями.

В другом варианте осуществления, последовательная последовательность пептида или пептидомиметика включает следующую структуру: P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9, P10, P11, P12 (SEQ ID NO:17); P12, P11, P10, P9, P8, P7, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:18); P12, P11, P10, P6, P9, P4, P7, P2, P1 (SEQ ID NO:19); или P1, P2, P7, P4, P9, P6, P10, P11, P12 (SEQ ID NO:20); причем P1 обозначает d- или l-Cha, d- или l-Nal(2), d- или l-(Phe-2,3,4,5,6-F), d- или l-(Phe-3,4,5F), d- или l-(Phe-4CF3), d- или l-Bpa, d- или l-Phe4NO2, аминокислоту, занимающую подобное место боковой цепи (например, d- или l-Tyr, d- или l-Phe), или любую аминокислоту с одной или двумя группами из числа ароматической, пиперидина, пиразина, пиримидина, пиперазина, морфолина или пиримидина, или одной группой индола, амилнафталина, индена, нафталина, бензофурана, бензотиофена, хинолина, индолина, хромана, хиноксалина или хиназолина в боковой цепи; P2 обозначает d- или l-Cha, d- или l-Nal(2), d- или l-(Phe-2,3,4,5,6-F), d- или l-(Phe-3,4,5F), d- или l-(Phe-4CF3), аминокислоту, занимающую подобное место боковой цепи (например, d- или l-Tyr, d- или l-Phe), или любую аминокислоту с одной или двумя группами из числа ароматической, пиперидина, пиразина, пиримидина, пиперазина, морфолина или пиримидина, или одной группой индола, амилнафталина, индена, нафталина, бензофурана, бензотиофена, хинолина, индолина, хромана, хиноксалина, хиназолина в боковой цепи; P3, P4, P5 являются любой аминокислотой или один или более из P3, P4, P5 является простой углеродной цепью, таким образом, что расстояние между P2 и P6 является приблизительно таким же, как расстояние, когда каждый из P3, P4, P5 является аминокислотой (d- или l-Trp является примером в P4); P6 обозначает d- или l-Bpa, d- или l-Phe4NO2, любую аминокислоту и d- или l-Tyr (например, d-Ser-d-Tyr), любую аминокислоту и d- или l-Phe (например, d-Ser-d-Phe), любую аминокислоту или отсутствует; и по меньшей мере три из P7, P8, P9, P10, P11, P12 являются основными аминокислотами, а остальные являются любой аминокислотой или отсутствуют. В различных аспектах аминокислота, имеющая простую углеродную цепь, является d- или l-аминоундекановой-кислотой или d- или l-8-аминокаприловой кислотой.

В еще одном варианте осуществления, последовательная последовательность пептида или пептидомиметика включает следующую структуру: P1, P2, P3, P4, P5, P6 (SEQ ID NO:21) или P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:22); причем P1 обозначает d- или l-Cha, d- или l-Nal(2), d- или l-(Phe-2,3,4,5,6-F), d- или l-(Phe-3,4,5F), d- или l-(Phe-4CF3), d- или l-Bpa, d- или l-Phe4NO2, d- или l-Tyr, или d- или l-Phe; P2 обозначает d- или l-Cha, d- или l-Nal(2), d- или l-(Phe-2,3,4,5,6-F), d- или l-(Phe-3,4,5F), d- или l-(Phe-4CF3), d- или l-Bpa, d- или l-Phe4NO2, d- или l-Tyr, или d- или l-Phe; P3 обозначает d- или l-серин, d- или l-аргинин, d- или l-цистеин, d- или l-пролин или d- или l-аспарагин; P4 обозначает d- или l-триптофан; и P5 обозначает d- или l-серин, d- или l-аргинин или d- или l-аспарагин; или P3, P4, P5 является единственной d- или l-аминоундекановой кислотой или единственной d- или l-8-аминокаприловой кислотой; P6 обозначает d- или l-Bpa, d- или l-Phe4NO2, (d-Ser-d-Tyr) или (d-Ser-d-Phe).

В дополнительном варианте осуществления, последовательная последовательность пептида или пептидомиметика включает следующую структуру: P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9, P10, P11, P12 (SEQ ID NO:35); P12, P11, P10, P9, P8, P7, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:36); P12, P11, P10, P6, P9, P4, P7, P2, P1 (SEQ ID NO:37); или P1, P2, P7, P4, P9, P6, P10, P11, P12 (SEQ ID NO:38); причем P1 обозначает d- или l-Cha или d- или l-Nal(2); P2 обозначает d- или l-(Phe-2,3,4,5,6-F), d- или l-(Phe-3,4,5F), d- или l-(Phe-4CF3); и по меньшей мере три из P7, P8, P9, P10, P11, P12 обозначают d- или l-Arg, а остальные являются любой аминокислотой или отсутствуют; P3 обозначает d- или l-серин; P4 обозначает d- или l-триптофан; P5 обозначает d- или l-серин или d- или l-аспарагин; P6 обозначает d- или l-Bpa, d- или l-Phe4NO2, (d- или l-Ser-d- или l-Tyr), или (d- или l-Ser-d- или l-Phe).

В дополнительном варианте осуществления последовательная последовательность пептида или пептидомиметика включает следующую структуру: P1, P2, P3, P4, P5, P6 (SEQ ID NO:39) или P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:40); причем P1 обозначает d- или l-Cha, или d- или l-Nal(2); P2 обозначает (d- или l-Phe-2,3,4,5,6-F), (d- или l-Phe-3,4,5F) или (d- или l-Phe-4CF3); P3 обозначает d- или l-Ser; P4 обозначает d- или l-Trp; P5 обозначает d- или l-Ser; P6 обозначает d- или l-Bpa, или (d- или l-Ser-d- или l-Tyr).

В другом варианте осуществления последовательная последовательность пептида или пептидомиметика включает следующую структуру: P1, P2, P3, P4, P5, P6 (SEQ ID NO:41); P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:42); P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9, P10, P11, P12 (SEQ ID NO:43); P1, P2, P3, P4, P5, P6, P12, P11, P10, P9, P8, P7 (SEQ ID NO:44); P6, P5, P4, P3, P2, P1, P7, P8, P9, P10, P11, P12 (SEQ ID NO:45); P6, P5, P4, P3, P2, P1, P12, P11, P10, P9, P8, P7 (SEQ ID NO:46); P7, P8, P9, P10, P11, P12, P1, P2, P3, P4, P5, P6 (SEQ ID NO:47); P7, P8, P9, P10, P11, P12, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:48); P12, P11, P10, P9, P8, P7, P1, P2, P3, P4, P5, P6 (SEQ ID NO:49); P12, P11, P10, P9, P8, P7, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:50); P12, P11, P6, P9, P8, P7, P2, P1 (SEQ ID NO:51); P12, P11, P10, P6, P9, P4, P7, P2, P1 (SEQ ID NO:52); P1, P2, P7, P8, P9, P6, P11, P12 (SEQ ID NO:53); или P1, P2, P7, P4, P9, P6, P10, P11, P12 (SEQ ID NO:54); причем P1 обозначает d- или l-Cha, или d- или l-Nal(2); P2 обозначает (d- или l-Phe-2,3,4,5,6-F), (d- или l-Phe-3,4,5F) или (d- или l-Phe-4CF3); P3 обозначает любую аминокислоту (например, d- или l-Ser, или d- или l-Pro); P4 обозначает d- или l-Trp; P5 обозначает любую аминокислоту (например, d- или l-Ser); P7 обозначает d- или l-Arg; P8 обозначает d- или l-Arg; P9 обозначает d- или l-Arg; P10 обозначает d- или l-Gln или d- или l-Arg; P11 обозначает d- или l-Arg; P12 обозначает d- или l-Arg; P6 обозначает d- или l-Bpa или (d- или l-Ser-d- или l-Tyr).

В других вариантах осуществления, последовательная последовательность пептида или пептидомиметика включает следующую структуру: (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg) (SEQ ID NO:99); (d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (SEQ ID NO:100); (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg) (SEQ ID NO:59); (d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (SEQ ID NO:60); (d-Cha)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg) (SEQ ID NO:61); (d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(d-Cha)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Bpa) (SEQ ID NO:62); (d-Cha)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg) (SEQ ID NO:63); (d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Cha)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Bpa) (SEQ ID NO:64); (d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Cha)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Bpa) (SEQ ID NO:65); (d-Cha)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg) (SEQ ID NO:66); (d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (SEQ ID NO:67); (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg) (SEQ ID NO:68); (d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (SEQ ID NO:69); (d-Cha)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg) (SEQ ID NO:70); (d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Trp)(d-Arg)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (SEQ ID NO:71); (d-Cha)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Arg)(d-Trp)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg) (SEQ ID NO:72); (d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Trp)(d-Arg)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (SEQ ID NO:73); (d-Cha)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Arg)(d-Trp)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg) (SEQ ID NO:74); (d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (SEQ ID NO:75); или (d-Cha)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg) (SEQ ID NO:76).

В дополнительных вариантах осуществления последовательная последовательность пептида или пептидомиметика включает следующую структуру: (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg) (SEQ ID NO:77).

Пептиды и пептидомиметики по изобретению могут в случае необходимости содержать последовательность poly-lys и/или arg для способствования пересечению клеточной мембраны. Поскольку другие аминокислотные последовательности (например, ВИЧ tat, лиганды для рецепторов/белков поверхности клеток и т.д.) способны пересекать мембрану, и другие молекулы могут использоваться для облегчения входа пептидов и пептидомиметиков, ингибирующих G2 (например, липосомы, мицеллы и другие липидные молекулы, вирусные и другие векторы, электропорация и т.д.), в клетку, включение последовательности poly-lys и/или poly-arg является необязательным. Таким образом, в дополнительных вариантах осуществления, пептиды и пептидомиметики не имеют последовательности poly-lys и/или arg, облегчающей вхождение в клетку. например, в двух частных вариантах осуществления, минимальная последовательность без последовательности poly-lys/arg, способствующей пересечению клеточной мембраны, включает P6, P5, P4, P3, P2, P1, например, d-Bpa, d-Ser, d-Trp, d-Ser, d-Phe-2,3,4,5,6F, d-Cha (SEQ ID NO:101); и d-Tyr, d-Ser, d-Pro, d-Trp, d-Ser, d-Phe-2,3,4,5,6F, d-Cha (SEQ ID NO:102). В двух дополнительных частных вариантах осуществления минимальная последовательность без последовательности poly-lys/arg, способствующей пересечению клеточной мембраны, включает, например, d-Bpa, d-Cys, d-Trp, d-Ser, d-Phe-2,3,4,5,6F, d-Cha, d-Cys (SEQ ID NO:103); и d-Tyr, d-Cys, d-Pro, d-Trp, d-Ser, d-Phe-2,3,4,5,6F, d-Cha, d-Cys (SEQ ID NO:104); остатки Cys могут быть в случае необходимости циклизованы.

Как обсуждалось, соединения по изобретению имеют антипролиферативную активность или ингибирующую активность только в отношении G2. Антипролиферативная активность может быть увеличена путем комбинации таких соединений по изобретению с другими агентами, такими как агенты, активирующие Т-клетки, и/или ингибиторы иммунной контрольной точки. Агенты, активирующие Т-клетки, могут быть скомбинированы, в способе или в комбинированной композиции, с пептидами и пептидомиметиками. Альтернативно, ингибиторы иммунной контрольной точки могут быть скомбинированы, в способе или в комбинированной композиции, с пептидами и пептидомиметиками. Также агенты, активирующие Т-клетки, и ингибиторы иммунной контрольной точки могут быть скомбинированы, в способе или в комбинированной композиции, с пептидами и пептидомиметиками. Изобретение поэтому также относится к композициям, включающим соединение по изобретению (например, пептид или последовательность пептидомиметика) и агент, активирующий Т-клетки, и/или ингибитор иммунной контрольной точки, а также к способам и применениям таких комбинаций, например, соединения по изобретению (например, пептида или последовательности пептидомиметика), вводимого индивидуально или в комбинации с агентом, активирующим Т-клетки, и/или ингибитором иммунной контрольной точки.

Активирующий агент, как правило, является «антагонистом», который способен к уменьшению, ослаблению или ингибированию одной или более активностей молекулы-мишени. Антагонисты могут препятствовать связыванию лиганда с рецептором или рецептора с лигандом путем выведения из строя или уничтожения клеток, активируемых лигандом, и/или путем препятсвования связыванию или активации рецептора или лиганда, или трансдукции сигналов после связывания лиганда с рецептором. Антагонист может, но не должен полностью блокировать взаимодействия или может существенно ослаблять, уменьшать или ингибировать такие взаимодействия.

Частные примеры мишеней агента, активирующего Т-клетки, включают CD28, OX40, GITR, CD137, CD27 и HVEM. Агенты, активирующие Т-клетки, включают, но не ограничены ими, лиганды и антитела, связывающиеся с CD28, OX40, GITR, CD137, CD27 и/или HVEM.

Частным неограничивающим примером антитела анти-CD28 является TGN1412 (Chia-Huey Lin, et al., (2004-11-16) Blood (ASH Annual Meeting Abstracts) 104 (11): Abstract 2519; Suntharalingam et al., (2006) N Engl J Med 355:1018-1028).

Частные неограничивающие примеры антител OX40 включают MEDI6469, MEDI0562 и MEDI6383 (Международная заявка на патент PCT/US2015/023434, Международная убликация WO/2015/153514). Частным неограничивающим примером лиганда OX40 является OX40L (Патент США № 7291331).

Частные неограничивающие примеры анти-GITR антител включают TRX518 (GITR, Inc., ранее разработанное Tolerx) (Tolerx Inc., (2007) Expert Opin Ther Patents 17:567-575; Ascierto PA, et al., (2010); см. также WO/2006/105021 и WO/2009/009116.

Частные неограничивающие примеры анти-CD137 (41BB) антитела включают Urelumab (BMS-663513) (Bristol-Myers Squibb) (Logan, T., et al., (2008), Journal of Immunotherapy, vol. 31, No. 9, p. 956) и PF-05082566 (PF-2566, Pfizer)(например, как описано в PCT/IB2011/053761 (WO/2012/032433))

Частным неограничивающим примером антитела анти-CD27 является CDX-1127 (варлилумаб, Celldex Therapeutics) (Vitale LA, et al. (2012) Clin Cancer Res. 18(14):3812-21).

Частным неограничивающим примером анти-HVEM антитела является моноклональное антитело, доступное от гибридомы, описанной в Патенте США № 8349320 (депонированной в Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724, 75724 Париж Cedex 15, Франция, под номером CNCM 1-4752).

Частные примеры мишеней ингибитора иммунных контрольных точек включают CTLA-4, PD1, PD-L1, PDL2, VISTA, TIM3, LAG-3 и BTLA. Ингибиторы иммунной контрольной точки включают, но не ограничены ими, лиганды и антитела, связывающиеся с CTLA-4, PD1, PD-L1, PDL2, VISTA, TIM3, LAG-3 и/или BTLA.

Частные неограничивающие примеры антител анти-PD-1 и к родственным молекулам включают ниволумаб (BMS-936558/MDX-1106/ONO-4538) (Brahmer JR, et al., (2010) J Clin Oncol. 28(19):3167-75); ламбролизумаб (alias: MK3475 (Merck), Pembrolizumab, Keytruda) (патент США No. 8952136); пидилизумаб (CT-011, CureTech) (Westin JR, et al., (2014) Lancet Oncol. 15(1):69-77); AMP-514 (MedImmune/AZ, alias:MEDI0680) (WO/2012/145493); и AMP-224 (GSK, alias: B7-DCIg, растворимый слитый рецептор PDL2-Fc, описанный в WO2010/027827 и WO2011/066342).

Частные неограничивающие примеры молекул антагониста PD-1 включают AUNP 12 (Aurigene and Pierre Fabre Pharmaceuticals; Публикация США № US20110318373).

Частные неограничивающие примеры антител анти-PD-L1 включают BMS-936559 (Bristol-Myers Squibb) (WO/2007/005874); MPDL3280A (Genentech) (RG7446; WO/2010/077634); MedI-4736 (Medimmune, ранее Pfizer), MSB0010718C (EMD Serono) (WO/2013/79174); и MDX-1105 (WO/2007/005874).

Частные неограничивающие примеры анти-CTLA-4 антител включают ипилимумаб (Bristol-Myers Squibb, Yervoy®) (Международная заявка № PCT/US1999/28739 (опубликованная как WO/2000/32231), патенты США № 5811097, 5855887, 6051227 и 6207156)); и тремелимумаб (ранее CP 675,206) (Medimmune, ранее Pfizer) (Calabrò L, et al., (2013) Lancet Oncol. 14(11):1104-11; и Camacho, LH et al, (2004) Journal Of Clinical Oncology, Suppl. (S), vol. 22, no. 14, pages 164S-164S).

Частные неограничивающие примеры антител анти-LAG-3 включают BMS-986016 (Bristol-Myers Squibb) (WO/2010/19570, WO/2014/08218); IMP 731 или IMP 321 (WO/2008/132601, WO/2009/44273); и другие анти-LAG3 антитела, как описано в (Международной заявке на патент № PCT/US2015/020474, (WO/2015/138920))

Частные неограничивающие примеры анти-TIM3 антител описаны в патенте США № 8841418 и публикации патента США № 20150086574.

Частные неограничивающие примеры анти-VISTA (B7-H5) антитела описаны в WO 2014190356.

Частные неограничивающие примеры анти-BTLA антител описаны в WO2008076560, US8563694, US20120064096, US20100172900.

Термин «антитело» относится к белку, связывающемуся с другой молекулой (антигеном) через вариабельные области тяжелой и легкой цепи, обозначаемые V_H и V_L, соответственно. «Антитело» относится к любой поликлональной или моноклональной молекуле иммуноглобулина, или их смесям, такой как IgM, IgG, IgA, IgE, IgD. Антитела принадлежат к любому классу или подклассу антител. Примерами подклассов для IgG являются IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4.

Термин «моноклональное», когда он используется в отношении антитела, относится к антителу, которое основано на, получено из или происходит от единственного клона, включая любой эукариотический, прокариотический или фаговый клон. «Моноклональное» антитело поэтому определяется здесь структурно, а не через способ, которым оно получено.

Антитела включают последовательности легкой цепи каппа или лямбда, либо полноразмерные, как в натуральных антителах, так и их смеси (т.е. слитые последовательности каппа и лямбда цепей) и их подпоследовательности/фрагменты. Натуральные молекулы антитела содержат две легкие цепи каппа и две лямбда. Главная разница между легкими цепями каппа и лямбда находится в последовательностях константной области.

Антитело, включающее или состоящее из Тяжелой (H) цепи и/или Легкой (L) цепи или фрагмент Тяжелой (H) цепи или Легкой (L) цепи, может включать единственную цепь H или L или единственный фрагмент цепи H или L или множество (2, 3, 4 или больше) Тяжелых (H) цепей и/или Легких (L) цепей, или множество фрагментов Тяжелых (H) цепей и/или Легких (L) цепей. Антитело или фрагмент могут, но не обязательно, включать 2 Тяжелых (H) цепи и 2 Легких (L) цепи. Антитело или его фрагмент могут иметь олигомерные (более высокого порядка или валентности) формы, такие как тример, тетрамер, пентамер, гексамер, гептамер и т.д, с другими антителами, их фрагментами, Тяжелой (H) цепью, Легкой (L) цепью или полипептидами, отличными от Тяжелой (H) или Легкой (L) цепи антитела.

Термин «слияние» или «химера» и его грамматические вариации, когда он используется в отношении последовательности, означает, что последовательность содержит одну или более частей, которые основаны на, получены из или происходят от или выделны из двух или более различных белков. Т.е., например, часть последовательности может быть основана на или происходить от одного определенного белка, и другая часть последовательности может быть основана на или происходить от другого определенного белка. Таким образом, слитый или химерный полипептид являются молекулой, в которой различные части полипептида происходят от разных белков.

Антитела включают млекопитающие, человеческие, гуманизированные и приматизированные последовательности. Термин «человеческий» в отношении антитела означает, что аминокислотная последовательность является полностью человеческой. ʺЧеловеческое антителоʺ поэтому относится к антителу, имеющему человеческие аминокислотные последовательности иммуноглобулина, т.е., человеческую тяжелую и легкую цепь вариабельной и константной областей, специфически связывающиеся с мишенью. Т.е., все аминокислоты антитела являются человеческими или могут существовать или существуют в человеческом антителе.

Антитело, которое не является человеческим, может быть сделано полностью человеческим путем замены нечеловеческих аминокислотных остатков аминокислотными остатками, которые могут существовать или существуют в человеческом антителе. Аминокислотные остатки, присутствующие в человеческих антителах, карты областей CDR и консенсусные остатки человеческих антител известны в данной области техники (см., например, Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4^th Ed.US Department of Health and Human Services. Public Health Service (1987); и Chothia and Lesk J. Mol. Biol.186:651 (1987)). Консенсусная последовательность человеческой подгруппы III V_H, на основе обзора 22 известных человеческих последовательностей V_H III, и консенсусная последовательность человеческой подгруппы I каппа-цепи V_L, на основе обзора 30 известных человеческих последовательностей каппа I, описаны в Padlan Mol. Immunol.31:169 (1994); and Padlan Mol. Immunol.28:489 (1991)). Человеческие антитела поэтому включают антитела, в которых один или более аминокислотных остатков заменены одной или более аминокислотами, присутствующими в другом человеческом антителе.

Термин «гуманизированный», когда он используется в отношении антитела, означает, что аминокислотная последовательность антитела имеет нечеловеческие аминокислотные остатки (например, мыши, крысы, козы, кролика, примата и т.д.) из одной или более определяющих областей (CDRs), специфически связывающихся с желаемой мишенью в акцепторной человеческой молекуле иммуноглобулина, и один или несколько человеческих аминокислотных остатков в области рамки считывания (FR) Fv, которые являются аминокислотными остатками, фланкирующими CDRs. Человеческие остатки области рамки считывания иммуноглобулина могут быть заменены соответствующими нечеловеческими остатками. Остатки в человеческих областях рамки считывания могут быть поэтому заменены соответствующим остатком нечеловеческого антитела донора CDR для изменения, обычно улучшения, например, афинности или специфичности антигена. Кроме того, гуманизированное антитело может включать остатки, не обнаруживающиеся ни в человеческом антителе, ни в донорском CDR или последовательностях рамки считывания. например, замещение рамки считывания в определенном положении, не обнаруживающееся в человеческом антителе или донорском нечеловеческом антителе, может быть предсказано для улучшения афинности связывания или специфичности антитела человека в этом положении.

Рамка считывания антитела и замещения CDR, основанные на молекулярном моделировании, известны в данной области техники, например, путем моделирования взаимодействий CDR и остатков рамки считывания для идентификации остатков рамки считывания, важных для связывания антигена и сравнения последовательности для идентификации необычных остатков рамки считывания в определенных положениях (см., например, Патент США № 5,585,089; и Riechmann et al., Nature 332:323 (1988)). Антитела, называемые «приматизированными», находятся в рамках значения «гуманизированные», как используется здесь, за исключением того, что акцепторная человеческая молекула иммуноглобулина и аминокислотные остатки области рамки считывания могут быть любым аминокислотным остатком примата (например, низшей обезьяны, гиббона, гориллы, орангутана, шимпанзе, макака), в дополнение к любому человеческому остатку.

Антитела могут быть гуманизированы с использованием множества методов, известных в данной области техники, включая, например, CDR-трансплантацию (EP 239,400; W091/09967; Патенты США 5,225,539; 5,530,101; и 5,585,089), венирование или перекладку (EP 592,106; EP 519,596; Padlan, Molecular Immunol. 28:489 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7:805 (1994); Roguska. et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 91:969 (1994)), и перестановку цепей (Патент США № 5,565,332). Человеческие консенсусные последовательности (Padlan, Mol. Immunol.31:169 (1994); и Padlan, Mol. Immunol. 28:489 (1991)) могут использоваться для гуманизации антител (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992); and Presta et al., J. Immunol.151:2623 (1993)).

Способы получения химерных антител известны в данной области техники (например, Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al., J. Immunol. Methods 125:191 (1989); и Патенты США 5,807,715; 4,816,567; и 4,816,397). Химерные антитела, в которых вариабельная область антитела одного вида заменена вариабельной областью другого вида, описаны, например, в Munro, Nature 312:597 (1984); Neuberger et al., Nature 312:604 (1984); Sharon et al., Nature 309:364 (1984); Morrison et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 81:6851 (1984); Boulianne et al., Nature 312:643 (1984); Capon et al., Nature 337:525 (1989); и Traunecker et al., Nature 339:68 (1989).

Антитела включают биспецифические антитела, связывающиеся с одним или более CD28, OX40, GITR, CD137, CD27, HVEM, CTLA-4, PD1, PD-L1, PDL2, VISTA, TIM3, LAG-3 и/или BTLA. В рамках изобретения термин «биспецифическое» и его грамматические вариации, когда оно используется в отношении антитела, означает, что антитело связывается с двумя разными мишенями. Мишени считают разными, когда они имеют разные аминокислотные последовательности.

Антитела включают подпоследовательности и фрагменты, относящиеся к функциональному фрагменту или подпоследовательности референсного антитела, например, делецию одной или более аминокислот антитела. Неограничивающие примеры подпоследовательностей антитела включают Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, Fd, одноцепочечное Fv (scFv), связанные дисульфидным мостиком Fvs (sdFv), V_L, V_H, диатело ((V_L-V_H)₂ или (V_H-V_L)₂), триатело (трехвалентное), тетратело (четырехвалентное), минитело ((scFV-CH₃)₂), IgGдельтаCH₂, фрагмент scFv-Fc или (scFv)₂-Fc. В частных аспектах, подпоследовательность Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, Fd, одноцепочечное Fv (scFv), связанные дисульфидным мостиком Fvs (sdFv), V_L, V_H, диатело ((V_L-V_H)₂ или (V_H-V_L)₂), триатело (трехвалентное), тетратело (четырехвалентное), минитело ((scFV-CH₃)₂), IgGдельтаCH₂, фрагмент scFv-Fc или (scFv)₂-Fc.

ʺФункциональная подпоследовательностьʺ или ʺфункциональный фрагментʺ при обращении к антителу относится к части антитела, сохраняющей по меньшей мере часть одной или более функций или активностей как интактное референсное антитело, например, антитело, связывающееся с такой мишенью как CD28, OX40, GITR, CD137, CD27, HVEM, CTLA-4, PD1, PD-L1, PDL2, VISTA, TIM3, LAG-3 и/или BTLA.

Подпоследовательности антитела, включая одноцепочечные антитела, могут включать все или часть вариабельной области(ей) тяжелой или легкой цепи (например, CDR1, CDR2 или CDR3), индивидуально или в комбинации со всем или частью одного или более из следующего: шарнирная область, области CH1, CH₂ и CH3. Также включены антигенсвязывающие подпоследовательности любой комбинации вариабельной области(ей) тяжелой или легкой цепи (например, CDR1, CDR2 или CDR3) с шарнирной областью, областями CH1, CH₂ и CH3.

Антипролиферативная активность может также быть дополнительно увеличена путем комбинации соединений по изобретению с другими агентами, такими как лечения, прямо или косвенно повреждающие нуклеиновую кислоту. Антипролиферативная активность также может быть увеличена путем комбинации таких соединений по изобретению с лечениями, ингибирующими пролиферацию клеток, вне зависимости от того, повреждают ли эти лечения нуклеиновую кислоту. Изобретение поэтому далее относится к композициям, включающим соединение по изобретению (например, пептид или последовательность пептидомиметика) и агент, разрушающий нуклеиновую кислоту, и к композициям, включающим соединение по изобретению (например, пептид или последовательность пептидомиметика) и антипролиферативный агент.

В рамках изобретения термины ʺингибирует контрольную точку клеточного цикла G2ʺ, ʺразрушает контрольную точку клеточного цикла G2ʺ, ʺповреждает контрольную точку клеточного цикла G2ʺ и их грамматические вариации означают ингибирование клетки для остановки клеточного цикла в контрольной точке G2. Клетка, в которой в клеточном цикле ингибирована контрольная точка G2, показывает уменьшение продолжительности отрезка времени, в течение которого клетка находится в контрольной точке G2, которая может колебаться от отсутствия контрольной точки G2 в целом до контрольной точки G2, имеющей уменьшение продолжительности порядка минут, часов, дней, недель или дольше в соответствующих условиях. Таким образом, клетка, подвергнутая контакту с соединением по изобретению, имеет более короткое время контрольной точки G2, чем клетка обычно имеет в отсутствие соединения. например, уменьшение продолжительности времени контрольной точки G2 означает, что клетка, которая находится в G2 в течение определенного времени, например, 4 часа, при контакте с соединением по изобретению находится в G2 меньше 4 часов, например, 3,5, 3, 2,5, 2, 1 или меньшее количество часов.

В рамках изобретения, термин «апоптоз» относится к программируемой гибели клеток и соответствующим изменениям в физиологии клетки, например, фрагментации нуклеиновой кислоты, активации каспазы и т.д., как это понимают в данной области техники. Термин «катастрофа» означает гибель клеток вследствие ошибки в митотическом процессе. При катастрофе наблюдается меньше признаков, которые характерны для апоптоза, например, активации каспазы, конденсации хромосом и т.д.

В рамках изобретения термины «пептид», «полипептид» и «белок» используются взаимозаменяемо и относятся к двум или более аминокислот, ковалентно связанных амидной или эквивалентной неамидной связью. Пептиды по изобретению могут иметь любую длину. например, пептиды могут иметь длину приблизительно от 5 до 100 или более остатков, например, 5-12, 12-15, 15-18, 18-25, 25-50, 50-75, 75-100 или более. Пептиды по изобретению включают l- и d-изомеры и комбинации l- и d-изомеров. Пептиды могут включать модификации, как правило, связанные с посттрансляционным процессингом белков, например, циклизацию (например, дисульфидная или амидная связь), фосфорилирование, гликозилирование, карбоксилирование, убиквитинилирование, миристилирование или липидирование.

Пептиды, раскрытые здесь, также включают соединения, имеющие структурные и функциональные аналоги аминокислоты, например, пептидомиметики, имеющие синтетические или ненатуральные аминокислоты или аналоги аминокислоты, при условии, что миметик имеет одну или более функций или активностей. Соединения по изобретению поэтому включают формы «миметика» и «пептидомиметика».

В рамках изобретения термины «миметик» и «пептидомиметик» относятся к синтетическому химическому соединению, имеющему по существу те же структурные и/или функциональные особенности пептидов по изобретению. Миметик может быть полностью составлен из синтетического продукта, ненатуральных аналогов аминокислот, или может быть химерной молекулой, включающей одну или более аминокислот натурального пептида и один или несколько ненатуральных аналогов аминокислоты. Миметик может также включать любое число естественных консервативных аминокислотных замен, при условии, что такие замены не разрушают активность миметика. Как с полипептидами изобретения, которые являются консервативными вариантами, обычное тестирование может использоваться для определения, имеет ли миметик необходимую активность, например, что он имеет поддающуюся обнаружению активность ингибирования контрольной точки клеточного цикла G2. Миметик, при введении пациенту или контакте с клеткой, который поддающимся обнаружению образом разрушает контрольную точку клеточного цикла G2, считается поэтому имеющим активность ингибирования контрольной точки G2.

Композиции миметика пептида могут содержать любую комбинацию ненатуральных структурных компонентов, которые, как правило, происходят от трех структурных групп: a) группы связующих остатков, отличные от натуральных амидных («пептидная связь») связей; b) ненатуральные остатки вместо натуральных аминокислотных остатков; или c) остатки, индуцирующие вторичную структурную мимикрию, т.е. индуцирующие или стабилизирующие вторичную структуру, например, бета-поворот, гамма-поворот, бета-лист, альфа-спиральную конформацию и т.п. например, полипептид может быть охарактеризован как миметик, когда один или более остатков присоединены химическими средствами, отличными от амидной связи. Отдельные остатки пептидомиметика могут соединяться амидными связями, ненатуральными и неамидными химическими связями, другими химическими связями или средствами присоединения, включая, например, глутаральдегид, сложные эфиры N-гидроксисукцинимида, бифункциональные малеимиды, N,N'-дициклогексилкарбодиимид (DCC) или N,N'-диизопропилкарбодиимид (DIC). Связующие группы, альтернативные амидной связи, включают, например, кетометилен (например, -C(=O)-CH₂- для -C(=O)-NH-), аминометилен (CH₂-NH), этилен, олефин (CH=CH), простой эфир (CH₂-O), тиоэфир (CH₂-S), тетразол (CN₄-), тиазол, ретроамид, тиоамид или сложный эфир (см., например, Spatola (1983) в Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. 7, pp 267-357, ʺPeptide and Backbone Modifications,ʺ Marcel Decker, Нью-Йорк).

Как обсуждалось, пептид может быть охарактеризован как миметик, содержащий один или более ненатуральных остатков вместо натурального аминокислотного остатка. Ненатуральные остатки известны в данной области техники. Частными неограничивающими примерами ненатуральных остатков, пригодных для использования в качестве миметиков натуральных аминокислотных остатков, являются миметики ароматических аминокислот, включая, например, D- или L-нафтилаланин; D- или L-фенилглицин; D- или L-2-тиенеилаланин; D- или L-1,-2, 3- или 4-пиренеилаланин; D- или L-3-тиенеилаланин; D- или L-(2-пиридинил)аланин; D- или L-(3-пиридинил)аланин; D- или L-(2-пиразинил)аланин; D- или L-(4-изопропил)фенилглицин; D-(трифторметил)-фенилглицин; D-(трифторметил)-фенилаланин; D-п-фтор-фенилаланин; D- или L-п-бифенилфенилаланин; D- или L-п-метокси-бифенилфенилаланин; D- или L-2-индол(алкил)аланины; и D- или L-алкилаланины, где алкил может представлять собой замещенный или незамещенный метил, этил, пропил, гексил, бутил, пентил, изопропил, изобутил, втор-изобутил, изопентил или некислую аминокислоту. Ароматические кольца ненатуральной аминокислоты, которые могут использоваться вместо натуральных ароматических колец, включают, например, ароматические кольца тиазолила, тиофенила, пиразолила, бензимидазолила, нафтила, фуранила, пирролила и пиридила.

Миметики кислых аминокислот могут быть сгенерированы замещением некарбоксилатными аминокислотами при сохранении отрицательного заряда; (фосфоно)аланином; и сульфатированным треонином. Карбоксильные боковые группы (например, аспартил или глутамил) могут также быть селективно модифицированы реакцией с карбодиимидами (R'-N-C-N-R'), включая, например, 1-циклогексил-3-(2-морфолинил-(4-этил)цианамид или 1-этил-3-(4-азония-4,4-диметилпентил)цианамид. Аспартильная или глутамильная группы могут также быть преобразованы в аспарагинильную и глутаминильную группы реакцией с ионами аммония.

Миметики основных аминокислот могут быть сгенерированы замещением, например, в дополнение к лизину и аргинину, аминокислотами орнитином, цитруллином или (гуанидино)-уксусной кислотой или (гуанидино)алкилуксусной кислотой, где алкил может представлять собой замещенный или незамещенный метил, этил, пропил, гексил, бутил, пентил, изопропил, изобутил, втор-изобутил, изопентил или некислую аминокислоту. Аспарагин или глутамин могут быть заменены нитрильным производным (например, содержащим CN-группу вместо COOH). Аспарагинильные и глутаминильные остатки могут быть дезаминированы до соответствующих аспартильных или глутамильных остатков.

Миметики аргинина могут быть сгенерированы реакцией аргинила с одним или более реагентами, включая, например, фенилглиоксаль, 2,3-бутандион, 1,2-циклогександион или нингидрин, в случае необходимости в щелочных условиях. Миметики остатка тирозина могут быть сгенерированы путем реакции тирозила с ароматическими соединениями диазония или тетранитрометаном. N-ацетилимидазол и тетранитрометан могут использоваться для формирования разновидностей O-ацетилтирозила и 3-нитро-производных, соответственно.

Миметики лизина могут быть сгенерированы (и амино-концевые остатки могут быть изменены) путем реакции лизинила с ангидридами янтарной или других карбоновых кислот. Миметики лизина и других альфа-амино-содержащих остатков могут также быть сгенерированы реакцией с имидоэфирами, такими как метил пиколинимидат, пиридоксаль фосфат, пиридоксаль, хлорборгидрид, тринитробензолсульфоновая кислота, O-метилизомочевина, 2,4-пентандион, и катализируемыми трансамидазой реакциями с глиоксилатом.

Миметики метионина могут быть сгенерированы реакцией с метионин сульфоксидом. Миметики пролина включают, например, пипеколиновую кислоту, тиазолидинкарбоновую кислоту, 3- или 4-гидроксипролин, дегидропролин, 3- или 4-метилпролин и 3,3,-диметилпролин. Миметики гистидина могут быть сгенерированы путем реакции гистидила с диэтилпрокарбонатом или пара-бромфенацил бромидом. Другие миметики включают, например, сгенерированные гидроксилированием пролина и лизина; фосфорилированием гидроксильных групп ферильных или треонильных остатков; метилированием альфа-аминогрупп лизина, аргинина и гистидина; ацетилированием N-концевого амина; метилированием остатков амида главной цепи или замещением N-метил аминокислотами; или амидированием групп C-концевых карбоксильных групп.

Один или более остатков могут также быть заменены аминокислотой (или остатком пептидомиметика) противоположной хиральности. Таким образом, любая аминокислота, встречающаяся в природе в L-конфигурации (которая может также упоминаться как R или S, в зависимости от структуры химического соединения), может быть заменена той же аминокислотой или миметиком, но противоположной хиральности, называемой D-аминокислотой, но которая может дополнительно упоминаться как R- или S-форма.

Пептиды и пептидомиметики по изобретению далее включают модифицированные формы последовательностей, представленных здесь, при условии, что модифицированная форма сохраняет по меньшей мере часть функции немодифицированного пептида или референсного пептида или пептидомиметика. например, модифицированный пептид или пептидомиметик сохранят по меньшей мере часть ингибирующей пролиферацию или ингибирующей G2 активности, но могут иметь увеличенную или уменьшенную ингибирующую пролиферацию или ингибирующую G2 активность по сравнению с референсным пептидом или пептидомиметиком.

Модифицированные пептиды и пептидомиметики могут иметь один или более аминокислотных остатков, замененных другим остатком, добавленных к последовательности или делетированных из последовательности. В одном варианте осуществления, модифицированный пептид или пептидомиметик имеет одну или более аминокислотных замен, вставок или делеций (например, 1-3, 3-5, 5-10 или более). В одном аспекте имеет место замена аминокислотой или миметиком, боковая цепь которой занимает место, подобное таковому референсной аминокислоты или миметика (заменяемой аминокислоты или миметика). В другом аспекте имеет место замена нечеловеческой аминокислотой, которая структурно подобна человеческому остатку. В частном аспекте замена является консервативной заменой аминокислоты.

В рамках изобретения, термин ʺподобное местоʺ означает химическую группу, занимающую трехмерное пространство, подобное по размеру референсной группе. Как правило, группа, занимающая подобное место, будет подобна по размеру референсной группе. Аминокислота или миметик, ʺзанимающие подобное место боковой цепиʺ, имеют боковую цепь, занимающую трехмерное пространство, подобное по размеру референсной аминокислоте или миметику. Частными примерами для d-(Phe-2,3,4,5,6-F), l-(Phe-2,3,4,5,6-F), d-(Phe-3,4,5F), l-(Phe-3,4,5F), d-(Phe-4CF3) или l-(Phe-4CF3) могут быть (l или d-Phe-2R1,3R2,4R3,5R4,6R5), где R1, R2, R3, R4, R5 могут быть хлоридом, бромидом, фторидом, йодидом, водородом, оксидом водорода или отсутствовать. Для маленьких молекул, например, фторида, имеющих размер приблизительно 1 Ангстрем, подобное место может быть отсутствием группы.

Термин ʺконсервативная заменаʺ означает замену одной аминокислоты биологически, химически или структурно подобным остатком. Биологически подобный означает, что замена совместима с биологической активностью, например, антипролиферативной активностью или активностью ингибирования G2. Структурно подобный означает, что аминокислоты имеют боковые цепи с подобной длиной, такие как аланин, глицин и серин или имеющие подобный размер. Химическое сходство означает, что остатки имеют тот же заряд или являются оба гидрофильными или гидрофобными. Частные примеры включают замену одного гидрофобного остатка, такого как изолейцин, валин, лейцин или метионин, другим или замену одного полярного остатка другим, например, замена лизина аргинином, аспарагиновой кислоты глутаминовой кислотой или аспарагина глютамином, треонина серином и т.п.

Пептиды и пептидомиметики по изобретению поэтому включают пептиды и пептидомиметики, имеющие последовательность, которая не идентична последовательностям пептидов и последовательностям пептидомиметиков, сформулированным в Таблице 1. В одном варианте осуществления, пептид или пептидомиметик имеет последовательность, имеющую 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или более идентичности с последовательностью, сформулированной в Таблице 1. В одном аспекте идентичность определяется по отношению к определенной области последовательности, например, амино- или карбокси-концевым остаткам 3-5.

Соединения по изобретению, включая пептиды и пептидомиметики могут быть получены и выделены с использованием любого способа, известного в данной области техники. Пептиды могут быть синтезированы, целиком или частично, с помощью химических способов, известных в данной области техники (см., например, Caruthers (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 215-223; Horn (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 225-232; and Banga, A.K., Therapeutic Peptides and Proteins, Formulation, Processing and Delivery Systems (1995) Technomic Publishing Co., Lancaster, Пенсильвания). Синтез пептида может быть осуществлен с помощью различных твердофазных методов (см., например, Roberge (1995) Science 269:202; Merrifield (1997) Methods Enzymol. 289:3 13), и автоматизированный синтез может быть осуществлен, например, с помощью Синтезатора пептидов ABI 431А (Perkin Elmer) в соответствии с инструкциями производителя.

Индивидуальные синтетические остатки и полипептиды, включающие миметики, могут быть синтезированы с использованием множества процедур и методик, известных в данной области техники (см., например, Organic Syntheses Collective Volumes, Gilman, et al. (Eds) John Wiley & Sons, Inc., Нью-Йорк). Пептиды и миметики пептидов могут также быть синтезированы с использованием комбинаторных методик. Методы для генерации библиотек пептидов и пептидомиметиков известны и включают, например, многоигольчатый, чайного пакетика и split-couple-mix методы (см., например, al Obeidi (1998) Mol. Biotechnol. 9:205 223; Hruby (1997) Curr. Opin. Chem. Biol. 1:114 119; Ostergaard (1997) Mol. Divers. 3:17 27; и Ostresh (1996) Methods Enzymol. 267:220 234). Модифицированные пептиды могут быть также получены способами химической модификации (см., например, Belousov (1997) Nucleic Acids Res. 25:3440 3444; Frenkel (1995) Free Radic. Biol. Med. 19:373 380; и Blommers (1994) Biochemistry 33:7886 7896).

Пептиды могут также быть синтезированы и экспрессированы как белки слияния с одной или более дополнительными областями, связанными с ними для производства более иммуногенного пептида, для более легкого выделения рекомбинантно синтезированного пептида или идентификации и выделения антитела или экспрессирующих антитело В-клеток. Области, облегчающие детекцию и очистку, включают, например, образующие хелаты с металлами пептиды, такие как полигистидиновые тракты и гистидин-триптофановые модули, позволяющие осуществить очистку на иммобилизованных металлах; области белка А, позволяющие осуществить очистку на иммобилизованном иммуноглобулине; и область, используемая в системе экстензионно/афинной очистки FLAGS (Immunex Corp., Сиэтл, Вашингтон). Включение расщепляемой линкерной последовательности, такой как Фактор Xa или энтерокиназа (Invitrogen, Сан-Диего, Калифорния) между областью очистки и пептидом может использоваться для облегчения очистки пептида. например, вектор экспрессии может включать кодирующую пептид последовательность нуклеиновой кислоты, связанную с шестью остатками гистидина, сопровождаемыми тиоредоксином и сайтом расщепления энтерокиназой (см., например, Williams (1995) Biochemistry 34:1787 1797; Dobeli (1998) Protein Expr. Purif. 12:404 14). Остатки гистидина облегчают детекцию и очистку слитыж белков, в то время как сайт расщепления энтерокиназой обеспечивает средство для очистки пептида от остальной части слитого белка. Технология, имеющая отношение к векторам, кодирующим слитые белки и применения слитых белков, известна в данной области техники (см., например, Kroll (1993) DNA Cell. Biol., 12:441-53).

Изобретение далее относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим пептиды по изобретению. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует последовательности пептида по изобретению, имеющие длину приблизительно 8-12, 12-15, 15-18, 15-20, 18-25, 20-25, 25-35, 25-50 или 50-100 аминокислот или больше.

Термины «нуклеиновая кислота» и «полинуклеотид» используются здесь взаимозаменяемо для обозначения всех форм нуклеиновой кислоты, включая дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) и рибонуклеиновую кислоту (РНК). Нуклеиновые кислоты могут быть двойной, одноцепочечной или триплексной, линейной или кольцевой. Нуклеиновые кислоты включают геномную ДНК, кДНК и антисмысловую. Нуклеиновая кислота РНК может быть подвергнутой или не подвергнутой сплайсингу мРНК, рРНК, тРНК или антисмысловой (например, PHKi). Нуклеиновые кислоты по изобретению включают натуральные, синтетические, а также аналоги и производные нуклеотида. Такие измененные или модифицированные полинуклеотиды включают аналоги, обеспечивающие, например, устойчивость к нуклеазе. Длина нуклеиновой кислоты также может быть меньше, чем иллюстрируемые пептидные последовательности. например, подпоследовательность любой из пептидных последовательностей может кодировать пептид, имеющий антипролиферативную или ингибирующую G2 активность.

Нуклеиновая кислота может быть получена с помощью любого из множества известных стандартных способов клонирования и химического синтеза и может быть модифицирована намеренно сайт-направленным мутагенезом или другими рекомбинантными методами, известными специалисту. Чистота полинуклеотидов может быть определена посредством секвенирования, гель-электрофореза и т.п.

Нуклеиновые кислоты по изобретению могут быть встроены в конструкцию нуклеиновой кислоты, в которой на экспрессию нуклеиновой кислоты влияет или регулирует ʺэлемент контроля экспрессииʺ, комбинация, называемая ʺкассетой экспрессииʺ. Термин ʺэлемент контроля экспрессииʺ означает один или несколько элементов последовательности, который регулирует или влияет на экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты, с которой он оперативно связан. Элемент контроля экспрессии, оперативно связанный с последовательностью нуклеиновой кислоты, контролирует транскрипцию и, при необходимости, трансляцию последовательности нуклеиновой кислоты.

Термин ʺоперативно связанныйʺ относится к функциональному соседству, в котором компоненты, описанные таким образом, находятся в отношении, позволяющем им функционировать намеченным образом. Как правило, элементы контроля экспрессии находятся на 5' или 3' концах гена, но могут также быть интронными. Промоторы обычно находятся на 5' конце кодирующей последовательности. «Промотор» означает минимальный элемент последовательности, достаточный для прямой транскрипции.

Элементы контроля экспрессии включают промоторы, энхансеры, терминаторы транскрипции, ослабители генов, старт-кодон (например, ATG) перед кодирующим белок геном. Элементы контроля экспрессии активируют конститутивную транскрипцию, индуцибельную транскрипцию (т.е., требующую внешнего сигнала для активации) или дерепрессируют транскрипцию (т.е. сигнал выключает транскрипцию; удаление сигнала активирует транскрипцию). Кассеты экспрессии могут также включать элементы контроля, достаточные для того, чтобы сделать экспрессию гена контролируемой для определенных типов клеток или тканей (т.е., тканеспецифичные элементы контроля).

Нуклеиновые кислоты по изобретению могут быть встроены в плазмиду для введения в клетку-хозяин и для последующей генетической манипуляции. Плазмида является нуклеиновой кислотой, которая может стабильно размножаться в клетке-хозяине; плазмиды могут в случае необходимости содержать элементы контроля экспрессии для осуществления экспрессии кодирующей пептид нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине. Термин «вектор» используется здесь синонимично с плазмидой и может также включать элемент контроля экспрессии для экспрессии в клетке-хозяине. Плазмиды и векторы обычно содержат по меньшей мере репликатор для размножения в клетке и промотор. Плазмиды и векторы могут поэтому быть использованы, например, для генетической манипуляции кодирующих пептид нуклеиновых кислот, для продукции пептидов и для экспрессии пептидов в клетках-хозяевах или целых организмах.

Пептиды поэтому могут экспрессироваться в бактериальных системах с помощью конститутивных промоторов, таких как T7, или индуцибельных промоторов, таких как pL бактериофага λ, plac, ptrp, ptac (ptrp-lac гибридный промотор); в системах дрожжей с помощью конститутивных промоторов, таких как ADH или LEU2, или индуцибельных промоторов, таких как GAL (см., например, Ausubel et al., In: Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Ch. 13, ed., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, 1988; Grant et al. Methods in Enzymology, 153:516 (1987), eds. Wu & Grossman; Bitter Methods in Enzymology, 152:673 (1987), eds. Berger & Kimmel, Acad. Press, N.Y.; and, Strathern et al., The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces (1982) eds. Cold Spring Harbor Press, Vols. I and II; R. Rothstein In: DNA Cloning, A Practical Approach, Vol.11, Ch. 3, ed. D.M. Glover, IRL Press, Wash., D.C., 1986); в клеточных системах насекомого с помощью конститутивных или индуцибельных промоторов, таких как экдизон; и в системах клеток млекопитающих с помощью конститутивных промоторов, таких как SV40, RSV, или индуцибельных промоторов, полученных из генома клеток млекопитающих, таких как промотор металлотионеин IIA, промотор теплового шока, или полученных из вируса млекопитающего, таких как поздний промотор аденовируса или индуцибельный длинный концевой повтор вируса опухоли молочной железы мыши. Системы экспрессии пептида далее включают векторы, разработанные для использования in vivo, включая аденовирусные векторы (Патент США № 5,700,470 и 5,731,172), аденоассоциированные векторы (Патент США № 5,604,090), векторы на основе вируса простого герпеса (Патент США № 5,501,979) и ретровирусные векторы (Патент США № 5,624,820, 5,693,508 и 5,674,703 и публикации ВОИС WO92/05266 и WO92/14829). Вирус папилломы крупного рогатого скота (BPV) был также использован в генотерапии (Патент США № 5,719,054). Такие векторы генотерапии также включают векторы, основанные на CMV (патент США № 5,561,063).

Изобретение поэтому также относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим пептиды по изобретению, встроенным в клетки-хозяева. В одном варианте осуществления клетка-хозяин является прокариотической клеткой. В другом варианте осуществления клетка-хозяин является эукариотической клеткой. В различных аспектах эукариотическая клетка является клеткой дрожжей или млекопитающих (например, человека, примата и т.д.).

В рамках изобретения «клетка-хозяин» является клеткой, в которую введена нуклеиновая кислота, которая может быть размножена, транскрибирована, или кодируемый пептид экспрессируется. Этот термин также включает любое потомство клетки-хозяина.

Клетки-хозяева включают, но не ограничены ими, микроорганизмы, такие как бактерии или дрожжи; и клетки растения, насекомого и млекопитающих. Например, в рамки изобретения входят бактерии, трансформированные рекомбинантной нуклеиновой кислотой бактериофага, нуклеиновой кислотой плазмиды или космидными векторами экспрессии нуклеиновой кислоты; дрожжи, трансформированные рекомбинантными векторами экспрессии дрожжей; системы растительной клетки, инфицированные рекомбинантными вирусными векторами экспрессии (например, вирусом мозаики цветной капусты, CaMV; вирусом табачной мозаики, TMV) или трансформированные векторами экспрессии рекомбинантной плазмиды (например, плазмиды Ti); клеточные системы насекомого, инфицированные рекомбинантными вирусными векторами экспрессии (например, бакуловирусом); или системы животных клеток, инфицированные рекомбинантными вирусными векторами экспрессии (например, ретровирусами, аденовирусом, вирусом коровьей оспы), или трансформированные системы животных клеток, спроектированные для стабильной экспрессии.

Вектор экспрессии также может содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую селектируемый маркер, придающий резистентность к селективному давлению, или идентифицируемый маркер (например, β- галактозидазу), таким образом позволяя клеткам, имеющим вектор, быть идентифицированными, выращенными и размноженными. Также селектируемый маркер может быть на втором векторе, котрансфицирующемся в клетку-хозяина с первым вектором, содержащим полинуклеотид по изобретению. Могут использоваться множество систем селекции, включая, но не ограничиваясь ими, ген тимидин киназы вируса простого герпеса (Wigler et al., Cell 11:223 (1977)), ген гипоксантин-гуанин фосфорибозилтрансферазы (Szybalska et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026 (1962)) и ген аденин фосфорибозилтрансферазы (Lowy et al., Cell 22:817 (1980)), которые могут использоваться в tk-, hgprt_ или aprt_ клетках, соответственно. Резистентность к метаболиту может использоваться в качестве основания выбора для dhfr, который придает резистентность к метотрексату (O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527 (1981)); гена gpt, придающего резистентность к микофенольной кислоте (Mulligan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981)); гена неомицина, придающего резистентность к аминогликозиду G-418 (Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150:1(1981)); и гена гигромицина, придающего резистентность к гигромицину (Santerre et al., Gene 30:147 (1984)). Дополнительные селектируемые гены включают trpB, позволяющий клеткам использовать индол вместо триптофана; hisD, позволяющий клеткам использовать гистинол вместо гистидина (Hartman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8047 (1988)); и ODC (орнитин декарбоксилаза), который придает резистентность к ингибитору орнитин декарбоксилазы, 2-(дифторметил)-DL-орнитин, DFMO (McConlogue (1987) In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory).

В рамках изобретения термины ʺлечение, разрушающее нуклеиновую кислотуʺ и ʺагент, разрушающий нуклеиновую кислотуʺ означают любой режим лечения, прямо или косвенно повреждающий нуклеиновую кислоту (например, ДНК, кДНК, геномную ДНК, мРНК, тРНК или рРНК). Частные примеры таких агентов включают алкилирующие агенты, нитрозомочевины, антиметаболиты, растительные алкалоиды, растительные экстракты и радиоизотопы. Частные примеры агентов также включают лекарственные средства, разрушающие нуклеиновую кислоту, например, 5-фтороурацил (5-FU), капецитабин, S-1 (тегафур, 5-хлор-2,4-дигидроксипиридин и оксоновая кислота), 5-этинилурацил, арабинозил цитозин (ara-C), 5-азацитидин (5-АС), 2',2'-дифтор-2'-деоксицитидин (dFdC), антиметаболиты пурина (меркаптопурин, азатиопурин, тиогуанин), гемцитабин гидрохлорид (Gemzar), пентостатин, аллопуринол, 2-фтор-арабинозил-аденин (2F-ara-A), гидроксимочевину, серную горчицу (бисхлорэтинилсульфид), меклорэтамин, мелфалан, хлорамбуцил, циклофосфамид, ифосфамид, тиотепу, AZQ, митомицин C, диангидрогалактитол, дибромдуцитол, алкилсульфонат (бусульфан), нитрозомочевины (BCNU, CCNU, 4-метил CCNU или ACNU), прокарбазин, дакарбазин, ребеккамицин, антрациклины, такие как доксорубицин (адриамицин; ADR), даунорубицин (Cerubicine), идарубицин (Idamycin) и эпирубицин (Ellence), антрациклиновые аналоги, такие как митоксантрон, актиномицин D, неинтеркалирующие ингибиторы топоизомеразы, такие как эпиподофиллотоксины (этопозид=VP16, тенипозид=VM-26), подофиллотоксин, блеомицин (Bleo), пеплеомицин, соединения, формирующие аддукты с нуклеиновой кислотой, включая производные платины (например, цисплатин (CDDP), транс-аналог цисплатина, карбоплатин, ипроплатин, тетраплатин и оксалиплатин), камптотецин, топотекан, иринотекан (CPT-11) и SN-38. Частные примеры лечений, разрушающих нуклеиновую кислоту, включают облучение (например, ультрафиолетовое (УФ), инфракрасное (ИК), или альфа-, бета- или гамма-облучение) и экологический шок (например, гипертермию).

В рамках изобретения термины ʺантипролиферативное лечениеʺ и ʺантипролиферативный агентʺ означают любой режим лечения, прямо или косвенно ингибирующий пролиферацию клеток, вируса, бактерий или другого одноклеточного или многоклеточного организма независимо от того, повреждают ли лечение или агент нуклеиновую кислоту. Частными примерами антипролиферативных агентов является противоопухолевые и противовирусные лекарственные средства, ингибирующие пролиферацию клеток или пролиферацию или репликацию вирусов. Частные примеры включают, среди прочего, циклофосфамид, азатиоприн, циклоспорин A, преднизолон, мелфалан, хлорамбуцил, мехлорэтамин, бисульфан, метотрексат, 6-меркаптопурин, тиогуанин, цитозин арабинозид, таксол, винбластин, винкристин, доксорубицин, актиномицин D, митрамицин, кармустин, ломустин, семустин, стрептозотоцин, гидроксимочевину, цисплатин, митотан, прокарбазин, дакарбазин и дибромманнит. Анти-пролиферативные агенты, вызывающие ошибки репликации нуклеиновой кислоты или ингибирующие репликацию нуклеиновой кислоты, такие как нуклеозид и аналоги нуклеотида (например, AZT или 5-AZC).

Пептиды и пептидомиметики по изобретению могут также увеличивать антипролиферативную активность стабилизирующих или дестабилизирующих микротрубочки агентов, таких как алкалоиды барвинка (винбластин=VLB, винкристин=VCR, винорелбин=VRLB, винфлунин=VFL) и таксаны (паклитаксел и доцетаксел=таксотар). Таким образом, такие агенты могут быть дополнительно включены в композиции по изобретению и использоваться в способах по изобретению.

Клетки, которые могут быть обработаны соединениями по изобретению, включают любую клетку, пролиферацию которой желательно ингибировать или предотвратить in vitro, ex vivo или in vivo. Определенные клетки-мишени показывают более короткое, чем при нормальном клеточном цикле, время контрольной точки G1 или имеют сниженную контрольную точку клеточного цикла G1, таким образом, что клетки выходят из контрольной точки G1 до истечения достаточного времени для полной репарации нуклеиновой кислоты. Клетки кандидаты поэтому включают быстро пролиферирующие клетки, безотносительно того, являются ли эти клетки нормальными или патологическими. Частными примерами являются доброкачественные или опухолевые, метастатические или неметастатические клетки. Дополнительные клетки кандидаты могут быть идентифицированы путем измерения их скорости пролиферации или отрезка времени, в течение которого клетки остаются в фазе G1. Клетки кандидаты могут также быть идентифицированы путем контакта тестируемой клетки с одним только соединением по изобретению или в комбинации с лечением, разрушающим нуклеиновую кислоту, и определения, показывает ли введенная в контакт клетка сниженную пролиферацию или увеличенную гибель или апоптоз/катастрофу клеток.

Соединения по изобретению и агент, активирующий Т-клетки, и/или ингибитор иммунной контрольной точки поэтому могут быть использованы для ингибирования пролиферации клеток in vitro, ex vivo и in vivo. Таким образом, пациенты, имеющие или находящиеся под риском развития нарушения или физиологического состояния, характеризуемого патологической или нежелательной или нежелаемой пролиферацией клеток или выживанием клеток или патологической или недостаточной клеточной дифференцировкой, могут быть подвергнуты лечению одним только соединением по изобретению или в комбинации с агентом, активирующим Т-клетки, и/или ингибитором иммунной контрольной точки.

Таким образом, изобретение относится к способам ингибирования пролиферации клеток, способам увеличения чувствительности клетки к агенту или лечению, разрушающему нуклеиновую кислоту, и способам увеличения повреждения нуклеиновой кислоты клетки in vitro, ex vivo и in vivo. В одном варианте осуществления способ включает контакт клетки (например, культивируемой клетк или клетки, присутствующей в организме пациента) с количеством пептида или пептидомиметика по изобретению и агента, активирующего Т-клетки, достаточным для ингибирования пролиферации клетки. В другом варианте осуществления способ включает контакт клетки (например, культивируемой клетки или клетки, присутствующей в организме пациента) с количеством пептида или пептидомиметика по изобретению и ингибитора иммунных контрольных точек, достаточным для ингибирования пролиферации клетки. В дальнейшем варианте осуществления способ включает контакт клетки (например, культивируемой клетк или клетки, присутствующей в организме пациента) с количеством пептида или пептидомиметика по изобретению и агента, активирующего Т-клетки, и ингибитора иммунных контрольных точек, достаточным для ингибирования пролиферации клетки.

В другом варианте осуществления способ включает контакт клетки с количеством пептида или пептидомиметика по изобретению и/или агента, активирующего Т-клетки, и/или ингибитора иммунных контрольных точек, достаточным для увеличения чувствительности клетки к агенту или лечению, разрушающему нуклеиновую кислоту. В еще одном варианте осуществления способ включает контакт клетки с количеством пептида или пептидомиметика по изобретению и/или агента, активирующего Т-клетки, и/или ингибитора иммунных контрольных точек, достаточным для увеличения повреждения нуклеиновой кислоты клетки. В различных аспектах способ далее включает контакт клетки с агентом, разрушающим нуклеиновую кислоту, или экспонирование клетки к лечению, разрушающему нуклеиновую кислоту.

Изобретение также относится к способам лечения пролиферативного нарушения или нарушения дифференцировки у пациента, включая состояния, характеризуемые нежелательной или нежелательной пролиферацией клеток или выживанием клеток, состояния, характеризуемые недостаточным или аберрантным апоптозом, состояния, характеризуемые аберрантным или недостаточным выживанием клеток, а также состояния, характеризуемые аберрантной или недостаточной клеточной дифференцировкой. В одном варианте осуществления способ включает введение пациенту, имеющему или рискующему получить пролиферативное нарушение, количества пептида или пептидомиметика по изобретению и/или агента, активирующего Т-клетки, и/или ингибитора иммунных контрольных точек, эффективного для лечения пролиферативного нарушения. В одном аспекте количество является достаточным для улучшения состояния пациентов. В частных аспектах улучшение включает в по меньшей мере части клеток-мишеней (например, патологически пролиферирующих клеток), уменьшение пролиферации клеток, сокращение числа клеток, ингибирование увеличения числа клеток, увеличение апоптоза или уменьшение выживания. В еще одном аспекте пациенту вводят соединение по изобретению до, одновременно с или после лечения, ингибирующего пролиферацию клеток. В дополнительных частных аспектах, по меньшей мере часть клеток пролиферативного нарушения локализованы в крови, молочной железе, легком, щитовидной железе, голове или шее, мозге, лимфе, желудочно-кишечном тракте, мочеполовой системе, почке, поджелудочной железе, печени, кости, мышце или коже.

В другом варианте осуществления способ включает введение количества соединения и/или агента, активирующего Т-клетки, и/или ингибитора иммунных контрольных точек пациенту для лечения солидной опухоли. В еще одном варианте осуществления способ включает введение количества соединения и/или агента, активирующего Т-клетки, и/или ингибитора иммунных контрольных точек пациенту для лечения опухоли жидких тканей. В различных аспектах пациенту, имеющему опухоль, вводят соединение по изобретению до, одновременно с или после агента, активирующего Т-клетки, или ингибитора иммунных контрольных точек или другой противоопухолевой терапии.

В рамках изобретения термины ʺпролиферативное нарушениеʺ и ʺпролиферативное состояниеʺ означают любое патологическое или непатологическое физиологическое состояние, характеризуемое аберрантной или нежелательной пролиферацией (например, клетки, вируса, бактерий, гриба и т.д.). Термины ʺпролиферативное нарушениеʺ и ʺпролиферативное состояниеʺ означают любое патологическое или непатологическое физиологическое состояние, характеризуемое аберрантной или нежелательной пролиферацией клеток, а также включая состояния, характеризуемые нежелательной или нежелаемой пролиферацией клеток или выживанием клеток (например, вследствие недостаточного апоптозу), состояния, характеризуемые недостаточным или аберрантным или недостаточным апоптозом, а также состояния, характеризуемые аберрантным или нежелательным или нежелаемым выживанием клеток. Термин ʺнарушение дифференцировкиʺ означает любое патологическое или непатологическое физиологическое состояние, характеризуемое аберрантной или недостаточной дифференцировкой.

Пролиферативные нарушения или нарушения дифференцировки, поддающиеся лечению, включают заболевания и непатологические физиологические состояния, как доброкачественные, так и неопластические, характеризуемые патологическими или нежелательными числами клеток, ростом клеток или выживанием клеток. Такие нарушения или состояния могут поэтому составлять болезненное состояние и включать все типы злокачественного роста или опухолеродных процессов, метастатических тканей или злокачественно трансформированных клеток, тканей или органов, или могут быть непатологическими, т.е., с отклонением от нормы, но которые, как правило, не связаны с заболеванием. Частным примером непатологического состояния, которое может быть подвергнуто лечению в соответствии с изобретением, является возобновление роста ткани от репарации раны, приводящее к рубцеванию.

Клетки, включающие пролиферативное нарушение или нарушение дифференцировки, могут быть агрегированы в клеточную массу или диспергированы. Термин «солидная опухоль» относится к неоплазиям или метастазам, которые обычно агрегируются вместе и образуют массу. Частные примеры включают висцеральные опухоли, такие как рак желудка или рак толстой кишки, гепатомы, венозные карциномы, опухоли/раковые образования легкого и мозга. ʺОпухоль жидких тканейʺ относится к неоплазиям гематопоэтической системы, таким как лимфомы, миеломы и лейкозы, или неоплазиям, которые являются диффузными по своей природе, поскольку они, как правило, не формируют твердую массу. Частные примеры лейкозов включают острый и хронический лимфообластный, миелобластный и множественную миелому.

Такие нарушения включают опухоли или раковые образования, которые могут затронуть фактически любой тип клеток или тканей, например, карциному, саркому, меланому, метастатические нарушения или гематопоэтические неопластические нарушения. Метастатическая опухоль может явиться результатом множества основных типов опухоли, включая, но не ограничиваясь ими, опухоли молочной железы, легкого, щитовидной железы, головы и шеи, мозга, лимфоидной, желудочно-кишечной (рот, пищевод, желудок, тонкая кишка, толстая кишка, прямая кишка), мочеполовой системы (матка, яичник, шейка, мочевой пузырь, яичко, половой член, предстательная железа), почки, поджелудочной железы, печени, кости, мышцы, кожи и т.д.

Карциномы относятся к злокачественным образованиям эпителиальной или эндокринной ткани и включают карциномы системы органов дыхания, желудочно-кишечные системные карциномы, мочеполовые системные карциномы, тестикулярные карциномы, карциномы молочной железы, карциномы предстательной железы, эндокринные системные карциномы и меланомы. Примеры карцином включают такие, которые формируются из шейки, легкого, предстательной железы, молочной железы, головы и шеи, толстой кишки, печени и яичника. Этот термин также включает карциносаркомы, например, которые включают злокачественные опухоли, составленные из раковых и саркоматозных тканей. Аденокарцинома включает карциному железистой ткани, или в которой опухоль формирует железу как структуру.

Саркомы относятся к злокачественным опухолям мезенхимального происхождения. Примеры сарком включают, например, лимфосаркому, липосаркому, остеосаркому и фибросаркому.

В рамках изобретения термин ʺгематопоэтическое пролиферативное нарушениеʺ означает заболевание, включающее гиперпластичные/неопластические клетки гематопоэтического происхождения, например, происходящие от миелоидных, лимфоидных или эритроидных линий или их клеток-предшественников. Как правило, заболевания являются результатом плохо дифференцируемых острых лейкозов, например, эритробластического лейкоза и острого мегакариобластического лейкоза. Дополнительные примеры миелоидных нарушений включают, но не ограничены ими, острый промиелоидный лейкоз (APML), острый миелогенный лейкоз (AML) и хронический миелогенный лейкоз (CML); лимфоидные злокачественные образования включают, но не ограничены ими, острый лимфобластный лейкоз (ALL), включая B-клеточный ALL и T-клеточный ALL, хронический лимфолейкоз (CLL), пролимфоцитарный лейкоз (PLL), волосатоклеточный лейкоз (HLL) и макроглобулинемию Вальденстрема (WM). Дополнительные злокачественные лимфомы включают, но не ограничены ими, неходжкинскую лимфому и ее варианты, периферические Т-клеточные лимфомы, Т-клеточный лейкоз/лимфому взрослых (ATL), кожную Т-клеточную лимфому (CTCL), лейкоз из больших зернистых лимфоцитов (LGF), болезнь Ходжкина и болезнь Рид-Стернберга.

Лечения для использования в комбинации с соединениями по изобретению включают любое антипролиферативное, повреждающее нуклеиновую кислоту или противоопухолевое лечение, как раскрыто здесь или известно в данной области техники. Например, антипролиферативное или противоопухолевое лечение может включать лучевую терапию или хирургическую резекцию, в случае необходимости, в комбинации с медикаментозным лечением. Лечение может включать введение химического вещества, такого как радиоизотоп, лекарственное средство, такое как химиотерапевтический агент, или генетическую терапию, такую как антионкоген (например, Rb, DCC, p53 и т.д.), доминантный негативный онкоген или антисмысловой по отношению к онкогену. Соединения могут быть введены до, одновременно с или после других протоколов лечения. Например, пациенту-кандидату для антипролиферативной терапии (например, радиотерапии, химиотерапии, генотерапии, хирургической резекции и т.д.) может быть введено соединение по изобретению и/или агент, активирующий Т-клетки, и/или ингибитор иммунной контрольной точки до инициации антипролиферативной терапии. Таким образом, обеспечиваются способы профилактического лечения.

Термин «пациент» относится к животным, в типичном случае млекопитающим, таким как приматы (человек, обезьяны, гиббоны, шимпанзе, орангутаны, макаки), домашние животные (собаки и кошки), сельскохозяйственные животные (лошади, рогатый скот, козы, овцы, свиньи) и подопытные животные (мышь, крыса, кролик, морская свинка). Пациенты включают животные модели заболевания (например, несущие опухоль мыши).

Пациенты, подходящие для лечения, включают таких, которые в настоящее время переносят или являются кандидатами на лечение пролиферативного нарушения или нарушения дифференцировки (например, противоопухолевая терапия). Дополнительные примеры пациента-кандидата включают, например, пациенты, имеющие риск развития пролиферативного нарушения. Способы по изобретению поэтому применимы для лечения пациентов, которые подвергается риску развития пролиферативного нарушения, но еще не показывает явных симптомов нарушения. Пациенты с риском могут быть идентифицированы как имеющие генетическую предрасположенность или семейный анамнез в отношении развития пролиферативного нарушения. Например, пациенты, имеющие активированный онкоген или имеющие мутацию или делецию гена-супрессора опухоли, являются кандидатами. Пациенты с риском могут поэтому быть идентифицированы с помощью обычного генетического скрининга в отношении наличия генетического повреждения или изучения семейного анамнеза пациентов для установления, что они подвергаются риску нарушения. Частным примером пациента с риском является пациент с семейным анамнезом или другой характерной генетической предрасположенностью к раку, при которой неопластические или резистентные к лекарственным средствам неопластические клетки экспрессируют CD40. Частным специфическим примером генетического заболевания является ретинобластома, вызывающаяся дефектом в гене супрессора опухоли Rb.

Вводимые количества, как правило, находятся в ʺэффективном количествеʺ или ʺдостаточном количествеʺ, которое является количеством, достаточным для получения желаемого аффекта. Эффективные количества поэтому включают одно или более из следующего: уменьшение пролиферации клеток, сокращение числа клеток, ингибирование увеличенной пролиферации, ингибирование увеличенного числа клеток, увеличение апоптоза или уменьшение выживания по меньшей мере части клеток, включая пролиферирующие клетки (например, по меньшей мере некоторые клетки-мишени). Таким образом, например, где это желаемо для ингибирования пролиферации клеток, эффективное количество представляет собой количество, детектируемым образом уменьшающее пролиферацию клеток или число пролиферирующих клеток, или увеличивающее апоптоз клеток или уменьшающее выживание клеток. Количество может поэтому быть достаточным, чтобы сократить количество клеток-мишеней, стабилизировать число клеток-мишеней или увеличить ингибирование числа клеток-мишеней. Например, когда нарушение включает солидную опухоль, уменьшение размера опухоли, стабилизация размера опухоли или предотвращение дальнейшего роста опухоли в по меньшей мере части опухоли (например, ингибирование роста 5-10% клеток или 10-20% или более клеток, включающих массу опухоли) является удовлетворительным клиническим результатом. Если нарушение включает опухоль жидких тканей, сокращение количества опухолевых клеток, стабилизация числа опухолевых клеток или ингибирование дальнейших увеличений числа опухолевых клеток в по меньшей мере субпопуляции опухолевых клеток (например, ингибирование роста 5-10% клеток или 10-20% или более клеток) представляет собой удовлетворительный клинический результат.

Кроме того, количества, которые рассматриваются как эффективные, могут предотвратить или ингибировать прогрессию состояния или нарушения. Например, некоторые опухоли, в то время как они прогрессируют, становятся все более и более агрессивными, включая развитие до метастатических форм. Таким образом количества, которые также рассматриваются как эффективные, приводят к ослаблению или препятствованию тому, чтобы опухоли становились все более и более агрессивными или метастазировали. Соответственно, ингибирование или предотвращение ухудшения нарушения или состояния, т.е., стабилизация состояния является дополнительным удовлетворительным клиническим результатом.

Исследование биологического образца, содержащего опухоль жидких тканей (например, кровь или образец ткани), может установить, были ли масса или число опухолевых клеток уменьшены, или произошло ли ингибирование пролиферации опухолевых клеток. Для солидной опухоли инвазивные и атравматичные способы отображения могут установить сокращение размера опухоли или ингибирование увеличения размера опухоли. Уменьшение количества рецепторов рецептор-положительной опухоли может использоваться для оценки сокращения или ингибирования пролиферации опухолевых клеток. Количества гормона гормонпродуцирующей опухоли, например, рак молочной железы, тестикул или яичника, может использоваться для оценки сокращения или ингибирования пролиферации опухоли.

Эффективные количества могут также объективно или субъективно уменьшать или сокращать серьезность или частоту симптомов, связанных с нарушением или состоянием. Например, количество соединения по изобретению, уменьшающее боль, тошноту или другой дискомфорт или увеличивающее аппетит или улучшающее субъективное самочувствие, является удовлетворительным клиническим результатом.

Эффективные количества также включают сокращение количества (например, дозировки) или частоты лечения с другим протоколом, который считают удовлетворительным клиническим результатом. Например, больной раком, получающий лечение соединением по изобретению в комбинации с агентом, активирующим Т-клетки, и/или ингибитором иммунной контрольной точки может потребовать меньшего количества лечения, разрушающего нуклеиновую кислоту, для ингибирования пролиферации раковых клеток. В этом примере эффективное количество включает количество, уменьшающее частоту дозировки или количество агента, разрушающего нуклеиновую кислоту, которое вводят пациенту, по сравнению с частотой дозировки или количеством, вводимым без лечения соединением по изобретению.

Способы по изобретению, приводящие к улучшению состояния пациента или к терапевтическому преимуществу, могут быть относительно короткими по продолжительности, например, улучшение может продлиться несколько часов, дней или недель или простираться на более длительный промежуток времени, например, месяцы или годы. Эффективное количество не обязательно должно приводить к полному устранению симптомов состояния или нарушения. Таким образом, удовлетворительный клинический результат для эффективного количества достигается, когда существует субъективное или объективное улучшение состояния пациентов, определяемое с использованием любого из использовавшихся ранее критериев или других критериев, известных в данной области техники, подходящих для определения статуса нарушения или состояния за короткий или длительный период времени. Количество, эффективное для обеспечения одного или более благоприятных воздействий, как описано здесь или известно в данной области техники, упоминается как «улучшение» состояния пациента или ʺтерапевтическое преимуществоʺ для пациента.

Эффективное количество соединения по изобретению, агента, активирующего Т-клетки, и ингибитора иммунных контрольных точек может быть определено на основании исследований на животных или в случае необходимости в клинических испытаниях на человеке. Специалисту известны различные факторы, которые могут влиять на дозировку и выбор времени требуемого для лечения конкретного пациента, включая, например, общее состояние здоровья, возраст или пол пациента, серьезность или стадию нарушения или состояния, предыдущие лечения, восприимчивости к нежелательным побочным эффектам, желаемый исход болезни и наличие других нарушений или состояний. Такие факторы могут влиять на дозировку и выбор времени, требуемого для обеспечения количества, достаточного для терапевтического преимущества. Режим введения также учитывает фармакокинетику, т.е., скорость абсорбции фармацевтической композиции, биодоступность, метаболизм и клиренс (см., например, Egleton (1997) ʺBioavailability and transport of peptides and peptide drugs into the brainʺ Peptides 18:1431 1439; и Langer (1990) Science 249:1527-1533). Кроме того, дозы или протоколы лечения могут быть специфично скорректированы под пациента или изменены на основе фармакогеномных данных.

Соединения, агенты, активирующие Т-клетки, и ингибиторы иммунной контрольной точки могут поэтому быть введены индивидуально или в форме фармацевтической композиции, системно, регионарно (например, направлены к органу или ткани, например, инъекцией в воротную вену для лечения пролиферативного нарушения печени) или локально (например, непосредственно в массу опухоли), в соответствии с любым протоколом или путем, обеспечивающим достижение желаемого эффекта. Соединения и фармацевтические композиции могут вводиться в единственной дозе или множестве доз каждый день (например, в низкой дозе), или периодически (например, через день, один раз в неделю и т.д. в более высокой дозе). Соединения, агенты, активирующие Т-клетки, и ингибиторы иммунной контрольной точки и фармацевтические композиции могут быть введены ингаляцией (например, эндотрахеально), перорально, внутривенно, внутриартериально, интраваскулярно, интратекально, внутрибрюшинно, внутримышечно, подкожно, внутриполостно, чрескожно (например, топически), трансмукозально (например, щечным, через мочевой пузырь, вагинальным, маточным, ректальным или носовым путем), многократными введениями, замедленным высвобождением (например, постепенная перфузия в течение долгого времени) или единственным болюсом. Имплантируемые устройства, включая микротехнологические устройства, для введения лекарственных средств, известны и также применимы для доставки соединений по изобретению пациенту.

Соединения, агенты, активирующие Т-клетки, и ингибиторы иммунной контрольной точки, вводимые внутривенно (IV), вводят в количестве от приблизительно 0,01 мг/час до приблизительно 1,0 мг/час за несколько часов (как правило, 1, 3 или 6 часов), что может быть повторено в течение одной или более недель с неустойчивыми циклами. Значительно более высокие дозировки (например, простирающиеся приблизительно до 10 мг/мл) могут использоваться, особенно когда лекарственное средство вводят в обособленный участок, а не в кровоток, например, в полость тела или в полость органа, например, цереброспинальную жидкость (CSF).

Изобретение поэтому также относится к фармацевтическим композициям. Такие фармацевтические композиции пригодны для введения пациенту in vivo или ex vivo и, например, для лечения пациента соединениями по изобретению, агентами, активирующими Т-клетки, и ингибиторами иммунной контрольной точки.

В рамках изобретения термин «фармацевтически приемлемый» и «физиологически приемлемый» включает растворители (водный или неводный), растворы, эмульсии, дисперсионные среды, покрытия, изотонические и промотрующие или задерживающие абсорбцию агенты, совместимые с фармацевтическим введением. ʺФармацевтическая композицияʺ или «фармацевтический состав» поэтому относится к композиции, подходящей для фармацевтического использования у пациента. Фармацевтические композиции и составы включают количество соединения по изобретению, например, эффективное количество пептида или пептидомиметика, нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид или пептидомиметик, вектора или клетки по изобретению, и фармацевтически или физиологически приемлемый носитель.

Фармацевтические композиции могут быть составлены таким образом, чтобы быть совместимыми с определенным путем введения, системным или местным. Таким образом, фармацевтические композиции включают носители, разбавители или эксципиенты, подходящие для введения различными путями.

Составы или энтеральное (пероральное) введение могут содержаться в таблетке (с покрытием или без покрытия), капсуле (твердой или мягкой), микросфере, эмульсии, порошке, грануле, кристалле, суспензии, сиропе или эликсире. Стандартные нетоксичные твердые носители, включающие, например, фармацевтические сорта маннита, лактозу, крахмал, стеарат магния, сахарин натрия, тальк, целлюлозу, глюкозу, сахарозу, карбонат магния, могут использоваться для получения твердых составов. Дополнительные активные соединения (например, консерванты, антибактериальные, противовирусные и противогрибковые агенты) могут также быть включены в составы. Жидкие состав может также использоваться для энтерального введения. Носитель может быть выбран из различных масел, включая каменное, животное, растительное или синтетическое, например, арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло. Подходящие фармацевтические эксципиенты включают, например, крахмал, целлюлозу, тальк, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат магния, стеарат натрия, моностеарат глицерина, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропиленгликоль, воду, этанол.

Фармацевтические композиции для энтеральной, парентеральной или трансмукозальной доставки включают, например, воду, солевой раствор, фосфатный буферный солевой раствор, раствор Хэнка, раствор Рингера, декстрозу/солевой раствор и растворы глюкозы. Составы могут содержать вспомогательные вещества для приближения к физиологическим условиям, такие как буферные агенты, регуляторы тоничности, смачивающие агенты, детергенты и т.п. Добавки могут также включать дополнительные активные ингредиенты, такие как бактерицидные агенты или стабилизаторы. Например, раствор может содержать ацетат натрия, лактат натрия, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция, монолаурат сорбитана или олеат триэтаноламина. Дополнительные парентеральные составы и способы описаны в Bai (1997) J. Neuroimmunol. 80:65 75; Warren (1997) J. Neurol. Sci. 152:31 38; and Tonegawa (1997) J. Exp. Med. 186:507 515. Парентеральный препарат может находиться в ампулах, шприцах для одноразового применения или многодозовых пузырьках, сделанных из стекла или пластмассы.

Фармацевтические композиции для внутрикожного или подкожного введения могут включать стерильный разбавитель, такой как вода, физиологический раствор, нелетучие масла, полиэтиленгликоли, глицерин, пропиленгликоль или другие синтетические растворители; антибактериальные агенты, такие как бензиловый спирт или метилпарабен; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, глутатион или бисульфит натрия; хелатирующие агенты, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота; буферные агенты, такие как ацетаты, цитраты или фосфаты, и регуляторы тоничности, такие как хлорид натрия или декстроза.

Фармацевтические композиции для инъекции включают водные растворы (когда они являются водорастворимыми) или дисперсии и стерильные порошки для экстемпорального получения стерильных инъецируемых растворов или дисперсий. Для внутривенного введения подходящие носители включают физиологический солевой раствор, бактериостатическую воду, Cremophor EL™ (BASF, Парсиппани, Нью-Джерси) или фосфатный буферный солевой раствор (PBS). Носитель может быть растворителем или дисперсионной средой, содержащей, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и т.п.) и подходящие смеси этих веществ. Текучесть может поддерживаться, например, при помощи покрытия, такого как лецитин, поддержанием требуемого размера частиц в случае дисперсии и при помощи сурфактантов. Антибактериальные и противогрибковые агенты включают, например, парабены, хлорбутанол, фенол, аскорбиновую кислоту и тимеросал. Изотонические агенты, например, сахара, полиспирты, такие как маннит, сорбит, хлорид натрия, могут быть включены в композицию. Конечные растворы могут быть упакованы для использования такими, как они есть, или лиофилизированы, лиофилизированный препарат может позже быть объединен со стерильным раствором до введения.

Фармацевтически приемлемые носители могут содержать соединение, стабилизирующее, увеличивающее или задерживающее абсорбцию или клиренс. Такие соединения включают, например, углеводы, такие как глюкоза, сахароза или декстраны; низкомолекулярные белки; композиции, уменьшающие клиренс или гидролиз пептидов; или эксципиенты или другие стабилизаторы и/или буферы. Агенты, задерживающие абсорбцию, включают, например, моностеарат алюминия и желатин. Детергенты могут также использоваться для стабилизации или увеличения или уменьшения абсорбции фармацевтической композиции, включая липосомальные носители. Для защиты от расщепления в пищеварительном тракте соединение, агент, активирующий Т-клетки, и/или ингибитор иммунной контрольной точки могут быть скомбинированы с композицией для придания им устойчивости к кислотному и ферментативному гидролизу, или соединение, агент, активирующий Т-клетки, и/или ингибитор иммунной контрольной точки могут быть объединены в соответственно устойчивом носителе, таком как липосома. Средства защиты соединений, агентов, активирующих Т-клетки, и ингибиторов иммунной контрольной точки от расщепления в пищеварительном тракте известны в данной области техники (см., например, Fix (1996) Pharm Res. 13:1760 1764; Samanen (1996) J. Pharm. Pharmacol. 48:119 135; и патент США 5,391,377, где описаны липидные композиции для пероральной доставки терапевтических агентов).

Для трансмукозального или чрескожного введения в составе используются пенетранты, адекватный барьеру, через который требуется проникнуть. Такие пенетранты являются известными в данной области техники и включают, например, для трансмукозального введения, детергенты, соли желчных кислот и производные фусидовой кислоты. Трансмукозальное введение может осуществляться через использование назальных спреев или суппозиториев (см., например, Sayani (1996) ʺSystemic delivery of peptides and proteins across absorptive mucosaeʺ Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 13:85 184). Для трансдермального введения активное соединение может быть составлено в мази, бальзамы, гели или кремы, как известно в данной области техники. Трансдермальные системы доставки могут также быть получены с помощью пластырей.

Для доставки путем ингаляции фармацевтический состав может быть введен в форме аэрозоля. Для введения в форме аэрозоля состав может доставляться в тонко раздробленной форме вместе с сурфактантом и пропеллентом. В другом варианте осуществления изобретение относится к устройству для доставки состава к респираторной ткани, в которую испаряется состав. Другие системы доставки, известные в данной области техники, включают сухие порошковые аэрозоли, жидкие системы доставки, ингаляторы, небулайзеры и пропеллентные системы (см., например, Patton (1998) Biotechniques 16:141-143; Dura Pharmaceuticals, San Diego, CA; Aradigm, Hayward, CA; Aerogen, Santa Clara, CA; and Inhale Therapeutic Systems, San Carlos, CA).

Могут использоваться биоразлагаемые, биосовместимые полимеры, такие как этилен винилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиорто-эфиры и полимолочная кислота. Способы получения таких составов известны специалисту. Материалы могут также быть получены коммерчески от Alza Corporation и Nova Pharmaceuticals, Inc. Липосомальные суспензии (включая липосомы, нацеливаемые к клеткам или тканям с использованием антител или вирусных белков оболочки), могут также использоваться в качестве фармацевтически приемлемых носителей. Они могут быть получены согласно способам, известным в данной области техники, например, как описано в Патента США 4,235,871; 4,501,728; 4,522,811; 4,837,028; 6,110,490; 6,096,716; 5,283,185; 5,279,833; Akimaru (1995) Cytokines Mol. Ther. 1:197 210; Alving (1995) Immunol. Rev. 145:5 31; and Szoka (1980) Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467). Биоразлагаемые микросферы или капсулы или другие биоразлагаемые полимерные конфигурации, способные к длительной доставке маленьких молекул, включая пептиды, известны в данной области техники (см., например, Putney (1998) Nat. Biotechnol. 16:153 157). Соединения, агенты, активирующие Т-клетки, и ингибиторы иммунной контрольной точки могут быть включены в мицеллы (см., например, Suntres (1994) J. Pharm. Pharmacol. 46:23 28; Woodle (1992) Pharm. Res. 9:260 265). Пептиды могут быть присоединены к поверхности липида монослоя или двойного слоя. Например, пептиды могут быть присоединены к гидразид-ПЭГ-(дистеароилфосфатидил)этаноламин-содержащим липосомам (см., например, Zalipsky (1995) Bioconjug. Chem. 6:705708). Также может использоваться любая форма липидной мембраны, такая как плоская липидная мембрана или клеточная мембрана интактной клетки, например, эритроцит. Липосомальные и содержащие липид составы могут быть доставлены любыми средствами, включая, например, внутривенное, чрескожное (см., например, Vutla (1996) J. Pharm. Sci. 85:5 8), трансмукозальное или пероральное введение.

Фармацевтически приемлемый состав может включать приблизительно от 1% до 99,9% активного ингредиента (например, пептида или пептидомиметика, агент, активирующего Т-клетки, или ингибитора иммунной контрольной точки). Фармацевтические композиции могут стерилизоваться стандартными известными способами стерилизации или могут быть подвергнуты стерилизующей фильтрации.

Дополнительные фармацевтические составы и системы доставки известны в данной области техники и могут быть использованы в способах и композициях по изобретению (см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) 18th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA; The Merck Index (1996) 12th ed., Merck Publishing Group, Whitehouse, NJ; Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms, Technonic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa., (1993); и Poznansky et al., Drug Delivery Systems, R. L. Juliano, ed., Oxford, N.Y. (1980), pp. 253-315).

Фармацевтические составы могут быть упакованы в виде стандартной лекарственной формы для простоты введения и однородности дозировки. ʺСтандартная лекарственная формаʺ в рамках изобретения относится к физически дискретным унитарным дозировкам для введения пациенту, получающему лечение; каждая единица содержит предопределенное количество соединения, оказывающее желаемый эффект, в комбинации с фармацевтическим носителем или эксципиентом.

Далее приведены сокращения, используемые в рамках изобретения:

Cha: циклогексил-аланин

Phe-2,3,4,5,6-F: Фториды в положении 2,3,4,5,6,на фенильном остатке фенилаланина

F: Фторид

Bpa: Бензоил-фенилаланин

Nal(2): 2-нафтил-аланил

Ala(3-Bzt): (3-бензотиенил)-аланин

Nal(1): 1-нафтил-аланил

Dph: Дифенил-аланин

Ala(tBu): трет-бутил-аланил

Cys(tBu): трет-бутил-цистеин

Phe-3,4,5-F: Фториды в положении 3,4,5 на фениле фенилаланина

Phe-4CF3: CF3 в положении 4 на фенильном остатке фенилаланина

Phe-3Br,4Cl,5Br: Бромид в положении 3, хлорид в положении 4 и бромид в положении 5 на фениле фенилаланина

Phe-4Cl: Хлорид в положении 4 на фениле фенилаланина

P1, P2, P3, P4, P5, P6 и т.д., и (P1, P2, P3, P4, P5, P6 и т.д.); и P7, P8, P9, P10, P11, P12 и т.д., и (P7, P8, P9, P10, P11, P12 и т.д.): смежная последовательность P1, P2, P3, P4, P5, P6 и т.д.; и P7, P8, P9, P10, P11, P12, соответственно.

Если не указано иное, все технические и научные термины, использованные здесь, имеют то же значение, как обычно понимается специалистом в области техники, к которой относится это изобретение. Несмотря на то, что способы и материалы, подобные или эквивалентные описанным здесь, могут использоваться в практике или тестировании настоящего изобретения, подходящие способы и материалы описаны здесь.

Все публикации, патенты и другие ссылки, процитированные здесь, полностью включены посредством ссылок. В случае конфликта превалирует настоящее описание, включая определения.

В рамках изобретения формы единственного числа включают формы множественного числа, если контекст ясно не указывает иное. Таким образом, например, ссылка на «соединение» включает множество соединений и ссылки на ʺостатокʺ или «аминокислоту» включает ссылку на один или несколько остатков и аминокислот.

Были описаны многие варианты осуществления изобретения. Тем не менее, будет понято, что различные модификации могут быть сделаны без отступления от духа и объема изобретения. Соответственно, следующие примеры предназначены для того, чтобы проиллюстрировать, но не ограничвать объем изобретения, описанного в формуле изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

В этом примере описаны материалы и несколько способов. В этом примере также описаны последовательности проанализированных пептидов/пептидомиметиков.

Химикаты и реагенты Блеомицин был куплен у Wako Pure Chemical Co. (Осака, Япония) и был растворен в дистиллированной H₂O в концентрации 10 мг/мл. Пропидий йодид (PI) и адриамицин были куплены у Sigma (Сент-Луис, Миссури).

Клеточная культура Клеточную линию, полученную из человеческого Т-клеточного лейкоза, Jurkat, культивировали в RPMI 1640 (Sigma), дополненной 10%-й зародышевой телячьей сывороткой (IBL: Immuno-Biological Laboratories, Gunma, Япония) при 37°C/5% CO₂. Клеточную линию, полученную из человеческого рака поджелудочной железы, MIAPaCa2, культивировали в DMEM с 10%-й зародышевой телячьей сывороткой при 37°C/5% CO₂.

Анализ клеточного цикла Статус клеточного цикла клеток, обработанных блеомицином или адриамицином, анализировали проточной цитометрией, как описано Kawabe (1997) Nature 385:454-458. Вкратце, два миллиона клеток ресуспендировали и инкубировали в 200 мкл раствора Кришена (0,1% цитрата натрия, 50 мкг/мл PI, 20 мкг/мл РНК-азы A и 0,5% NP-40) в течение 1 часа при 4°C и анализировали проточной цитометрией, FACScan™ (Beckton Dickinson, Маунтин-Вью, Калифорния) с программой CELLQuest™ (Beckton Dickinson).

Таблица 1. Последовательности и Соответствующие Кодовые названия примеров пептидов/пептидомиметиков.

(l-Tyr)(l-Gly)(l-Arg)(l-Lys)(l-Lys)(l-Arg)(l-Arg)(l-Gln)(l-Arg)(l-Arg)(l-Arg)(л-Cha)(l-Phe-2,3,4,5,6-F)(l-Arg)(l-Ser)(l-Pro)(l-Ser)(l-Tyr)(l-Tyr)(SEQ ID NO:105) CBP413 (l-Tyr)(l-Gly)(l-Arg)(l-Lys)(l-Lys)(l-Arg)(l-Arg)(l-Gln)(l-Arg)(l-Arg)(l-Arg)(л-Cha)(l-Phe-2,3,4,5,6-F)(l-Arg)(l-Ser)(l-Pro)(l-Ser)(l-Tyr)(SEQ ID NO:106) CBP420 (l-Arg)(l-Arg)(l-Arg)(л-Cha)(l-Phe-2,3,4,5,6-F)(l-Arg)(l-Ser)(l-Pro)(l-Ser)(l-Tyr)(l-Tyr)(SEQ ID NO:107) CBP430 (l-Arg)(l-Arg)(l-Gln)(l-Arg)(l-Arg)(l-Arg)(л-Cha)(l-Phe-2,3,4,5,6-F)(l-Arg)(l-Ser)(l-Pro)(l-Ser)(l-Tyr)(l-Tyr)(SEQ ID NO:108) CBP431 (l-Arg)(l-Arg)(l-Gln)(l-Arg)(l-Arg)(l-Arg)(л-Cha)(l-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Ser)(d-Trp)(l-Pro)(l-Ser)(l-Tyr)(SEQ ID NO:109) CBP432 (l-Tyr)(l-Gly)(l-Arg)(l-Lys)(l-Lys)(l-Arg)(l-Arg)(l-Gln)(l-Arg)(l-Arg)(l-Arg)(л-Cha)(l-Phe-2,3,4,5,6-F)(l-аминоундекановая кислота)(l-Tyr)(l-Tyr)(SEQ ID NO:110) CBP440 (d-Tyr)(d-Tyr)(d-Ser)(l-Gly)(d-Ser)(d-Arg)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(d-Lys)(d-Lys)(d-Arg)(l-Gly)(d-Tyr)(SEQ ID NO:111) CBP450 (d-Tyr)(d-Ser)(d-Pro)(l-Trp)(l-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO:87) CBP451 (d-Tyr)(d-Ser)(l-Pro)(l-Trp)(l-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO:88) CBP452 (d-Tyr)(d-Ser)(d-Pro)(l-Trp)(l-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Pro)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO:112) CBP454 (d-Tyr)(d-Ser)(l-Pro)(l-Trp)(l-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(l-Pro)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO:113) CBP455 (l-Tyr)(l-Tyr)(l-аминоундекановая кислота)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(d-Lys)(d-Lys)(d-Arg)(l-Gly)(d-Tyr)(SEQ ID NO:114) CBP460 (l-Tyr)(l-аминоундекановая кислота)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(d-Lys)(d-Lys)(d-Arg)(l-Gly)(d-Tyr)(SEQ ID NO:115) CBP461 (l-Tyr)(l-аминоундекановая кислота)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(SEQ ID NO:116) CBP462 (l-аминоундекановая кислота)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(d-Lys)(d-Lys)(d-Arg)(l-Gly)(d-Tyr)(SEQ ID NO:117) CBP463 (l-аминоундекановая кислота)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(SEQ ID NO:118) CBP464 (l-аминоундекановая кислота)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO:119) CBP465 (l-8-аминокаприловая кислота)(d-Cha)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO:120) CBP466 (d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(SEQ ID NO:121) CBP470 (d-Cha)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO:122) CBP471 (d-Tyr)(d-Ser)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO:123) CBP481 (d-Tyr)(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO:124) CBP500 (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO:80) CBP501 (d-Bpa)(l-8-аминокаприловая кислота)(d-Cha)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO:125) CBP502 (d-Bpa)(l-8-аминокаприловая кислота)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO:126) CBP503 (d-Asp)(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO:127) CBP504 (d-Bpa)(d-Asp)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO:128) CBP505 (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Asp)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO:129) CBP506 (d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(d-Cha)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Bpa)(SEQ ID NO:93) CBP510 (d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(SEQ ID NO:94) CBP511 (d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Cha)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Bpa)(SEQ ID NO:95) CBP512 (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Bpa)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO:130) CBP601 (d-Bpa)(l-8-аминокаприловая кислота)(d-Bpa)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO:131) CBP602 (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe4No2)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO:89) CBP603 (d-Bpa)(d-Pro)(d-Trp)(d-Pro)(d-Phe4NO2)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO:132) CBP604 (d-Bpa)(d-Pro)(d-Trp)(d-Pro)(d-Phe4NO2)(d-Nal2)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO:133) CBP605 (d-Phe4NO2)(d-Pro)(d-Trp)(d-Pro)(d-Phe4NO2)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO:134) CBP606 (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO:90) CBP607 (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO:91) CBP608 (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Lys)(d-Lys)(d-Lys)(d-Lys)(d-Lys)(d-Lys)(SEQ ID NO:92) CBP609 (d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(SEQ ID NO:96) CBP700 (d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Trp)(d-Arg)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(SEQ ID NO:97) CBP701 (d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Trp)(d-Arg)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(SEQ ID NO:98) CBP702 (d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(SEQ ID NO:99) CBP703 (d-Bpa)(d-Cys)(d-Trp)(d-Arg)(d-Phe-2,3,4,5,6F)(d-Cha)(d-Cys)(SEQ ID NO:135) CBP524 (d-Tyr)(d-Cys)(d-Pro)(d-Trp)(d-Arg)(d-Phe-2,3,4,5,6F)(d-Cha)(d-Cys)(SEQ ID NO:136) CBP721

Пример 2

В этом примере описаны данные, показывающие активность ингибирования G2 различных пептидов и эффект различных пермутаций последовательности на активность, включая эффект уменьшения длины последовательности.

Анализ с использованием проточной цитометрии отмены контрольной точки G2 осуществляли с помощью клеточной линии Jurkat, происходящей от человеческого лейкоза. Вкратце, культивируемые клетки обрабатывали различными дозами пептида/пептидомиметика и 40 мкг/мл блеомицина в течение 24 часов, ДНК клеток окрашивали пропидий йодидом и анализировали проточной цитометрией. Эти результаты представлены в Таблице 2.

Кривая доза-эффект каждого пептида/пептидомиметика, когда он используется против обработанных блеомицином клеток Jurkat, показана на Фигурах 1, 5, 6, 7, 8, 11 и 12; Ось Y показывает %G2/M клеток Jurkat спустя 24 часа после лечения.

Анализ с использованием проточной цитометрии отмены контрольной точки фазы M соединениями осуществляли с помощью клеточной линии Jurkat, происходящей от человеческого Т-клеточного лейкоза, обработанных колхицином (5 мкг/мл или 0,5 мкг/мл) и различными дозами пептида/пептидомиметиков в течение 24 часов (фигура 12). ДНК клеток окрашивали и анализировали проточной цитометрией, как описано выше. Эти результаты также представлены в Таблице 2.

Кривые доза-эффект каждого пептида/пептидомиметика, когда он используется против обработанных колхицином клеток Jurkat, показаны на Фигурах 2 и 14; Ось Y показывает %G2/M клеток Jurkat спустя 24 часа после лечения.

Таблица 2. Дозы соединений, индуцирующих отмену контрольной точки G2 или побочный эффект

Столбец 1: (Кодовое название)

Столбец 2: Появление побочного эффекта при индивидуальном использовании (мкМ)

Столбец 3: Доза, ингибирующая G2 (мкМ)

Столбец 4: Появление побочного эффекта при использовании с Колхицином (мкМ)

Кодовое название (мкМ) (мкМ) (мкМ)

CBP441 > 50 > 50 > 50 CBP462 > 50 > 50 > 50 CBP464 > 50 > 50 > 50 CBP470 > 50 > 50 > 50 CBP430 > 50 50 > 50 CBP481 > 50 > 6,25 > 12,5 CBP431 > 50 > 3,125 > 50 CBP420 > 50 > 1,56 > 50 CBP440 > 12,5 > 1,56 > 3,125 CBP413 > 25 > 1,56 > 25 CBP450 > 6,25 > 0,78 > 6,25 CBP460 > 3,125 > 0,39 > 3,125 CBP461 > 6,25 > 0,39 > 6,25 CBP463 > 6,25 > 0,39 > 6,25 CBP500 > 50 > 0,39 > 12,5 CBP501 > 50 > 0,39 > 25

ʺПоявление побочного эффекта при индивидуальном использованииʺ указывает дозу пептида/пептидомиметика, приводящую к нарушению клеточного цикла в клетках Jurkat, т.е., появление существенного количества клеток SubG1 (мертвые клетки) или клеток, в каждой из которых содержание ДНК варьирует более, чем обычно. Например, клетки G1 обычно показывают острый пик в анализе FACS, но после обработки пик становится более широким и низким, когда клеточный цикл нарушен, что указывает на аномальную прогрессию клеточного цикла или начало гибели клеток. ʺДоза, ингибирующая G2ʺ указывает дозу пептида/пептидомиметика с 40 мкг/мл блеомицина, приводящая к детектируемой активности отмены контрольной точки G2 после обработки в течение 24 часов. ʺПоявление побочного эффекта при использовании с колхициномʺ указывает дозу пептида/пептидомиметика с 5 мкг/мл колхицина, приводящую к нарушению клеточного цикла в клетках Jurkat после обработки в течение 24 часов.

Активность ингибирования контрольной точки G2 CBP501 в комбинации с цисплатином была изучена на различных линиях клеток. Вкратце, цисплатин (3 мкг/мл) и CBP501 (0,4, 2 и 10 мкМ) одновременно добавляли к клеточной культуре, инкубировавшейся в течение 3 часов при 37°C с 5%-м CO₂. Среду аспирировали, добавляли новую среду без этих соединений, и клетки инкубировали в течение еще 45 часов. Клетки, включая плавающие клетки, собирали с использованием раствора трипсин-EDTA, инкубировали с раствором Кришена и анализировали в отношении содержания ДНК проточной цитометрией, как описано ранее. Эти результаты представлены в Таблице 3. Закрашенные ячейки, кроме HUVEC, обозначают клеточные линии, показывающие значительное уменьшение популяции G2 и увеличение популяции subG1, что указывает отмену контрольной точки G2 и сенсибилизацию к цисплатину CBP501. Наблюдение, что клетки HUVEC, которые являются клетками, имеющими нормальную контрольную точку G1, не были сенсибилизированы, по меньшей мере до 50 мкМ CBP501, показывает, что CBP501 является специфическим для контрольной точки G2, а не неспецифическим.

Таблица 3. Дозы CBP501, ингибирующие контрольную точку G2, против различных клеточных линий.

CBP501 происхождение цисплатин HUVEC эндотелий пупочной вены > 50 HT-29 толстая кишка <2 MIAPaCa2 поджелудочная железа 0,4 <<2 SK-OV-3 яичник, hMLH1 50 HCT116 толстая кишка, hMLH1 <2 Panc1 поджелудочная железа > 10 MK45 желудок > 10 SW620 толстая кишка > 10 NCI-H226 легкое, SCC 0,4 SW900 легкое, SCC > 10 NCI-H520 легкое, SCC > 10 DU-145 предстательная железа, MLH1 0,4 MCF 7 молочная железа > 10

Изучали активность ингибирования контрольной точки G2 различных соединений в различных дозах на клеточной линии, происходящей от человеческого рака поджелудочной железы, MIAPaCa2, обработанной блеомицином (Bleo) или адриамицином (ADR). Вкратце, клетки инкубировали с соединениями и блеомицином (10 мкг/мл) или адриамицином (1 мкг/мл) в течение 3 часов. Среду заменяли и инкубировали в течение еще 21 часа. Полученные клетки окрашивали для визуализации ДНК пропидий йодидом и панализировали проточной цитометрией, как описано ранее. % популяции sub-G1 клеток обозначен как мертвые клетки на Фигуре 3. Результаты показывают, что CBP501 сенсибилизирует клетки MIAPaCa2 и к блеомицину, и к адриамицину дозозависимым образом.

Фигура 4A и 4C показывает активность ингибирования контрольной точки G2 с парами пептидов, в которых один остаток аминокислоты отличается от другого. Активность ингибирования контрольной точки G2 этих пептидов была проанализирована с помощью обработанных блеомицином клеток Jurkat, как описано выше. Фигура 4B показывает активность ингибирования контрольной точки M и/или анализ неспецифической токсичности с парами пептидов, в которых один остаток аминокислоты отличается от другого. Активность ингибирования контрольной точки M и/или неспецифическую токсичность этих пептидов анализировали с помощью обработанных колхицином клеток Jurkat, как описано выше.

Изучали активность ингибирования контрольной точки G2 различных богатых аргинином последовательностей в различных дозах на клетках, обработанных блеомицином. Вкратце, пептиды добавляли к среде клеток Jurkat с блеомицином (40 мкг/мл) в количестве 0,2 мкг/мл, 0,39 мкг/мл, 0,78 мкг/мл, 1,56 мкг/мл, 3,125 мкг/мл, 6,25 мкг/мл, 12,5 мкг/мл, 25 мкг/мли 50 мкг/мл. Клетки собирали через 24 часа, окрашивали раствором Кришена и анализировали проточной цитометрией, как описано ранее. %G2/M клеток (Ось Y) выстраивали против доз пептида (Ось X) на Фигуре 5. Данные показывают, что богатая основными остатками последовательность ʺ(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg) (SEQ ID NO:137)ʺ является лучшей последовательностью по сравнению с последовательностями, имеющими меньшие или большие числа остатков.

Изучали активность ингибирования контрольной точки G2 пептидов без (D-Bpa) в различных дозах на клетках, обработанных блеомицином. Вкратце, пептиды добавляли к среде клеток Jurkat с блеомицином (40 мкг/мл) в количестве 0,2 мкг/мл, 0,39 мкг/мл, 0,78 мкг/мл, 1,56 мкг/мл, 3,125 мкг/мл, 6,25 мкг/мл, 12,5 мкг/мл, 25 мкг/мли 50 мкг/мл. Клетки собирали и анализировали проточной цитометрией, как описано ранее. %G2/M клеток (Ось Y) выстраивали против доз пептида (Ось X) на Фигуре 6. Этот результат показывает, что последовательность (Tyr)(Сер)(Про)(Trp)(Сер)(Phe-2,3,4,5,6F)(Cha) (SEQ ID NO:138) имеет активность ингибирования контрольной точки G2, сопоставимую с таковой последовательности (Bpa)(Сер)(Trp)(Сер)(Phe-2,3,4,5,6F)(Cha) (SEQ ID NO:139).

Изучали активность ингибирования контрольной точки G2 богатых аргинином и богатых лизином последовательностей в различных дозах на клетках, обработанных блеомицином. Вкратце, пептиды добавляли к среде клеток Jurkat с блеомицином (40 мкг/мл) в обозначенной дозе (Ось X). Клетки затем собирали и анализировали проточной цитометрией, как описано ранее. %G2/M клеток (Ось Y) выстраивали против доз пептида на Фигуре 7. Результаты показывают, что последовательности Arg, по-видимому, обеспечивают лучшую активность, чем последовательности Lys для богатой основными аминокислотами последовательности и что Gln не важен для функции последовательности.

Изучали активность ингибирования контрольной точки G2 последовательностей, в которых местоположение богатой аргинином области варьировало. Вкратце, пептиды добавляли к среде клеток Jurkat с блеомицином (40 мкг/мл) в обозначенной дозе (Ось X) в течение 24 часов. Клетки затем собирали и анализировали проточной цитометрией, как описано ранее. %G2/M клеток (Ось Y) выстраивали против доз пептида на Фигуре 8.

Данные показывают, что активность ингибирования G2 пептидов не значительно изменялась при изменении местоположения богатой аргинином области. Кроме того, CBP501 был растворим в воде, тогда как CBP511 не был растворим. Это различие может быть выгодным для определенных систем доставки лекарственных средств, так как для некоторых систем предпочитают водонерастворимые соединения.

Фигура 9 иллюстрирует данные анализа, выполняемого с различными парами пептидов, в которых только один остаток аминокислоты различался между парами. Активность ингибирования контрольной точки G2 этих пептидов анализировали с помощью клеток Jurkat, обработанных блеомицином, как описано.

Размер, заряд и гидрофобность каждой аминокислоты определяют, насколько эффективно последовательность вписывается в целевую молекулу. Боковая цепь пептида или пептидомиметика двигается свободно, поэтому даже с одной или двумя неблагоприятными боковыми цепями пептид или пептидомиметик могли соответствовать карману или борозде молекулы-мишени. Резюме показывает, что существуют предпочтительные размеры для каждой боковой цепи, предполагающие размер связывающей области (карман или борозда) белка-мишени для каждой боковой цепи. Например, боковые цепи с кольцевой структурой, такой как бензол, индол и циклогексан, определяют силу отмены G2 или отмены M и/или неспецифической токсичности; см. Фигуры 9 и 4, где кольцевые структуры больше 5-членных оказывают влияние на активность ингибирования G2 (умеренный размер в P1 и P2 увеличивает активность ингибирования G2, тогда как слишком большие структуры (P1, P5 и P6) увеличивают отмену M и/или неспецифическую токсичность.

Боковые цепи без кольцевой структуры кажутся нейтральными. Таким образом, для достижения лучшей активности кольцевая структура надлежащего размера в P1, P2, P4 и P6 и либо отсутствие кольцевой структуры в P3 и P5, либо кольцевая структура меньше чем 6-членная являются нежелательными. Бодходящее кольцо для P1, P2 и P6 является одно - 6-членным колецом через конденсацию двух колец с 5- или 6-членным. Для P4 кольцо надлежащее размера является конденсацией двух колец, каждое из которых является 5- или 6-членным. Таким образом, для P1, Cha или Nal(2) представляются наилучшим выбором; для P2 Phe-2,3,4,5,6F, Phe-3,4,5F или Phe-CF3 кажутся лучшими. Эти размеры боковой цепи показывают, что существует либо два кармана, либо единственный больший карман в молекуле-мишени, где эта область взаимодействует. Для P3 и P5, приемлема маленькая боковая цепь, такая как Ser или Pro, и большая боковая цепь, такая как Arg, также приемлема, что показывает, что нет никакого кармана в этой области молекулы-мишени, таким образом, боковые цепи могут просто располагаться напротив мишени. Однако возможно, что кольцевая структура могла бы позволить пептиду или пептидомиметику взаимодействовать с другой молекулой (т.е., отличной от молекулы-мишени), что, в свою очередь, может увеличить побочный эффект. Для P6 Bpa или Ser-Tyr кажутся лучшим вариантом, чем один только Tyr или меньшая боковая цепь, что указывает на более глубокую борозду, которая располагается горизонтально в мишени. Также может быть мелкий и более широкий карман для P4 в мишени на основе размеров остатков для P4.

Следующие пептиды анализировали с использованием Jurkat и блеомицина, как описано. Последовательности пептидов являются следующими: CBP501, (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg) (SEQ ID NO:80); CBP700, (d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (SEQ ID NO:96); CBP701, (d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Trp)(d-Arg)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (SEQ ID NO:97); CBP702, (d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Trp)(d-Arg)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (SEQ ID NO:98); и CBP703, (d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (SEQ ID NO:99). Результаты показывают, что CBP700, 701, 702, 703, несмотря на то, что они короче, чем другие иллюстрируемые пептиды, сохраняют активность ингибирования контрольной точки G2, сопоставимую с другими пептидами, имеющими значительную ингибирующую контрольную точку G2 активность (фигура 11).

Проводили сравнение между активностью ингибирования контрольной точки G2 и неспецифической токсичностью (отмена контрольной точки М) CB501. Вкратце, клетки Jurkat обрабатывали 40 мкг/млблеомицина или 0,5 мкг/млколхицина для активности ингибирования контрольной точки G2 и неспецифической токсичности, соответственно. Количество ДНК в каждой из обработанных клеток анализировали проточной цитометрией, как описано ранее. Данные показывают, что контрольная точка G2 была ингибирована дозозависимым образом для CBP501, в то время как неспецифическая токсичность отсутствовала до 50 мкМ пептида, как было определено на основе неизменного процента клеток, остановившихся в M фазе (Фигура 12).

Пример 3

В этом примере описаны активность ингибирования киназы пептида/пептидомиметика и анализ стабильности различных пептидов в сыворотке.

Так как две киназы, Chk1 и Chk2, важны для механизма контрольной точки G2, проводили анализ ингибирования киназы обоих ферментов. Анализ ингибирования киназы in vitro осуществляли, используя ʺPepTag^(R) Non-Radioactive Protein Kinase Assaysʺ, Promega, согласно протоколу компании, кроме того, что очищенную киназу CHK2 использовали вместо PKC. Очищенную PKC приобретали у Upstate Biotechnology, Inc. Эти результаты показаны в Таблице 4A.

Таблица 4A Анализ ингибирования киназы соединениями

IC50 в мкМ PKA CHK2 CBP450 > 400 10 CBP440 180 8

Анализ ингибирования киназы in vitro был осуществлен CycLex, Co. Ltd., Нагано, Япония. Вкратце, полученную из бакуловируса рекомбинантную человеческую полноразмерную Chk1 с гистидиновой меткой или полученную из E.Coli рекомбинантную человеческую полноразмерную Chk2, слитую с GST, использовали в качестве киназ. Полученный из E.Coli рекомбинантный GST-Cdc25C (аминокислоты 167-267) использовали в качестве субстрата. Условиями реакции были 20 мМ Hepes-KOH (pH 7,5), 1 мМ DTT, 80 мкг/мл BSA, 10 мМ MgCl₂ и 50 мМ АТФ при 30°C в течение 60 минут. Фосфорилирование серина 216 на GST-Cdc25C детектировали анти-Cdc25C-фосфорилированным антителом S216 с помощью иммуноферментного анализа. Эти результаты показаны в Таблице 4B.

Таблица 4B Анализ ингибирования киназы пептидами.

CHK1 CHK2 CBP500 5,6 8 CBP501 7,9 18,6 CBP505 63,4 > 100 CBP506 37,6 67 CBP603 15,5 18,1

Данные показывают, что ингибирование киназы Chk1 и Chk2 происходит в дозе выше, чем доза ингибирования G2 (IC50 для ингибирования G2 CBP500, 501, 505, 506, 603 меньше чем 1 мкМ). Эти результаты позволяют предположить, что эти пептиды имеют механизм действия помимо ингибирования молекул Chk1/2. Также эти пептиды возможно аккумулируются в клетках таким образом, что их концентрация оказывается больше в клетках, чем в окружающей среде.

Анализ сыворотки проводили для определения стабильности пептидов в сыворотке мыши и человека. Вкратце, пептиды (10 мМ или 2,5 мМ) инкубировали со свежеподготовленной человеческой сывороткой при 37 градусах в течение 1 часа. CBP501 (10 мм) инкубировали со свежеподготовленной сывороткой мыши в течение 1 часа при 37 градусах. Клетки Jurkat обрабатывали с сывороткой с пептидами или без и блеомицином (40 мкг/мл) и инкубировали в течение 24 часов. Популяцию клеток в фазе G2 определяли проточной цитометрией, как описано ранее. Остаточную активность ингибирования контрольной точки G2 обработанных сывороткой пептидов определяли путем сравнения %G2 клеток обработанной сыворотки, и стандартную кривую получали с обработанными средой пептидами, блеомицином и клетками Jurkat (Таблица 5A). Остаточное количество CBP501 определяли с использованием ВЭЖХ после депротеинирования путем обработки этанолом (Таблица 5B). Данные показывают, что пептид с аминокислотами d-типа, такой как CBP501 и CBP603, более стабилен в сыворотке, чем пептид с аминокислотой l-типа, такой как CBP413.

Таблица 5A Анализ обработки сыворотки человека

Остаточная активность пептида после обработки сыворотки человека в течение 1 часа CBP413 <0,4% первоначальной CBP501 > 50% первоначальной CBP603 > 50% первоначальной

Таблица 5В Анализ обработки сыворотки мыши

Остаточный пептид после обработки сыворотки человека в течение 1 часа CBP501 > 90%

Пример 4

В этом примере описана антипролиферативная активность CBP501 на культивируемых клетках. В этом примере также описаны данные, демонстрирующие активность пептидов/пептидомиметиков in vivo.

Для демонстрации антипролиферативной активности соединений, культивируемые человеческие клетки рака поджелудочной железы MIAPaCa2 обрабатывали CBP501 (10 мкМ), цисплатином (1, 3 или 9 мкг/мл) и оксалиплатином (1, 3 или 9 мкг/мл), индивидуально и в комбинации. Вкратце, клетки высевали в плотности 300 клеток/лунка в 6-луночные планшеты, инкубировали в течение ночи и обрабатывали соединениями в течение трех часов. Среду заменяли и культивировали в течение еще 10 дней. Клетки затем фиксировали 70%-м метанолом, окрашивали 0,1% кристаллическим фиолетовым и визуализировали. Аналитические результаты формирования колонии показали, что CBP501 улучшал цитотоксическую активность как цисплатина, так и оксалиплатина против клеток MIAPaCa2.

Подобные исследования проводили с использованием нормальных человеческих клеток эндотелия пупочной вены (HUVEC). Так как нормальные клетки не формируют колонии, их высевали в плотности 3000 клеток/лунка вместо 300 клеток/лунка. Результаты показывают, что пептид отдельно не нарушает рост нормальных клеток и не увеличивает цитотоксическую активность цисплатина и оксалиплатина в отношении этих клеток. Пептиды поэтому, видимо, не показывают значительную активность ингибирования G2 против нормальных клеток, подвергнутых лечению, разрушающему нуклеиновую кислоту, в отличие от гиперпролиферирующих клеток, таких как раковые клетки, сенсибилизированные к лечению, разрушающему нуклеиновую кислоту. Результаты показывают специфичность пептида в сенсибилизации пролиферирующих клеток, но не нормальных клеток, к лечению, разрушающему нуклеиновую кислоту.

Таблица 6 Анализ ингибирования роста MIAPaCa2 с использованием аламарового синего.

IC50 24 часов 48 часов 72 часов цисплатин 16 мкМ 31 мкМ 46 мкМ CBP501 6 мкМ 10 мкМ 13 мкМ CBP501 с 10 мкМ цисплатина 0,6 мкМ 1 мкМ 6 мкМ

Анализ AlamarBlue осуществляли для анализа ингибирования активности в отношении роста CBP501 с и без цисплатина. Вкратце, клетки MIAPaCa2 экспонировали 1, 3, 10, 30, 100 мкМ цисплатина или 0,22, 0,67, 2, 6 и 18 мкМ CBP501 с или без 10 мкМ цисплатина в течение трех часов в 96-луночных планшетах в плотности 2500 клеток/лунка в двойном экземпляре. Среду заменяли и инкубировали еще 24, 48 или 72 часа. После инкубации 20 мкл 90%-го аламарового синего добавляли к каждой лунке в течение еще 6 часов для обнаружения жизнеспособности клетки с использованием интенсивности флуоресценции. Интенсивность флуоресценции измеряли с помощью спектрофотометра для считывания планшетов Spectrafluor Plus с возбуждением при 530 нм и эмиссией при 590 нм. Вычисляли IC50 (Таблица 6).

Это исследование показывает, что один CBP501 ингибирует рост клеток лучше, чем цисплатин в молярной дозе. CBP501 подавлял рост клеток в намного более низкой дозе в комбинации с 10 мкМ цисплатина, что составляет приблизительно дозу цисплатина, используемую для лечения рака. Кроме того, активность подавления роста CBP501 была более длительной, чем у цисплатина; IC50 в 72 часа был намного лучше, когда использовался CBP501, чем цисплатин.

Период полужизни CBP501 in vivo определяли путем определения количества CBP501 в сыворотке мыши через 1, 3 и 6 часов после внутрибрюшинной инъекции CBP501 (40 мг/кг). Остаточное интактное количество CBP501 определяли с помощью ВЭЖХ после депротеинирования сыворотки мыши, собранной из мышей, получавших лечение этанолом (Таблица 7).

Таблица 7 Период полужизни in vivo CBP501

Период полужизни после внутрибрюшинной инъекции 40 мг/кг CBP501 3 часа

Для определения толерантности к пептидам группе из десяти мышей внутривенно вводили один раз CBP501 (5, 8 или 10 мг/кг) или внутрибрюшинно вводили один раз CBP501 (50, 80 или 100 мг/кг). После введения мышей наблюдали в течение недели в отношении выживания (Таблица 8).

Таблица 8 Максимальная переносимая доза у мышей при единственной инъекции

MTD (iv) MTD (IP) CBP413 14 мг/кг 146,7 мг/кг CBP501 10 мг/кг 98,8 мг/кг

Для изучения эффективности соединений in vivo клетки рака поджелудочной железы человека, MIAPaCa2, внедряли подкожно мышам scid. Лечение инициировали, когда размер первичной опухоли достигал 0,1 см³ (День0) или больше, например, 7 или 8 мм в диаметре. CDDP (3 мг/кг) и CBP 501 (10 или 40 мг/кг) вводили внутрибрюшинно индивидуально или в комбинации. Размеры опухоли измеряли с помощью кронциркуля три раза в неделю, и объемы вычисляли с помощью формулы: масса (мг)=[ширина (мм) 2 x длина (мм)]/2. Средние размеры опухоли для каждой группы выстраивали (n=4) против дней после начала лечения (Фигура 10).

Результаты показывают, что лечение одним только CBP501 подавляет рост человеческой клетки рака поджелудочной железы in vivo. Результаты далее показывают, что CBP501 увеличивает противоопухолевую активность цисплатина.

Пример 5

Этот пример включает описание рака легких и исследований с использованием CBP501.

Рак легких является главной причиной смертельных случаев от рака у взрослых в странах Запада. В США 219440 новых случаев были диагностированы в 2009, и 159390 смертельных случаев произошли вследствие этого заболевания, составляя приблизительно 29% всех случаев смертей от рака (см., например, American cancer society, Cancer Facts & Figures 2009). Восемьдесят семь процентов (87%) всех новых случаев рака легких являются гистологиями немелкоклеточного рака легких (NSCLC), из которых существует три главных типа: аденокарцинома, плоскоклеточный (эпидермоидный) рак и крупноклеточный рак (American cancer society, Cancer Facts & Figures 2009). Несмотря на улучшения хирургических методов и комбинированных терапий, прогноз для пациентов, у которых диагностирован NSCLC, остается плохим. Пятилетняя выживаемость составляет 47% для случаев, обнаруженных на ранней стадии, когда заболевание все еще локализовано, но у большинства пациентов NSCLC (68%) (см., например, AJCC Cancer Staging Manual. In: Fleming ID, editor. Philadelphia: Lippincott-Raven; 2002) диагностируют запущенное заболевание (стадия III) или метастатическое заболевание (стадия IV), требующее химиотерапии. 5-летняя выживаемость составляет 8,4% для пациентов с заболеванием на стадии III и 1,6% для стадии IV, причем большинство пациентов с продвинутым NSCLC умирает от заболевания в течение 2 лет (см., например, American cancer society, Cancer Facts & Figures 2009; AJCC Cancer Staging Manual. In: Fleming ID, editor. Philadelphia: Lippincott-Raven; 2002). Введение новой терапии, которая может привести к существенному улучшению в отношении выживания и качества жизни пациента, является невосполненной потребностью.

Пациенты с поздней стадией (IIIb или IV) NSCLC, имеющие хороший статус функционального состояния, могут получить пользу от химиотерапии (см., например, Souquet, PJ., et al., Lancet 342:19-21, 1993 ; Marino, P., et al., Chest 106:861-865, 1994 ; Marino, P., et al., Cancer 76:593-601, 1995 ; Helsing, M., et al., Eur J Cancer 34:1036-1044, 1998; Cullen, MH., et al., J Clin Oncol 17:3188-3194, 1999; Pfister, DG., et al., J Clin Oncol 22:330-353, 2004). Было показано, что двухкомпонентная химиотерапия улучшает выживание по сравнении с единственным агентом или отсутствием химиотерапии (см., например, Bunn, PA., et al., J Clin Oncol 20:23S-33S, 2002). В настоящее время рекомендуемые режимы химиотерапии первой линии в продвинутом NSCLC включают платиновые соединения (цисплатин [CDDP] или карбоплатин) в комбинации с гемцитабином, винорелбином или таксанами (паклитаксел или доцетаксел), иринотеканом, этопозидом, винбластином и/или пеметрекседом в качестве референсных режимов (Pfister, DG., et al., J Clin Oncol 22:330-353, 2004).

Рандомизированные исследования показали, что различные комбинации с платиновыми соединениями все имеют схожую эффективность, несмотря на то, что режимы немного отличаются с точки зрения токсичности, удобства и стоимости. Результаты показывают суммарную эффективность терапии (ORRs) от 17% до 32%, средние времена выживания от 7 до 10 месяцев и 1-летнюю выживаемость 30-45% (см., например, Scagliotti, G., et al., Semin Oncol 32:S5-S8, 2005; Schiller, JH., et al., N Engl J Med 346:92-98, 2002; Scagliotti, G., et al., J Clin Oncol 20:4285-4291, 2002; Kelly, K., et al., J Clin Oncol 19:3210-3218, 2001; Fossella, F., et al., J Clin Oncol 21:3016-3024, 2003).

Большинство случаев трехкомпонентной химиотерапии до сих пор не приводило к дальнейшему увеличению выживания, но вместо этого увеличивалась токсичность. Недавнее исследование карбоплатина+паклитаксела+бевацизумаба, однако, действительно показало некоторое преимущество в выживании (см., например, Sandler, A., et al., N Engl J Med 355:2542-2550, 2006), что позволяет предположить, что добавление нацеливаемого агента с ненакладывающейся токсичностью может улучшить результат двухкомпонентной химиотерапии. Активные попытки оптимизировать преимущество химиотерапии проводятся с использованием молекулярных маркеров, предиктивных в отношении противоопухолевой активности. Начинают появляться гены, предиктивные в отношении химиотерапевтической эффективности при NSCLC (см., например, Bepler, G., et al., ASCO Educational Book:350-352, 2008; Sommers, K., et al., Proc Am Soc Clin Oncol 26 2008). Примечательны среди них такие маркеры как ERCC1, BRCA1/2, RRM1 и TS (Таблица 9).

Таблица 9. Молекулярные маркеры, предиктивные в отношении химиотерапевтической эффективности при NSCLC

Маркер Экспрессия Чувствительность Резистентность ERCC1 ↑ Платиновые вещества ↓ Платиновые вещества BRCA1/2 ↓ Платиновые вещества Таксан RRM1 ↑ Гемцитабин ↓ Гемцитабин TS ↑ Пеметрексед или 5-FU ↓ Пеметрексед или 5-FU

Пример 6

Этот пример включает описание данных, показывающих, что некоторые субпопуляции пациентов благоприятно отвечают на комбинации пептидов и химиотерапевтических (повреждающих нуклеиновую кислоту) агенты. Неожиданно эти данные показывают, что подгруппа популяции пациентов клинического исследования неплоскоклеточного немелкоклеточного рака легких NSCLC), имеющая менее 10000 лейкоцитов (WBC) на кубический миллиметр крови перед лечением с CBP501, получила пользу от введения CBP501.

CBP501 является синтетическим додекапептидным продуктом, который состоит полностью из D-аминокислот (Фигура 13). Он представляет собой развитие версии TAT-S216A, оптимизированное в отношении активности ослабления аккумуляции G2 (4N) клеток в ответ на лечение повреждающими ДНК агентами в основанном на проточной цитометрии тесте содержания ДНК.

Два исследования фазы I - подбора дозы и фармакокинетическое исследование - были проведены для исследования CBP501 на в общей сложности 78 пациентах: исследование монотерапии CBP501, вводимого как 60-минутная внутривенная инфузия в дни 1, 8 и 15, повторяемая каждые 4 недели, и исследование комбинированной терапии с цисплатином с введением один раз в 3 недели (см., например, Shapiro, GI., et al., Clin Cancer Res. May 15;17(10):3431-42, 2011).

Исследование Фазы I единственного агента (CBP04-01): Это было первым проведенным на человеке испытанием подъема дозы фазы I единственного агента, в котором исследовали режим трех инъекций (дни 1-8-15) каждые 28 дней, в популяции пациентов с прогрессирующими солидными опухолями. В общей сложности были проведены 68 циклов, среднее число циклов на пациента составило 2 года (диапазон 1-8). Два пациента достигли 7 циклов лечения со стабильным заболеванием, один с диагнозом рака поджелудочной железы и другой с раком яичника. Большинство пациентов (87%) прекратило исследование вследствие прогрессии заболевания. Ни один пациент не прекратил участие вследствие токсичности (см., например, Shapiro, GI., et al., Clin Cancer Res. May 15;17(10):3431-42, 2011).

Исследование Фазы I CBP501 в комбинации с цисплатином (CBP06-01): главная цель этого исследования фазы I состояла в том, чтобы определить MTD и RD CBP501 и цисплатина при введении в комбинации один раз в 21 день. CBP501 вводили сначала как 1-часовую инфузию с последующим введением цисплатина через два часа после начала лечения. Пациенты также получали профилактическое лечение для аллергических реакций согласно тому же режиму, который использовали для исследования фазы I единственного агента (лоратадин, дексаметазон, ранитидин и дифенилгидрамин).

В общей сложности 48 пациентов получали лечение в трех центрах США, и в общей сложности были проведены 182 цикла, среднее число циклов на пациента составило 4 года (диапазон 1-13). CBP501 исследовали в диапазоне доз от 3,6 мг/м² до 36,4 мг/м². Самый высокий изученный уровень дозы составлял 36,4 мг/м² CBP501 и 75 мг/м² цисплатина. На этом уровне доз два из шести пациентов испытывали аллергические реакции, оцененные исследователями как ограничивающие дозу (степень 3). MTD рассматривали как уровень дозы непосредственно ниже, который составлял 24,3 мг/м² CBP501 и 75 мг/м² цисплатина. Следы активности были задокументированы у нескольких пациентов (см., например, Shapiro, GI., et al., Clin Cancer Res. May 15;17(10):3431-42, 2011).

Цисплатин (цис-диаминодихлорплатина), неорганический платиновый координационный комплекс, реагирует избирательно в положении N7 остатков гуанина и аденина в ДНК с формированием множества монофункциональных и бифункциональных аддуктов. Эти аддукты способствуют цитотоксичности лекарственного средства путем воспрепятствования различным клеточным процессам, требующим разделения обеих нитей ДНК, таким как репликация и транскрипция.

Цисплатин оценивали клинически против множества опухолей из-за его сильной противоопухолевой активности в отношении тестикулярного рака и рака яичника. Начиная с его апробации, цисплатин был критически важным химиотерапевтическим агентом и широко использовался, индивидуально или в комбинации с другими антибластомными средствами. Цисплатин, как также известно, оказывает существенный паллиативный эффект у пациентов, предоставляющих другие типы опухоли, например, рак легких, рак мочевого пузыря и рак головы и шеи, и он включен в большинство режимов химиотерапии, используемых при этих заболеваниях.

Пеметрексед динатрий является структурно новым антифолатом, имеющим уникальное 6-5 конденсированное пирроло[2,3-е]пиримидиновое ядро и который ингибирует функцию фолатзависимых ферментов, участвующих в е субстратов, необходимых для роста и деления клеток, таких как тимидилат синтаза, дигидрофолат редуктаза и глицинамид рибонуклеотид формилтрансфераза (см., например, Taylor, EC., et al., J Med Chem 35:4450-4454, 1992; Schultz, RM., et al., Anticancer Res 19:437-443, 1999).

Пеметрексед продемонстрировал активность в клинических испытаниях на большом разнообразии типов опухоли, включая опухоли легкого, молочной железы, толстой кишки, плевры, поджелудочной железы, желудка, мочевого пузыря, головы и шеи и шейки матки. Пеметрексед в комбинации с цисплатином был апробирован FDA 4 февраля 2004 для лечения пациентов с MPM, заболеванием, которое либо неоперабельно, либо по иной причине не является кандидатом на лечебную хирургию.

В исследованиях фазы II на наивных в отношении химиотерапии пациентах с NSCLC пеметрексед в комбинации с цисплатином или карбоплатином показал результаты по эффективности, сопоставимые с другими платиновыми компонентами двухкомпонентной терапии (см., например, Scagliotti, G., et al., Clin Cancer Res 11:690-696, 2005 ; Zinner R., et al., Cancer 104:2449-2456, 2005 ; Manegold, C., et al., Ann Oncol 11:435-440, 2000; Shepherd, FA., et al., Cancer 92:595-600, 2001). Кроме того, пеметрексед имеет превосходный профиль безопасности и удобный график введения.

В недавнем рандомизированном исследовании фазы III сравнивали, в исследовании не меньшей эффективности, полное выживание (OS) между 1725 наивными в отношении химиотерапии пациентами со стадией III или IV с NSCLC, получавшими лечение цисплатином плюс гемцитабин или цисплатином плюс пеметрексед каждые 3 недели максимум для шести циклов (см., например, Scagliotti, G., et al., J Clin Oncol 26:3543-3551, 2008 ; Pimentel, F., et al., Proc Am Soc Clin Oncol 26 (Part I of II):448s, 2008, (Suppl. 15S)(abstr) #448s). OS для цисплатина плюс пеметрексед не было меньшим по сравнению с цисплатином плюс гемцитабин (среднее выживание 10,3 месяца для обоих лечений). OS было статистически выше для цисплатина плюс пеметрексед по сравнению с цисплатин/гемцитабин у пациентов с аденокарциномой (n=847; 12,6 месяца и 10,9 месяца, соответственно) и раком крупноклеточной гистологии (n=153; 10,4 месяца и 6,7 месяца, соответственно). Для цисплатина плюс пеметрексед, частота наблюдения степени 3 или 4 нейтропении, анемии и тромбоцитопении; фебрильной нейтропении; и алопеции была значительно ниже, чем для группы лечения цисплатин/гемцитабин, тогда как степень 3 или 4 тошноты была более распространена.

ПАЦИЕНТЫ И СПОСОБЫ:

Дизайн клинического исследования: Открытое многофокусное рандомизированное сравнительное исследование фазы II. В этом протоколе оценивали полную дозу цисплатина и пеметрекседа с CBP501 или без него. Пациенты были рандомизированы в отношении 1:1 на группы пеметрекседа, цисплатина и CBP501 (Группа A) или пеметрекседа и цисплатина (Группа B). Рандомизация была стратифицирована согласно начальной стадии заболевания (IIIb по сравнению с IV), наличию метастазов в мозге и возможности пациентов проходить терапию бевацизумабом.

Исследователь/место проведения испытания: Приблизительно 40 центров в США, России, Канаде, Бразилии, Аргентине и Перу.

Цели исследования:

Основная: Сравнения эффективности, выживания без прогрессии для цисплатина и пеметрекседа с CBP501 или без него у пациентов с локально продвинутым (стадия IIIB со злокачественным плевральным выпотом или выпотом в полость перикарда) или метастатическим (стадия IV) неплоскоклеточным NSCLC.

Вторичная: Характеристика профиля безопасности режима исследования и параметров эффективности помимо выживания без прогрессии, таких как общая выживаемость.

Популяция исследования:

Критерии включения:

1. Подписанное информированное согласие получено до инициации любых конкретных процедур исследования.

2. Гистологически или цитологически подтвержденный диагноз неплоскоклеточного немелкоклеточного рака легких (NSCLC), не подлежащего радикальной резекции, стадии IIIB с плевральным выпотом или выпотом в полость перикарда или стадии IV, ранее не получали химиотерапию или другое системное лечение.

3. По меньшей мере одно одномерно измеримое поражение согласно Критериям оценки реакции при солидных опухолях (RECIST).

4. Пациенты мужского или женского пола в возрасте по меньшей мере 18 лет.

5. Функциональный статус (PS) ECOG: 0-1.

6. Ожидаемая продолжительность жизни > 3 месяца.

7. Предшествующая местная лучевая терапия допускается, если она была закончена за ≥ 3 недели до первой дозы лечения в исследовании.

8. Допускается сопутствующая паллиативная лучевая терапия существующего поражения кости для борьбы с болью.

9. Допускается предшествующая хирургия, если она выполняется за по меньшей мере 4 недели до первой дозы лечения в исследовании, и пациент должен полностью восстановиться.

10. Адекватная функция органа, включая следующее:

Костный мозг: количество лейкоцитов (WBC) ≥ 4×10⁹/л, абсолютное количество нейтрофилов (ANC) ≥ 1,5×10⁹/л, количество тромбоцитов ≥ 100×10⁹/л, гемоглобин ≥ 9 г/дл

Печень: Билирубин ≤ 1,5 x верхняя граница нормы (ULN), аспартат трансаминазы (AST/SGOT) и аланин трансаминазы (ALT/SGPT) ≤ 2,5 x ULN (или ≤ 5 x ULN, если присутствуют метастазы в печени), INR ≤ 1,5 x ULN, белок ≤ 3,0 г/дл.

Почки: Креатинин сыворотки ≤ 1,5 мг/дл или клиренс креатинина ≥ 45 мл/мин. (вычисленный согласно формуле Кокрофта и Голта).

11. У пациенток с детородным потенциалом должен быть отрицательный тест на беременность, и они должны использовать по меньшей мере одну форму контрацепции, одобренную Исследователем, в течение 4 недель до исследования и спустя 4 месяца после последней дозы лекарственного средства в исследовании. В целях этого исследования детородный потенциал определяется как: ʺВсе пациентки, если они не находятся в периоде после менопаузы в течение по меньшей мере одного года или не являются хирургически стерильнымиʺ.

12. Пациенты мужского пола должны использовать форму барьерной контрацепции, одобренную Исследователем, во время исследования и в течение 4 месяцев после последней дозы лекарственного средства в исследовании.

13. Способность к сотрудничеству при лечении и наблюдении.

Критерии исключения:

1. Радиотерапия более 30% костного мозга до вхождения в исследование.

2. Наличие нейроэндокринных признаков в образце опухоли.

3. Предыдущее лечение химиотерапией, новые биологические методы лечения (малые молекулы, антитела), иммунотерапия.

4. Отсутствие измеримых поражений.

5. Продолжающаяся или активная инфекция, симптоматическая застойная сердечная недостаточность, нестабильная стенокардия, симптоматическая или плохо контролируемая аритмия сердца, неконтролируемое тромботическое или геморрагическое нарушение или любые другие серьезные неконтролируемые заболевания по мнению Исследователя.

6. Наличие в анамнезе любого другого злокачественного образования в течение 5 лет до начала исследования (кроме вылеченного базально-клеточного рака кожи или вылеченного in-situ рака шейки матки).

7. Наличие любого значительного расстройства(расстройств) центральной нервной системы (ЦНС) или психического расстройства(расстройств), которое препятствовало бы комплаенсу пациента.

8. Признаки периферической нейропатии > степени 1 согласно Версии 3 NCI-CTCAE.

9. Лечение любым другим исследуемым агентом или участие в другом клиническом испытании в течение 28 дней до начала исследования.

10. Беременные или кормящие пациенты или любой пациент с детородным потенциалом, не использующий соответствующей контрацепции.

11. Известная инфекция HIV, HBV, HCV.

12. Наличие симптоматических метастазов в мозге. Пациенты с метастазами в мозге должны:

Иметь стабильный неврологический статус после местной терапии (хирургия или облучение) в течение по меньшей мере 2 недель после завершения радикальных методов лечения, и прекратить использование кортикостероидов в течение 1 недели до начала исследования.

Не иметь неврологической дисфункции, которая затрудняла бы неврологическую оценку и другие AEs.

13. Неспособность или нежелание принимать фолиевую кислоту, витамин B12 или кортикостероиды.

14. Неспособность прервать прием аспирина или других нестероидных противовоспалительных средств, кроме дозы аспирина ≤ 1,3 грамма в сутки, в течение 5-дневного периода (8-дневный период для веществ длительного действия, таких как пироксикам).

15. Значительное снижение массы тела (≥ 10% массы тела во время предшествующих 6 недель).

16. Наличие клинически значимого (на основе физического осмотра) скопления интерстициальной жидкости, например, асцит или плевральные выпоты, которое не может быть удалено дренажем или другими процедурами до начала исследования.

Число пациентов:

В общей сложности получали лечение 195 пациентов, из которых 97 пациентов получали лечение CBP501, цисплатином и пеметрекседом (Группа A), и 98 пациентов получали лечение пеметрекседом и цисплатином (Группа B).

Лекарственное средство, используемое в исследовании:

Состав: CBP501 для инъекции находился в пузырьках, включающих одну дозу (20 мг), содержащих стерильный лиофилизированный порошок, включающий ацетатную соль пептида CBP501 (мономерные звенья макромолекулы пептида). Для введения содержимое пузырька восстанавливали в 5%-м растворе декстрозы для инъекций, USP, и добавляли в 100 мл мешок для внутривенных инъекций, содержащий 5%-й раствор декстрозы для инъекций.

Пеметрексед: использовали коммерческий состав пеметрекседа, который восстанавливали в 20 мл 0,9% раствора хлорида натрия для инъекций, затем разбавляли до 100 мл.

Цисплатин: использовали коммерческий состав цисплатина и разбавляли в 250 мл нормального солевого раствора для введения.

Режим и путь введения:

CBP501, пеметрексед и цисплатин вводили в один и тот же день (День 1) каждые 3 недели на протяжении максимум шести циклов. Цикл составлял 3 недели (21 день).

Группа A

1. CBP501 25 мг/м² вводили в форме внутривенной инфузии продолжительностью 1 час.

2. Пеметрексед 500 мг/м² в форме внутривенной инфузии продолжительностью 10 минут немедленно после инфузии CBP501.

3. Цисплатин 75 мг/м² в форме внутривенной инфузии продолжительностью 1 час немедленно после инфузии пеметрекседа.

Группа B

1. Пеметрексед 500 мг/м² в форме внутривенной инфузии продолжительностью 10 минут.

2. Цисплатин 75 мг/м² в форме внутривенной инфузии продолжительностью 1 час немедленно после инфузии пеметрекседа.

Каждую комбинацию вводили через центральный или периферический венозный доступ.

Профилактическое лечение:

Все зарегистрированные пациенты получали:

1. Витаминные добавки: все пациенты получали инструкции ежедневно принимать низкую дозу перорального препарата фолиевой кислоты или поливитамина с фолиевой кислотой. По меньшей мере 5 суточных доз фолиевой кислоты должны были быть приняты во время 7-дневного периода, предшествующего первой дозе пеметрекседа, и введение должно продолжаться во время полного курса терапии и в течение 21 дня после последней дозы пеметрекседа. Предложенная доза фолиевой кислоты составляла 350-1000 мкг. Пациенты должно были также получать одну (1) внутримышечную инъекцию витамина B12 в течение недели, предшествующей первой дозе пеметрекседа, и каждые 3 цикла после того. Последующие инъекции витамина B12 могли вводиться в тот же день, что и пеметрексед. Доза витамина B12 составляла 1000 мкг.

2. Дексаметазон 4 мг перорально, дважды в сутки, за день до, в день лечения и на следующий день.

3. Профилактическое противорвотное лечение: состоящее из 5HT3 антагонистов+стероиды согласно стандартным протоколам лечебного центра. Пациентам давали дополнительные пероральные противорвотные средства по мере необходимости.

• Следующий протокол гидратации был предложен для пациентов без сердечно-сосудистых нарушений. Подобные протоколы, обычно используемые в исследовательских центрах, также могли быть использованы:

1. Пациенты получали в общей сложности 1,5-2,0-литровую гидратацию (5%-я декстроза или ½ нормальный солевой раствор) с 20 мэкв. KCl/л и 1 г MgSO4/л, со скоростью 500 мл/час.

2. После того, как пациент получил 1 час гидратационной инфузии, 12,5 г маннита вводили внутривенным болюсным введением.

3. Инфузию цисплатина (смешанного в нормальном солевом растворе в количестве 1 мг/мл) вливали затем за 1 час при продолжении гидратационной инфузии.

4. Дополнительный маннит вводили (12,5-50,0 г внутривенным болюсным введением) при необходимости для поддержания диуреза в количестве 250 мл/час в течение гидратации.

• Для пациентов, получавших лечение CBP501 (Группа A), рекомендовалось, чтобы они получили следующий профилактический режим для ослабления уровня и серьезности симптомов вследствие высвобождения гистамина:

1. Дифенилгидрамин (DPH) 50 мг в/в и ранитидин 50 мг в/в (или другой гистаминовый антагонист H2) перед каждым вливанием CBP501.

2. Лоратидин (10 мг) п/о за день (день -1), в день введения CBP501 (день 0) и на следующий день (день 1).

Продолжительность периода исследования на пациента:

Пациенты получали максимум шесть циклов лечения, если ранее не наблюдалось любое из следующего:

прогрессия заболевания

недопустимая токсичность

отказ от согласия

серьезное нарушение протокола

задержка лечения > 2 недель (кроме случая потенциальной или ощутимой пользы для пациента)

После прекращения лечения, пациентов наблюдали каждые 8 недель до прогрессии заболевания или инициации дальнейшей системной противораковой терапии, и затем каждые 6 месяцев до смерти.

Информированное согласие

Исследователь полностью объяснял пациенту цель и методы исследования, а также все ожидаемые эффекты и побочные реакции, перед любым исследованием проводили определенные процедуры скрининга. Пациенту предоставляли информационный лист и давали достаточно времени и возможность спросить о деталях испытания и решить, участвовать ли. Пациент и человек, с которым они обсуждают информированное согласие, подписывали и датировали письменное согласие.

Исследователь объяснял, что пациент имеет полное право отказаться участвовать в исследовании или выйти из него в любое время и по любой причине. Точно так же исследователь и/или спонсор имели право отозвать пациента в любое время для безопасности или ввиду административных причин. Любые другие требования, необходимые для защиты прав пациента, были объяснены согласно текущему CFR (21, части 312D, 50 и 56) и ICH (ICH E6 1997), рекомендациям GCP и Хельсинкской Декларации 1964 (как разъяснено в Токио в 2004).

Назначение номеров пациента

Рандомизацию пациента и распределение по группам лечения осуществляли централизованно.

Статистический анализ:

Модель пропорциональных рисков Кокса использовалась для оценки отношения риска (HR) для PFS между 2 группами лечения. Модель включала группу лечения как фактор, а также факторы стратификации рандомизации. Исследовались следующие ковариаты: возраст, пол, раса (белый/не белый), предшествующая хирургия/процедура (да/нет), предшествующая лучевая терапия (да/нет), рентгеновская (нормальная/патологическая) интерпретация, интерпретация (нормальная/патологическая) ECG, рентгеновское обследование (нормальное/патологическое) костей, и время диагноза. Любые непрерывные переменные, такие как возраст и время диагноза для изучения лечения, могли быть преобразованы в категорические переменные путем определения 2 или нескольких классов значений при получении наилучшей модели. Исследовательские переменные были введены с помощью пошагового алгоритма регресса с помощью следующих критериев: переменная должна быть значимой на уровне 0,25 для введения в модель и значимой на уровне 0,15, чтобы остаться в модели. Для заключительной модели точечную оценку отношений риска получали вместе с 95% CIs.

Исследования подгруппы проводили для пациентов, имевших WBC < 10000 мкл при скрининге. Дополнительный анализ подгруппы осуществляли с программным обеспечением GraphPad Prism 5 с исходными данными по каждому анализируемому пациенту.

Результаты эффективности:

Модель пропорциональных рисков Кокса, не исследуя другие ковариаты на выживаемости без прогрессии (PFS), показала, что Группа А (группа с CBP501) имела более высокий риск, чем Группа B (HR=1,20 [0,88, 1,65]), но это не было статистически значимо (P=0,25). Та же модель, исследуя другие ковариаты, также показала, что Группа А имела более высокий риск, чем Группа B (HR=1,21 [0,85, 1,73]), но это не было статистически значимо (P=0,30).

Для пациентов, имевших WBC <10000/мкл при скрининге, модель пропорциональных рисков Кокса, не исследуя другие ковариаты, показала, что Группа А имела более высокий риск, чем Группа B (HR=1,04 [0,73, 1,49]), но это не было статистически значимо (P=0,81). Та же модель, исследуя другие ковариаты, также показала, что Группа А имела более высокий риск, чем Группа B (HR=1,06 [0,71, 1,59]), но это не было статистически значимо (P=0,78).

Было отмечено, что отношение риска для PFS улучшается для Группы А, когда анализ был ограничен пациентами, у которых был WBC < 10000/мкл при скрининге в обоих анализах (Таблицы A, B).

Таблица A Анализ ковариат Кокса на PFS без исследования других ковариат

PFS с независимым радиологическим обзором Анализ ковариат Кокса на PFS без исследования других ковариат Отношение риска P-значение Все леченные 1,20 0,25 WBC < 10000 1,04 0,81

Таблица В Анализ ковариат Кокса на PFS с исследованием других ковариат

Исследование других ковариаты Отношение риска P-значение Все леченные 1,21 0,30 WBC < 10000 1,06 0,78

Модель пропорциональных рисков Кокса на общую выживаемость (OS) на всей леченной популяции

Группа А имела более низкий риск, чем Группа B без и с исследованием других ковариат (HR=0,96 и 0,77). Различие не было статистически значимо (P=0,82 и 0,25).

Модель пропорциональных рисков Кокса на OS на пациентах, имевших WBC < 10000/мкл при скрининге

Для OS на пациентах, имевших WBC < 10000/мкл при скрининге в леченной популяции Группа А имела более низкий риск, чем Группа B без и с исследованием других ковариат (HR=0,80 и 0,69); различие не было статистически значимо (P=0. 32 и 0,16).

Было отмечено, что отношение риска для OS улучшается для Группы А, когда анализ был ограничен пациентами, у которых был WBC < 10000/мкл при скрининге во всех анализах (Таблицы C, D).

Таблица С Анализ ковариат Кокса на OS без исследования других ковариат

Анализ ковариат Кокса на PFS без исследования других ковариат Отношение риска P-значение Все леченные 0,96 0,82 WBC < 10000 0,80 0,32

Таблица D Анализ ковариат Кокса на OS с исследованием других ковариат

Исследование других ковариат Отношение риска P-значение Все леченные 0,77 0,25 WBC < 10000 0,69 0,16

Фигура 14 показывает кривые выживания Кэплан-Мейера, среднее OS и отношение риска относительно WBC при скрининге (базовое) у всех получавших лечение пациентов. Отношение риска улучшается при снижении порога отсечения и пиках в WBC 8000/мкл как порош отсечения.

Что касается Фигуры 17, нейтрофилы очищали набором обогащения нейтрофилов EasySep (Stemcell technol.) из человеческой периферической крови после удаления эритроцитов с Hetasep (Stemcell technol.). Очищенные нейтрофилы (1×10⁶ клеток/лунка, 24-луночные планшеты) культивировали с или без 1 мкМ CBP501 в течение 15 минут (реакцию заканчивали путем добавления EDTA) и дальнейшие четыре часа с 1 нМ PMA, 3 или 10 мкМ A23187 или 100 или 1000 нг/мл LPS. Лунку промывали два раза и инкубировали с дезоксирибонуклеазой в течение 15 минут, и супернатанты собирали, инкубировали с субстратом эластазы в течение 2 часов и затем анализировали для обнаружения активности эластазы.

Что касается Фигуры 18, мышам C57BL/6, возраст 8 недель, внутривенно вводили с или без LPS 2,5, 5 или 10 мкг/мл за 30 минут до инъекции дифенилгидрамина. CBP501 (7,5 мг/кг) вводили спустя 30 минут после инъекции дифенилгидрамина. Комплекс тромбин/антитромбин определяли количественно с ELISA в плазме, отделенной от крови, собранной спустя 3 часа после CBP501 или ложной инъекции. Данные были получены в каждом условии из четырех животных.

Что касается Фигур 19A и 19B, макрофаги получали стимуляцией человеческих одноядерных клеток периферической крови с использованием 0,32 мкМ PMA и удалением всех суспендированных клеток через 48 часов после стимуляции PMA. Клетки затем инкубировали с 50 нг/мл IFN-гамма, 10 нг/мл LPS для получения фенотипа M1 и 20 нг/мл IL-4 для получения макрофагов M2. Обе обработки были с или без CBP501. Фагоцитарную активность мониторили при помощи флуоресцентных меченных бусинок и проточной цитометрии.

Что касается Фигуры 20, клеточную линия макрофагов RAW264,7 инкубировали с или без 0,1 или 1 мкМ CBP501 в течение 3-6 часов и затем далее инкубировали с или без 10 или 1000 нг/мл LPS в течение 4 часов. Высвободившийся TNF измеряли с помощью ELISA.

CBP501 показал потенциал в качестве эффективного противоопухолевого агента в доклинических (Sha, S., et al. Mol. Cancer Ther. 6:147 (2007)) и клинических исследованиях Фазы I (Shapiro, G.I., et al. Clin. Cancer Res. (2011)). CBP501 может действовать посредством двух механизмов действия, например, через отмену контрольной точки клеточный цикл G2 (Sha, S., et al. Mol. Cancer Ther. 6:147 (2007)) и концентрацию платины в опухолевых клетках или через ингибирование кальмодулина (Mine, N., et al. Mol. Cancer Ther. 10:1929 (2011)).

Как продемонстрировано здесь, неожиданно было обнаружено посредством анализа подгруппы популяции пациентов клинического исследования Фазы II с неплоскоклеточным немелкоклеточным раком легких, что было статистически значимое (p <0,0001) различие в выживаемости групп пациентов между таковыми с высоким количеством лейкоцитов (WBC) при скрининге и таковыми с нормальным или низким WBC.

Далее, как показано результатами, приведенными здесь, CBP501, в дополнение к прямому действию на опухолевые клетки, может также действовать на микросреду опухоли, такую как макрофаги, ингибируя кальмодулин и увеличивая внеклеточный зхват нейтрофилов (NETs) при воспалении у пациентов путем ослабления клиренса/фагоцитоза NETs макрофагами. Это может увеличить риск тромбоза глубоких вен (DVT) и метастазирования, и таким образом, потенциально плохо повлиять на выживаемость пациента. Наоборот, ингибирование макрофагов типа M2 у больных может предотвратить положительное действие макрофагов на рост опухоли, ангиогенез, метастазирование и иммунную эвазию опухоли, которые все промотируют метастазирование опухоли, что может сократить выживаемость пациентов.

Согласуясь с этим наблюдением, было продемонстрировано увеличенное формирование NETs активированных нейтрофилов лечением CBP501 in vitro и увеличенное образование комплекса Тромбин/Антитромбин у LPS стимулированных мышей. Ингибирование секреции цитокина и фагоцитоз обоих типов макрофагов M1 и M2 CBP501 было также показано.

Хотя клинические исследования показали, что CBP501 действует путем усиления цитотоксичности цисплатина против опухолевых клеток, результаты, приведенные здесь, демонстрируют неожиданное открытие, сделанное анализом подгруппы в исследовании Фазы II пациентов с неплоскоклеточным NSCLC, показывающее, что группы пациентов с высоким количеством лейкоцитов (WBC) при скрининге в клиническом исследовании, имеют более краткосрочную выживаемость, и другие группы пациентов с нормальным или низким WBC, имеют более длительную выживаемость в ответ на режим с CBP501, и различие было статистически очень значимым, причем значение p, вычисленное на кривых Кэплан-Мейера на общую выживаемость согласно лог-ранговому критерию (Мантель-Кокс), было менее 0,0001.

Было таким образом неожиданно обнаружено, что пациентам с нормальным или низким WBC перед лечением приносит большую пользу лечение с использованием CBP501, в то время как на пациентов с высоким WBC то же лечение могло оказывать негативное влияние. Ингибирующая активность CBP501 на кальмодулин позволяет предположить, что эффект на множество клеток микроокружения, таких как макрофаги, лейкоциты и лимфоциты, возможно, ингибирует или модулирует их активность, которая, возможно, вызывает двунаправленные результаты, потому что, например, просто ингибирование макрофагов, если оно ингибирует макрофаги типа M1, может оказывать негативное влияние на выживаемость пациента, и если бы оно ингибировало макрофаги M2, то это продлило бы выживаемость пациента.

Сообщалось, что ингибиторы кальмодулина ингибировали множество функций макрофагов (Horwitz, S.B., et al. J. Cell Biol. 91:798 (1981); Takenawa, T., et al. Biochem J. 15:208 (1982); Westra, J., et al. BMC Musculoskelet. Disord. 30:11 (2010)), leukocytes (Naccache, P.H., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 97(1):62 (1980); Takeshige, K., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 99(2):484 (1981); Jones, H.P., et al. Biochem Biophys. Acta. 714(1):152 (1982); Jones, H.P., et al. Methods Enzymol. 015:389 (1984); Verploegen, S., et al. Eur. J. Biochem. 269(18) 4625 (2002)) and lymphocytes (Salisbury, J.L., et al. Nature 12:294 (1981); Boubali, S., et al. Mol. Immunol. 52(2):51 (2012)). Пациенты с высоким WBC будут иметь тенденцию к наличию макрофагов M1, поскольку они относятся к провоспалительному типу, и пациенты с нормальным или низким WBC с опухолью будут иметь тенденцию к наличию макрофагов M2 (Hao, N., et al. Clin. Dev. Immunol. (2012)). Кроме того, известно, что пациенты с высоким WBC имеют более высокий риск развития тромбоза глубоких вен (DVT) (Pabinger, I., et al. Blood 122:12 (2013); Blix, K., et al. PLOS One 4:8 (2013); Wang, T.F., et al. Thromb. Res. 133(1):25 (2014)), который является причиной смерти для значительного числа больных раком. У этих пациентов имеется склонность к присуствию большего числа NETs, и NETs вызывают метастазирование опухоли (Cools-Lartigue, J., et al. J. Clin. Invest. (2013)), что является одной причиной плохого прогноза для многих больных раком, включая больных с раком легких.

В этом Примере не было никакого статистически значимого преимущества в выживаемости от добавления CBP501 к стандартному режиму, пеметрексед плюс цисплатин, когда его анализировали во всей леченной популяции. Однако было неожиданно идентифицировано анализом подгруппы, что добавление CBP501 предоставило преимущество для группы людей, показывавших нормальное или низкое количество лейкоцитов (WBC) при скрининге в клиническое исследовании. Нормальное значение WBC варьирует между разными местами и странами. Верхние нормальные пределы WBC могли составлять от 8000/мкл до 11000/мкл.

Было неожиданно, что пациенты с нормальным диапазоном WBC получали пользу из CBP501, а паиценты с высоким WBC при скрининге имели худшие результаты, чем пациенты, получавшие лечение цисплатином и пеметрекседом, несмотря на то, что оба различия не были статистически значимыми по сравнению с контрольной группой, получавшей цисплатин и пеметрексед популяцией.

Хотя точная причина этого потенциально двунаправленного действия CBP501 не очевидна, ингибирующая активность CBP501 в отношении кальмодулина показывает, что ингибирование кальмодулина во множестве клеток микроокружения, таких как макрофаги, лейкоциты и лимфоциты, ингибирует или модулирует их активность, вызывающую двунаправленный результат, потому что, например, если бы оно ингибировало макрофаги типа M1, это оказывало бы негативное влияние на выживаемость пациента за счет ингибирования противоопухолевой активности макрофагов и/или ингибирования клиренса NET, поскольку NET вызывает тромбогенез и метастазирование, и если бы это ингибировало проопухолевые макрофаги M2, то это продлило бы выживаемость пациента. Кроме того, известно, что цисплатин изменяет макрофаги от типа M1 до типа M2 (Dijkgraaf, E.M., et al. Cancer Res. 15:73(8):2480 (2013)), и известно химиотерапия по-отдельности вызывает метастазирование опухоли (Haas, M.J. SciBX 1-3 (2011)), таким образом, присутствие CBP501, в то время как проходит химиотерапия, могло бы оказать значительное влияние на метастазирование опухоли. Известно, что ингибиторы кальмодулина могут ингибировать множество функций макрофагов (Horwitz, S.B., et al. J. Cell Biol. 91:798 (1981); Takenawa, T., et al. Biochem J. 15:208 (1982); Westra, J., et al. BMC Musculoskelet. Disord. 30:11 (2010)), лейкоцитов (Naccache, P.H., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 97(1):62 (1980); Takeshige, K., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 99(2):484 (1981); Jones, H.P., et al. Biochem Biophys. Acta. 714(1):152 (1982); Jones, H.P., et al. Methods Enzymol. 015:389 (1984); Verploegen, S., et al. Eur. J. Biochem. 269(18) 4625 (2002)) и лимфоцитов (Salisbury, J.L., et al. Nature 12:294 (1981); Boubali, S., et al. Mol. Immunol. 52(2):51 (2012)). Пациенты с высоким WBC будут иметь тенденцию к наличию макрофагов M1, поскольку они являются провоспалительными, и пациенты с нормальным или низким WBC с опухолью будут иметь тенденцию к наличию макрофагов M2 (Hao, N., et al. Clin. Dev. Immunol. (2012)). Кроме того, пациенты с высоким WBC имеют тенденцию к наличию большего числа NETs. Если бы фагоцитоз NETs был предотвращен с помощью CBP501, то пациенты имели бы больший риск наличия DVT и метастазирования, которые оба уменьшают время выживания.

Также, поскольку кальмомодулин участвует в нормальных функциях лейкоцитов (Horwitz, S.B., et al. J. Cell Biol. 91:798 (1981); Takenawa, T., et al. Biochem J. 15:208 (1982); Westra, J., et al. BMC Musculoskelet. Disord. 30:11 (2010); Naccache, P.H., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 97(1):62 (1980); Takeshige, K., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 99(2):484 (1981); Jones, H.P., et al. Biochem Biophys. Acta. 714(1):152 (1982); Jones, H.P., et al. Methods Enzymol. 015:389 (1984); Verploegen, S., et al. Eur. J. Biochem. 269(18) 4625 (2002); Salisbury, J.L., et al. Nature 12:294 (1981); Boubali, S., et al. Mol. Immunol. 52(2):51 (2012); Hao, N., et al. Clin. Dev. Immunol. (2012)). CBP501 может вмешиваться и оказывать свою полезную активность на общую выживаемость за счет потенциального вреда функции WBC, когда они чрезмерно затребованы, например, в ситуации, когда пациенты страдают активной инфекцией, которая увеличивает количество лейкоцитов.

Ингибирование кальмодулина может также оказывать влияние на противораковый иммунитет путем действия на лимфоциты, поскольку предполагалось, что кальмодулин может вызывать анергию Т-клеток (Boubali, S., et al. Mol. Immunol. 52(2):51 (2012)).

Предварительная обработка или базовое количество WBC было показано как фактор прогноза для пациентов с NSCLC, получавших терапию на основе платины (Teramukai, S., et al. Eur. J. Cancer (45(11:1950 (2009); Kim, J.W., et al. Cancer Res. Trest. 45:4):325 (2013)). CBP501 может улучшить этот эффект путем коррекции активности цисплатина. Так как каждый пациент получает лабораторный анализ количества WBC в качестве универсально апробированной стандартной процедуры до лечения, пациенты могут быть выбраны на основании количества WBC.

Ингибирование кальмодулина CBP501 может также непосредственно ингибировать миграцию опухоли и метастазирование, независимо от концентрации платины, поскольку кальмодулин, как было показано, играет важную роль в миграции (Wang, H., et al. Nat. Commun. 4:1354 (2013)).

Пример 7

Этот пример включает описание комбинаций CBP501 для лечения рака.

CBP501 является лекарственным средством против рака, прошедшим два клинических испытания Фазы II в отношении пациентов со злокачественной плевральной мезотелиомой и немелкоклеточным раком легкого (NSCLC). CBP501 описан как уникальный направленный на контрольную точку G2 агент (1) и как усилитель захвата цисплатина (CDDP) (2).

CDDP является одним из самых мощных известных химиотерапевтических агентов, показывающим клиническую активность против большого разнообразия солидных опухолей. Главным способом действия, как считается, является ковалентное связывание с ДНК для порождения его характерных биологических эффектов, кульминацией которых является активация апоптотической программы (3). Противоопухолевая активность CDDP не может быть ограничена его способностью ингибировать митоз опухолевых клеток, но также включает важные иммуномодулирующие эффекты. De Biasi et al. рассмотрел четыре главных механизма CDDP-индуцированной противоопухолевой иммуномодуляции, которые представляют собой 1) повышающую регуляцию MHC класса I, 2) рекрутирование и пролиферацию эффекторных клеток, 3) повышающую регуляцию литической активности цитотоксических клеток-эффекторов и 4) понижающую регуляцию иммуносупрессорного микроокружения, путем методического исследования соответствующих преклинических литературных источников (4).

Гибель иммуногенных клеток (ICD) является функционально специфической формой апоптоза, которая достаточна для индукции у иммунокомпетентных хозяев адаптивного иммунного ответа против связанных с мертвыми клетками антигенов. Несколько лекарственных средств, включающих различные химиотерапевтические средства (например, доксорубицин, эпирубицин, идарубицин, митоксантрон, блеомицин, бортезомиб, циклофосфамид и оксалиплатин), являются индукторами ICD (5). ICD требует трех характерных признаков, включая экспонирование на поверхности клеток калретикулина и высвобождение АТФ и группы 1 белков с высокой подвижностью (HMGB1)(6). Сообщалось, что CDDP является относительно слабым индуктором ICD (7). Недавно Aranda et al. сообщили, что CDDP в комбинации с предшественником витамина B6 пиридоксином вызывал ICD, включая реакцию стресса ER и экспозицию на поверхности клеток калретикулина (8). Одна функция пиридоксина заключается в потенцировании внутриклеточной аккумуляции CDDP PDXK-зависимым образом (9). Несмотря на то, что механизмы действия пиридоксина и CBP501 по-видимому отличаются, увеличение аккумуляции CDDP является похожим.

Раковые клетки уклоняются от иммунного надзора множеством путей, включая использование иммунных контрольных точек, препятствующих тому, чтобы цитотоксические Т-клетки атаковали опухолевые клетки, занимая ингибирующие рецепторы на Т-клетких, такие как CTLA-4 или PD-1 (10). Ответы на ингибиторы иммунной контрольной точки, такие как анти-PD1 и анти-CTLA4, могут быть впечатляющими; однако существует множество пациентов, не отвечающих на эти антитела.

Как раскрыто здесь, CBP501 потенцировал появление CDDP-индуцированных индикаторов ICD. CBP501 также вызывал противоопухолевые эффекты в иммунокомпетентной модели мыши в комбинации с антителом анти-PD-1.

Пример 8

Этот пример включает описание материалов и методов.

Анализ клеточного цикла

Для анализа клеточного цикла клетки, собранные трипсином/EDTA (Gibco), окрашивали буфером Кришена (0,1% цитрата натрия, 50 Ag/мл пропидий йодида, 20 Ag/мл РНК-азы, 0,5% NP40) с последующей проточной цитометрией с помощью FACSCalibur (Becton Dickinson).

Анализ маркера для гибели иммуногенных клеток

CT26WT (CRL-2638, ATCC), штамм чувствительных клеток CBP501, обрабатывали CDDP (10 или 20 мкМ) и 0,5 мкМ CBP501 в течение 0,75 часов in vitro. После замены среды новой свободной лекарственных средств средой клетки инкубировали в течение 24, 48 или 72 часов для анализа фосфо-eIF2-альфа методом иммуноблоттинга, для анализа калретикулина методом FACS, или для анализа HMGB1 с помощью ELISA.

Иммуноблоттинг

Клетки лиззировали путем инкубации с буфером [NaCl (100 мМ), Трис-HCl (50 мМ, pH 8,0), DTT (1 мМ), NP40 (0,5% вес./об.), содержащим коктейль ингибитора фосфатазы PhosSTOP и Таблетки Полного Коктейля Ингибитора Протеиназы (Roche Life Science), каждый из которых разбавляли до указанных производителем концентраций] при 4°C в течение 30 минут и центрифугировали (15000 об/мин, 4°C, 20 минут). Супернатант (лизат целых клеток) подвергали электрофорезу (SDS-PAGE) и переносили с геля на мембрану (Millipore) из соединения поливинилиден дифторида (PVDF) электроблоттингом. После блокировки 1%-м Block Ace в T-TBS в течение 1 часа при комнатной температуре мембрану PVDF инкубировали с основным антителом при 4°C в течение ночи. На следующий день мембрану промывали T-TBS и инкубировали в течение 1 часа с конъюгатом вторичное антитело-HRP при комнатной температуре. После промывки мембран PVDF с T-TBS белки визуализировали с субстратом детекции Immobilon Western HRP (Millipore). Изображения регистрировали системой Luminescent Image Analyzer LAS-4000 (Fujifilm) и определяли количество интенсивности полос с помощью программного обеспечения Multi Gauge (Fujifilm).

Анализ экспозиции калретикулина на поверхности клеток

Клетки собирали и промывали PBS с последующей фиксацией PBS, содержащим 0,25% PFA, в течение 5 минут. Фиксированные клетки промывали дважды ледяным PBS и обрабатывали на льду с антителом к калретикулину (abcam), разбавленным PBS, содержащим 2% FBS (1/200), в течение 30 минут. Первичное антитело удаляли дважды с помощью PBS, содержащего 2% FBS, и обрабатывали alexa488-конъюгированным вторичным антителом, разбавленным PBS, содержащим 2% FBS (1/500), в течение 30 минут при комнатной температуре. Вторичное антитело удаляли дважды PBS и обрабатывали на льду пропидий йодидом (1 мкг/мл) в течение 5 минут с последующим анализом FACS с помощью FACSCalibur.

HMGB1 ELISA

Секретированный HMGB1 в среде определяли количественно набором ELISA HMGB1 II (SINO-TEST CORPORATION, Канагава, Япония) согласно инструкциям производителя.

Пример 9

Этот пример включает описание исследований in vivo с использованием CBP501, индивидуально и в различных комбинациях.

Все исследования на животных проводили согласно протоколам, одобренным институциональным комитетом по уходу за животными CanBas Co. Ltd. Шестинедельным мышам Balb/c женского пола (Charles River Laboratories Japan Inc.) прививали подкожно в бок суспензию CT26WT (5×10⁵ клеток). Неделю спустя мышей распределяли на 7 групп (6 мышей/группа) и обрабатывали 3 циклами введения 3 противораковых агентов, индивидуально или в различных комбинациях [CDDP: 5 мг/кг x 1/неделя, CBP501: 7,5 мг/кг x 3/неделя, антитело анти-mPD1 (RMP1-14): 200 мкг x 1/неделя]. Мышей предварительно обрабатывали 10 мг/кг дифенилгидрамина за 30 минут перед введением 5%-й глюкозы (носитель для CBP501) или лечением CBP501. Объемы опухоли, которые измеряли три раза в неделю парой кронциркулей, вычисляли по следующей формуле: объем (мм³)=[ширина (мм)]² x длина (мм)/2. Кривые роста после лечения генерировали путем выстраивания среднего +/-SE размеров опухоли.

CDDP, объединенный с CBP501, потенцирует приблизительно в 1,5-3 раза сильнее внутриклеточную аккумуляцию CDDP, чем CDDP индивидуально в CBP501-чувствительных человеческих линиях раковых клеток. В CBP501-чувствительной мышиной клетке CT26WT, лечение CDDP, объединенного с CBP501, было приблизительно в 2 раза более мощным, чем CDDP индивидуально в изменении распределения фазы клеточного цикла, что примерно коррелирует с внутриклеточными уровнями платины во многих случаях (Фиг. 21).

Сообщалось, что фосфорилирование Серина 51 в eIF2-альфа (фосфо-eIF2-альфа) является маркером стресса ER, который считается необходимым для экспозиции калретикулина на поверхности клеток (11). Авторы изобретения проанализировали эффект CBP501 против CDDP-индуцированного фосфо-eIF2-альфа и экспозицию калретикулина на поверхности клеток.

Лечение CDDP положительно регулировало фосфорилирование eIF2-альфа дозозависимым образом, и CBP501 увеличивал его (Фиг. 22). Положительный эффект CBP501 был также подтвержден в экспозиции калретикулина на поверхности клеток (Фиг. 23). Кроме того, CDDP, комбинированный с CBP501, приводит к до приблизительно 2 раз большему высвобождению HMGB1, чем CDDP индивидуально (Фиг. 24). Эти результаты показывают, что CBP501 потенцирует CDDP-индуцированную ICD.

На основе этой новой активности CBP501 комбинированное лечение с PD-1 блокирующим антителом in vivo было также проанализировано с помощью BALB/c, имевших п/к CT26WT (Фиг. 25). Лечения инициировали, когда размер опухоли достигал (~100 мм³).

CDDP-леченные мыши показали сокращение роста опухоли на 52,7% по сравнению с обработанными носителем мышами. CBP501+CDDP показал дополнительное сокращение роста опухоли на 63,1% по сравнению с обработанными носителем мышами. Лечение одним только анти-mPD-1 антителом показало небольшое сокращение роста опухоли на 25,2% по сравнению с обработанными носителем мышами. Однако комбинированное лечение анти-mPD-1+CDDP или анти-mPD-1+CDDP+CBP501 показало значительные сокращения роста опухоли по сравнению с обработанными носителем мышами на 69,3% и 78,7%, соответственно.

Ссылки для примеров 7-9:

1. Sha et al., Cell cycle phenotype-based optimization of G2-abrogating peptides yields CBP501 with a unique mechanism of action at the G2 checkpoint. Mol Cancer Ther. 2007;6:147-53.

2. Mine et al., CBP501-calmodulin binding contributes to sensitizing tumor cells to cisplatin and bleomycin. Mol Cancer Ther. 2011;10:1929-38.

3. Siddik ZH. Cisplatin: mode of cytotoxic action and molecular basis of resistance. Oncogene. 2003;22:7265-79.

4. De Biasi et al., Cisplatin-induced antitumor immunomodulation: a review of preclinical and clinical evidence. Clin Cancer Res. 2014;20:5384-91.

5. Pol et al., Trial Watch: Immunogenic cell death inducers for anticancer chemotherapy. Oncoimmunology. 2015;4:e1008866.

6. Bianchi et al., Killing cancer cells, twice with one shot. Cell Death Differ. 2014;21:1-2.

7. Tesniere et al., Immunogenic death of colon cancer cells treated with oxaliplatin. Oncogene. 2010;29:482-91.

8. Aranda et al., Immune-dependent antineoplastic effects of cisplatin plus pyridoxine in non-small-cell lung cancer. Oncogene. 2015;34:3053-62.

9. Galluzzi et al., Vitamin B6 metabolism influences the intracellular accumulation of cisplatin. Cell Cycle. 2013;12:417-21.

10. Intlekofer AM and Thompson CB. At the bench: preclinical rationale for CTLA-4 and PD-1 blockade as cancer immunotherapy. J Leukoc Biol. 2013;94:25-39.

11. Panaretakis et al., Mechanisms of pre-apoptotic calreticulin exposure in immunogenic cell death. EMBO J. 2009;28:578-90.

Пример 10

Этот пример включает описание двух исследований ксенотрансплантата для комбинации CBP501 с цисплатином и комбинации анти-PD1 и CBP501 с цисплатином и анти-PD-L1.

Исследования на животных

Клетки CT26WT (5×10⁵) подкожно прививали в правый бок 8-9-недельных мышей Balb/c женского пола. Семь или восемь дней спустя мышей рандомизировали на основе размера опухоли, и комбинированную терапию инициировали в день 1. Размер опухоли и массу тела измеряли два или три раза в неделю. Размер опухоли вычисляли цифровым штангенциркулем, и объемы вычисляли по следующей формуле: объем (мм³)=[ширина (мм)]² x длина (мм)/2. Относительные размеры опухолей выстраивали против числа дней после инициации лечения.

CDDP с анти-PD-1 или анти-PD-L1

Мышам, несущим подкожную опухоль CT26WT (n=6), внутрибрюшинно вводили дифенилгидрамин (10 мг/кг) с посоледующей внутривенной инъекцией носителя (солевой раствор) или CDDP (4 мг/кг), или CDDP (4 мг/кг), смешанного с CBP501 (6мг/кг) в интервале 15 минут в дни 1 и 8. Антитела (200 мкг/мышь), включая анти-PD-1 (RMP1-14) и анти-PD-L1 (клон 10F,9G2), или солевой раствор вводили внутрибрюшинно в дни 2, 4, 9 и 11.

Карбоплатин с анти-PD-L1

Мышам, несущим подкожную опухоль CT26WT (n=9), внутрибрюшинно вводили дифенилгидрамин (10 мг/кг) с последующей внутривенной инъекцией носителя (солевой раствор) или карбоплатина (50 мг/кг), или карбоплатина (50мг/кг), смешанного с CBP501 (6мг/кг), в интервале 15 минут в дни 1 и 8. Четыреста микрограммов анти-PD-L1 (клон 10F,9G2) или солевого раствора вводили внутрибрюшинно в дни 4, 11 и 16.

Пример 11

Этот пример включает описание анализа опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов (TIL).

CT26WT подкожно инокулировали в левый бок мышей Balb/c женского пола. Семь - восемь дней спустя мышей рандомизировали на основании размера опухоли по 6 группам (3-4 мыши/группа) и обрабатывали носителем, CDDP (4 мг/кг в/в), Combo (CDDP 4 мг/кг в/в+CBP501 6 мг/кг в/в), анти-PD1 (400 мкг/мышь в/б) анти-PD1 плюс CDDP или анти-PD-1 плюс Combo. CDDP и CBP501 вводили в дни 1 и 8, и анти-PD1 вводили в дни 2, 5 и 8. Затем опухоли извлекали из мышей в день 11 и расщепляли тройной смесью ферментов (коллагеназа, гиалуронидаза и дезоксирибонуклеаза) для получения единственной суспензии клетки. Клетки обрабатывали блокатором FcR и окрашивали специфическим антителом для анализа многоцветной проточной цитометрии, включая CD4, CD8, CD45, CD11b, Ly6G, Ly6C, F4/80, MHC класса II и CD206. Количественные данные (Фигура 32) показаны как средние значения с SEM (n=3-4 мышей/группа). *: p <0,05, **: p <0,01, n.s.: не значительный (непарный 2-сторонний t-тест Стъюдента), по сравнению с клетками от обработанной носителем или PD-1 опухоли.

Приведенные выше данные демонстрируют, что CBP501 имел тенденцию увеличивать CD8 (=CD45+CD8 +), популяцию эффекторных Т-клеток для уничтожения опухолевых клеток, инфильтрацию в место опухоли, будучи скомбинирован с CDDP. Достигнутые уровни были статистически значимыми при комбинации с CDDP и антителом анти-PD1. Этот результат согласуется с наблюдаемой супрессией роста опухоли на мышиной модели ксенотрансплантата.

Приведенные выше данные также демонстрируют уменьшенные CBP501 макрофаги M2 (=F4/80+CD206 +), что поддерживает рост опухоли и ускользание от иммунного ответа, на статистически значимом уровне, при комбинации с CDDP или CDDP плюс антитело анти-PD1. Этот результат также согласуется с наблюдаемой супрессии роста опухоли на мышиной модели ксенотрансплантата.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> CanBas Co., Ltd.

KAWABE, TAKUMI

<120> ПЕПТИДЫ И ПЕПТИДОМИМЕТИКИ В КОМБИНАЦИИ С АГЕНТАМИ, АКТИВИРУЮЩИМИ

Т-КЛЕТКИ И/ИЛИ ИНГИБИРУЮЩИМИ КОНТРОЛЬНЫЕ ТОЧКИ, ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА

<130> 087533-0448671

<140> PCT/JP2016/082500

<141> 2016-10-24

<150> 15/331,478

<151> 2016-10-21

<150> 62/245,899

<151> 2015-10-23

<150> 62/345,416

<151> 2016-06-03

<160> 139

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<400> 1

000

<210> 2

<400> 2

000

<210> 3

<400> 3

000

<210> 4

<400> 4

000

<210> 5

<400> 5

000

<210> 6

<400> 6

000

<210> 7

<400> 7

000

<210> 8

<400> 8

000

<210> 9

<400> 9

000

<210> 10

<400> 10

000

<210> 11

<400> 11

000

<210> 12

<400> 12

000

<210> 13

<400> 13

000

<210> 14

<400> 14

000

<210> 15

<400> 15

000

<210> 16

<400> 16

000

<210> 17

<400> 17

000

<210> 18

<400> 18

000

<210> 19

<400> 19

000

<210> 20

<400> 20

000

<210> 21

<400> 21

000

<210> 22

<400> 22

000

<210> 23

<400> 23

000

<210> 24

<400> 24

000

<210> 25

<400> 25

000

<210> 26

<400> 26

000

<210> 27

<400> 27

000

<210> 28

<400> 28

000

<210> 29

<400> 29

000

<210> 30

<400> 30

000

<210> 31

<400> 31

000

<210> 32

<400> 32

000

<210> 33

<400> 33

000

<210> 34

<400> 34

000

<210> 35

<400> 35

000

<210> 36

<400> 36

000

<210> 37

<400> 37

000

<210> 38

<400> 38

000

<210> 39

<400> 39

000

<210> 40

<400> 40

000

<210> 41

<400> 41

000

<210> 42

<400> 42

000

<210> 43

<211> 12

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> Xaa обозначает Cha или Nal(2)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (2)..(2)

<223> Xaa обозначает (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F) или (Phe-4CF3)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (3)..(3)

<223> Xaa обозначает любую аминокислоту

<220>

<221> MOD_RES

<222> (4)..(4)

<223> Xaa обозначает d- или l-Trp

<220>

<221> MOD_RES

<222> (5)..(5)

<223> Xaa обозначает любую аминокислоту

<220>

<221> MOD_RES

<222> (6)..(6)

<223> Xaa обозначает Bpa или (Ser-Tyr)

<400> 43

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Arg Arg Arg Arg Arg

1 5 10

<210> 44

<211> 12

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> Xaa обозначает Cha или Nal(2)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (2)..(2)

<223> Xaa обозначает (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F) или (Phe-4CF3)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (3)..(3)

<223> Xaa обозначает любую аминокислоту

<220>

<221> MOD_RES

<222> (4)..(4)

<223> Xaa обозначает d- или l-Trp

<220>

<221> MOD_RES

<222> (5)..(5)

<223> Xaa обозначает любую аминокислоту

<220>

<221> MOD_RES

<222> (6)..(6)

<223> Xaa обозначает Bpa или (Ser-Tyr)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)..(7)

<223> Xaa обозначает d- или l-Arg

<400> 44

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Arg Arg Arg Arg

1 5 10

<210> 45

<211> 12

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> Xaa обозначает Bpa или (Ser-Tyr)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (2)..(2)

<223> Xaa обозначает любую аминокислоту

<220>

<221> MOD_RES

<222> (3)..(3)

<223> Xaa обозначает d- или l-Trp

<220>

<221> MOD_RES

<222> (4)..(4)

<223> Xaa обозначает любую аминокислоту

<220>

<221> MOD_RES

<222> (5)..(5)

<223> Xaa обозначает (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F) или (Phe-4CF3)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (6)..(6)

<223> Xaa обозначает Cha, или Nal(2)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (12)..(12)

<223> Xaa обозначает d- или l-Arg

<400> 45

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Arg Arg Arg Arg Xaa

1 5 10

<210> 46

<211> 12

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> Xaa обозначает Bpa или (Ser-Tyr)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (2)..(2)

<223> Xaa обозначает любую аминокислоту

<220>

<221> MOD_RES

<222> (3)..(3)

<223> Xaa обозначает d- или l-Trp

<220>

<221> MOD_RES

<222> (4)..(4)

<223> Xaa обозначает любую аминокислоту

<220>

<221> MOD_RES

<222> (5)..(5)

<223> Xaa обозначает (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F) или (Phe-4CF3)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (6)..(6)

<223> Xaa обозначает Cha или Nal(2)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)..(7)

<223> Xaa обозначает d- или l-Arg

<400> 46

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Arg Arg Arg Arg

1 5 10

<210> 47

<211> 12

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> MOD_RES

<222> (6)..(6)

<223> Xaa обозначает d- или l-Arg

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)..(7)

<223> Xaa обозначает Cha или Nal(2)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)..(7)

<223> Xaa обозначает Cha, или Nal(2)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (8)..(8)

<223> Xaa обозначает (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F) или (Phe-4CF3)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (9)..(9)

<223> Xaa обозначает любую аминокислоту

<220>

<221> MOD_RES

<222> (10)..(10)

<223> Xaa обозначает d- или l-Trp

<220>

<221> MOD_RES

<222> (11)..(11)

<223> Xaa обозначает любую аминокислоту

<220>

<221> MOD_RES

<222> (12)..(12)

<223> Xaa обозначает Bpa или (Ser-Tyr)

<400> 47

Arg Arg Arg Arg Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5 10

<210> 48

<211> 12

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> MOD_RES

<222> (6)..(6)

<223> Xaa обозначает d- или l-Arg

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)..(7)

<223> Xaa обозначает Bpa или (Ser-Tyr)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (8)..(8)

<223> Xaa обозначает любую аминокислоту

<220>

<221> MOD_RES

<222> (9)..(9)

<223> Xaa обозначает d- или l-Trp

<220>

<221> MOD_RES

<222> (10)..(10)

<223> Xaa обозначает любую аминокислоту

<220>

<221> MOD_RES

<222> (11)..(11)

<223> Xaa обозначает (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F) или (Phe-4CF3)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (12)..(12)

<223> Xaa обозначает Cha или Nal(2)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (12)..(12)

<223> Xaa обозначает Cha или Nal(2)

<400> 48

Arg Arg Arg Arg Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5 10

<210> 49

<211> 12

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> Xaa обозначает d- или l-Arg

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)..(7)

<223> Xaa обозначает Cha, или Nal(2)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)..(7)

<223> Xaa обозначает Cha или Nal(2)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (8)..(8)

<223> Xaa обозначает (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F) или (Phe-4CF3)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (9)..(9)

<223> Xaa обозначает любую аминокислоту

<220>

<221> MOD_RES

<222> (10)..(10)

<223> Xaa обозначает d- или l-Trp

<220>

<221> MOD_RES

<222> (11)..(11)

<223> Xaa обозначает любую аминокислоту

<220>

<221> MOD_RES

<222> (12)..(12)

<223> Xaa обозначает Bpa или (Ser-Tyr)

<400> 49

Xaa Arg Arg Arg Arg Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5 10

<210> 50

<211> 12

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> Xaa обозначает d- или l-Arg

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)..(7)

<223> Xaa обозначает Bpa или (Ser-Tyr)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (8)..(8)

<223> Xaa обозначает любую аминокислоту

<220>

<221> MOD_RES

<222> (9)..(9)

<223> Xaa обозначает d- или l-Trp

<220>

<221> MOD_RES

<222> (10)..(10)

<223> Xaa обозначает любую аминокислоту

<220>

<221> MOD_RES

<222> (11)..(11)

<223> Xaa обозначает (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F) или (Phe-4CF3)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (12)..(12)

<223> Xaa обозначает Cha или Nal(2)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (12)..(12)

<223> Xaa обозначает Cha или Nal(2)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (12)..(12)

<223> Xaa обозначает Cha или Nal(2)

<400> 50

Xaa Arg Arg Arg Arg Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5 10

<210> 51

<211> 8

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> Xaa обозначает d- или l-Arg

<220>

<221> MOD_RES

<222> (3)..(3)

<223> Xaa обозначает Bpa или (Ser-Tyr)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)..(7)

<223> Xaa обозначает (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F) или (Phe-4CF3)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (8)..(8)

<223> Xaa обозначает Cha или Nal(2)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (8)..(8)

<223> Xaa обозначает Cha или Nal(2)

<400> 51

Xaa Arg Xaa Arg Arg Arg Xaa Xaa

1 5

<210> 52

<211> 9

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> Xaa обозначает Cha или Nal(2)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> Xaa обозначает Cha или Nal(2)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (4)..(4)

<223> Xaa обозначает Bpa или (Ser-Tyr)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (6)..(6)

<223> Xaa обозначает d- или l-Trp

<220>

<221> MOD_RES

<222> (8)..(8)

<223> Xaa обозначает (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F) или (Phe-4CF3)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (9)..(9)

<223> Xaa обозначает Cha или Nal(2)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (9)..(9)

<223> Xaa обозначает Cha или Nal(2)

<400> 52

Xaa Arg Arg Xaa Arg Xaa Arg Xaa Xaa

1 5

<210> 53

<211> 8

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> Xaa обозначает Cha или Nal(2)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (2)..(2)

<223> Xaa обозначает (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F) или (Phe-4CF3)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (6)..(6)

<223> Xaa обозначает Bpa или (Ser-Tyr)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (8)..(8)

<223> Xaa обозначает d- или l-Arg

<400> 53

Xaa Xaa Arg Arg Arg Xaa Arg Xaa

1 5

<210> 54

<211> 9

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> Xaa обозначает Cha или Nal(2)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> Xaa обозначает Cha или Nal(2)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> Xaa обозначает Cha или Nal(2)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (2)..(2)

<223> Xaa обозначает (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F) или (Phe-4CF3)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (6)..(6)

<223> Xaa обозначает Bpa или (Ser-Tyr)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (9)..(9)

<223> Xaa обозначает d- или l-Arg

<400> 54

Xaa Xaa Arg Trp Arg Xaa Arg Arg Xaa

1 5

<210> 55

<211> 12

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> Xaa обозначает Cha или Nal(2)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (2)..(2)

<223> Xaa обозначает Phe-2,3,4,5,6-F

<220>

<221> MOD_RES

<222> (6)..(6)

<223> Xaa обозначает Bpa или (Ser-Tyr)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (10)..(10)

<223> Xaa обозначает Gln или Arg

<400> 55

Xaa Xaa Ser Trp Ser Xaa Arg Arg Arg Xaa Arg Arg

1 5 10

<210> 56

<211> 12

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> MOD_RES

<222> (3)..(3)

<223> Xaa обозначает Gln или Arg

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)..(7)

<223> Xaa обозначает Bpa или (Ser-Tyr)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (11)..(11)

<223> Xaa обозначает Phe-2,3,4,5,6-F

<220>

<221> MOD_RES

<222> (12)..(12)

<223> Xaa обозначает Cha или Nal(2)

<400> 56

Arg Arg Xaa Arg Arg Arg Xaa Ser Trp Ser Xaa Xaa

1 5 10

<210> 57

<211> 9

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> MOD_RES

<222> (3)..(3)

<223> Xaa обозначает Gln или Arg

<220>

<221> MOD_RES

<222> (4)..(4)

<223> Xaa обозначает Bpa или (Ser-Tyr)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (8)..(8)

<223> Xaa обозначает Phe-2,3,4,5,6-F

<220>

<221> MOD_RES

<222> (9)..(9)

<223> Xaa обозначает Cha или Nal(2)

<400> 57

Arg Arg Xaa Xaa Arg Trp Arg Xaa Xaa

1 5

<210> 58

<211> 9

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> Xaa обозначает Cha или Nal(2)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (2)..(2)

<223> Xaa обозначает Phe-2,3,4,5,6-F

<220>

<221> MOD_RES

<222> (6)..(6)

<223> Xaa обозначает Bpa или (Ser-Tyr)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)..(7)

<223> Xaa обозначает Gln или Arg

<400> 58

Xaa Xaa Arg Trp Arg Xaa Xaa Arg Arg

1 5

<210> 59

<211> 12

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (1)..(1)

<223> Xaa обозначает Бензоил-фенилаланин

<220>

<221> разное

<222> (6)..(6)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<400> 59

Xaa Ser Trp Ser Phe Xaa Arg Arg Gln Arg Arg Arg

1 5 10

<210> 60

<211> 12

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (7)..(7)

<223> Xaa обозначает Бензоил-фенилаланин

<220>

<221> разное

<222> (12)..(12)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<400> 60

Arg Arg Gln Arg Arg Arg Xaa Ser Trp Ser Phe Xaa

1 5 10

<210> 61

<211> 12

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (1)..(1)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<220>

<221> разное

<222> (6)..(6)

<223> Xaa обозначает Бензоил-фенилаланин

<400> 61

Xaa Phe Ser Trp Ser Xaa Arg Arg Arg Gln Arg Arg

1 5 10

<210> 62

<211> 12

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (7)..(7)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<220>

<221> разное

<222> (12)..(12)

<223> Xaa обозначает Бензоил-фенилаланин

<400> 62

Arg Arg Arg Gln Arg Arg Xaa Phe Ser Trp Ser Xaa

1 5 10

<210> 63

<211> 12

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (1)..(1)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<220>

<221> разное

<222> (6)..(6)

<223> Xaa обозначает Бензоил-фенилаланин

<400> 63

Xaa Phe Ser Trp Ser Xaa Arg Arg Gln Arg Arg Arg

1 5 10

<210> 64

<211> 12

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (7)..(7)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<220>

<221> разное

<222> (12)..(12)

<223> Xaa обозначает Бензоил-фенилаланин

<400> 64

Arg Arg Gln Arg Arg Arg Xaa Phe Ser Trp Ser Xaa

1 5 10

<210> 65

<211> 12

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (7)..(7)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<220>

<221> разное

<222> (12)..(12)

<223> Xaa обозначает Бензоил-фенилаланин

<400> 65

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Xaa Phe Ser Trp Ser Xaa

1 5 10

<210> 66

<211> 12

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (1)..(1)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<220>

<221> разное

<222> (6)..(6)

<223> Xaa обозначает Бензоил-фенилаланин

<400> 66

Xaa Phe Ser Trp Ser Xaa Arg Arg Arg Arg Arg Arg

1 5 10

<210> 67

<211> 12

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (7)..(7)

<223> Xaa обозначает Бензоил-фенилаланин

<220>

<221> разное

<222> (12)..(12)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<400> 67

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Xaa Ser Trp Ser Phe Xaa

1 5 10

<210> 68

<211> 12

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (1)..(1)

<223> Xaa обозначает Бензоил-фенилаланин

<220>

<221> разное

<222> (6)..(6)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<400> 68

Xaa Ser Trp Ser Phe Xaa Arg Arg Arg Arg Arg Arg

1 5 10

<210> 69

<211> 8

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (3)..(3)

<223> Xaa обозначает Бензоил-фенилаланин

<220>

<221> разное

<222> (8)..(8)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<400> 69

Arg Arg Xaa Arg Arg Arg Phe Xaa

1 5

<210> 70

<211> 8

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (1)..(1)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<220>

<221> разное

<222> (6)..(6)

<223> Xaa обозначает Бензоил-фенилаланин

<400> 70

Xaa Phe Arg Arg Arg Xaa Arg Arg

1 5

<210> 71

<211> 9

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (4)..(4)

<223> Xaa обозначает Бензоил-фенилаланин

<220>

<221> разное

<222> (9)..(9)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<400> 71

Arg Arg Arg Xaa Arg Trp Arg Phe Xaa

1 5

<210> 72

<211> 9

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (1)..(1)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<220>

<221> разное

<222> (6)..(6)

<223> Xaa обозначает Бензоил-фенилаланин

<400> 72

Xaa Phe Arg Trp Arg Xaa Arg Arg Arg

1 5

<210> 73

<211> 10

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (5)..(5)

<223> Xaa обозначает Бензоил-фенилаланин

<220>

<221> разное

<222> (10)..(10)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<400> 73

Arg Arg Arg Arg Xaa Arg Trp Arg Phe Xaa

1 5 10

<210> 74

<211> 10

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (1)..(1)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<220>

<221> разное

<222> (6)..(6)

<223> Xaa обозначает Бензоил-фенилаланин

<400> 74

Xaa Phe Arg Trp Arg Xaa Arg Arg Arg Arg

1 5 10

<210> 75

<211> 9

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (4)..(4)

<223> Xaa обозначает Бензоил-фенилаланин

<220>

<221> разное

<222> (9)..(9)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<400> 75

Arg Arg Arg Xaa Arg Arg Arg Phe Xaa

1 5

<210> 76

<211> 9

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (1)..(1)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<220>

<221> разное

<222> (6)..(6)

<223> Xaa обозначает Бензоил-фенилаланин

<400> 76

Xaa Phe Arg Arg Arg Xaa Arg Arg Arg

1 5

<210> 77

<211> 12

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (1)..(1)

<223> Xaa обозначает Бензоил-фенилаланин

<220>

<221> разное

<222> (6)..(6)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<400> 77

Xaa Ser Trp Ser Phe Xaa Arg Arg Arg Gln Arg Arg

1 5 10

<210> 78

<211> 17

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (10)..(10)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<400> 78

Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Xaa Phe Arg Ser Pro Ser Tyr

1 5 10 15

Tyr

<210> 79

<211> 15

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (1)..(1)

<223> Xaa обозначает Бензоил-фенилаланин

<220>

<221> разное

<222> (6)..(6)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<400> 79

Xaa Ser Trp Ser Phe Xaa Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg

1 5 10 15

<210> 80

<211> 12

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (1)..(1)

<223> Xaa обозначает Бензоил-фенилаланин

<220>

<221> разное

<222> (6)..(6)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<400> 80

Xaa Ser Trp Ser Phe Xaa Arg Arg Arg Gln Arg Arg

1 5 10

<210> 81

<211> 6

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (1)..(1)

<223> Xaa обозначает Бензоил-фенилаланин

<220>

<221> разное

<222> (6)..(6)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<400> 81

Xaa Ser Trp Ser Phe Xaa

1 5

<210> 82

<211> 10

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (1)..(1)

<223> Xaa обозначает Бензоил-фенилаланин

<220>

<221> разное

<222> (6)..(6)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<400> 82

Xaa Ser Trp Ser Phe Xaa Arg Gln Arg Arg

1 5 10

<210> 83

<211> 11

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (1)..(1)

<223> Xaa обозначает Бензоил-фенилаланин

<220>

<221> разное

<222> (6)..(6)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<400> 83

Xaa Ser Trp Ser Phe Xaa Arg Arg Gln Arg Arg

1 5 10

<210> 84

<211> 10

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (1)..(1)

<223> Xaa обозначает Бензоил-фенилаланин

<220>

<221> разное

<222> (6)..(6)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<400> 84

Xaa Ser Trp Ser Phe Xaa Arg Arg Arg Gln

1 5 10

<210> 85

<211> 11

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (1)..(1)

<223> Xaa обозначает Бензоил-фенилаланин

<220>

<221> разное

<222> (6)..(6)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<400> 85

Xaa Ser Trp Ser Phe Xaa Arg Arg Arg Gln Arg

1 5 10

<210> 86

<211> 6

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<400> 86

Arg Arg Arg Gln Arg Arg

1 5

<210> 87

<211> 13

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (7)..(7)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<400> 87

Tyr Ser Pro Trp Ser Phe Xaa Arg Arg Arg Gln Arg Arg

1 5 10

<210> 88

<211> 13

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (7)..(7)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<400> 88

Tyr Ser Pro Trp Ser Phe Xaa Arg Arg Arg Gln Arg Arg

1 5 10

<210> 89

<211> 12

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (1)..(1)

<223> Xaa обозначает Бензоил-фенилаланин

<220>

<221> разное

<222> (6)..(6)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<400> 89

Xaa Ser Trp Ser Phe Xaa Arg Arg Arg Gln Arg Arg

1 5 10

<210> 90

<211> 11

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (1)..(1)

<223> Xaa обозначает Бензоил-фенилаланин

<220>

<221> разное

<222> (6)..(6)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<400> 90

Xaa Ser Trp Ser Phe Xaa Arg Arg Arg Arg Arg

1 5 10

<210> 91

<211> 12

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (1)..(1)

<223> Xaa обозначает Бензоил-фенилаланин

<220>

<221> разное

<222> (6)..(6)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<400> 91

Xaa Ser Trp Ser Phe Xaa Arg Arg Arg Arg Arg Arg

1 5 10

<210> 92

<211> 12

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (1)..(1)

<223> Xaa обозначает Бензоил-фенилаланин

<220>

<221> разное

<222> (6)..(6)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<400> 92

Xaa Ser Trp Ser Phe Xaa Lys Lys Lys Lys Lys Lys

1 5 10

<210> 93

<211> 12

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (7)..(7)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<220>

<221> разное

<222> (12)..(12)

<223> Xaa обозначает Бензоил-фенилаланин

<400> 93

Arg Arg Arg Gln Arg Arg Xaa Phe Ser Trp Ser Xaa

1 5 10

<210> 94

<211> 12

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (7)..(7)

<223> Xaa обозначает Бензоил-фенилаланин

<220>

<221> разное

<222> (12)..(12)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<400> 94

Arg Arg Arg Gln Arg Arg Xaa Ser Trp Ser Phe Xaa

1 5 10

<210> 95

<211> 12

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (7)..(7)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<220>

<221> разное

<222> (12)..(12)

<223> Xaa обозначает Бензоил-фенилаланин

<400> 95

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Xaa Phe Ser Trp Ser Xaa

1 5 10

<210> 96

<211> 8

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (3)..(3)

<223> Xaa обозначает Бензоил-фенилаланин

<220>

<221> разное

<222> (8)..(8)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<400> 96

Arg Arg Xaa Arg Arg Arg Phe Xaa

1 5

<210> 97

<211> 9

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (4)..(4)

<223> Xaa обозначает Бензоил-фенилаланин

<220>

<221> разное

<222> (9)..(9)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<400> 97

Arg Arg Arg Xaa Arg Trp Arg Phe Xaa

1 5

<210> 98

<211> 10

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (5)..(5)

<223> Xaa обозначает Бензоил-фенилаланин

<220>

<221> разное

<222> (10)..(10)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<400> 98

Arg Arg Arg Arg Xaa Arg Trp Arg Phe Xaa

1 5 10

<210> 99

<211> 9

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (4)..(4)

<223> Xaa обозначает Бензоил-фенилаланин

<220>

<221> разное

<222> (9)..(9)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<400> 99

Arg Arg Arg Xaa Arg Arg Arg Phe Xaa

1 5

<210> 100

<211> 12

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (7)..(7)

<223> Xaa обозначает Бензоил-фенилаланин

<220>

<221> разное

<222> (12)..(12)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<400> 100

Arg Arg Arg Gln Arg Arg Xaa Ser Trp Ser Phe Xaa

1 5 10

<210> 101

<211> 6

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (1)..(1)

<223> Xaa обозначает Бензоил-фенилаланин

<220>

<221> разное

<222> (6)..(6)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<400> 101

Xaa Ser Trp Ser Phe Xaa

1 5

<210> 102

<211> 7

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (7)..(7)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<400> 102

Tyr Ser Pro Trp Ser Phe Xaa

1 5

<210> 103

<211> 7

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (1)..(1)

<223> Xaa обозначает Бензоил-фенилаланин

<220>

<221> разное

<222> (6)..(6)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<400> 103

Xaa Cys Trp Ser Phe Xaa Cys

1 5

<210> 104

<211> 8

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (7)..(7)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<400> 104

Tyr Cys Pro Trp Ser Phe Xaa Cys

1 5

<210> 105

<211> 19

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (12)..(12)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<400> 105

Tyr Gln Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Xaa Phe Arg Ser Pro

1 5 10 15

Ser Tyr Tyr

<210> 106

<211> 18

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (12)..(12)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<400> 106

Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Xaa Phe Arg Ser Pro

1 5 10 15

Ser Tyr

<210> 107

<211> 11

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (4)..(4)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<400> 107

Arg Arg Arg Xaa Phe Arg Ser Pro Ser Tyr Tyr

1 5 10

<210> 108

<211> 14

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (7)..(7)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<400> 108

Arg Arg Gln Arg Arg Arg Xaa Phe Arg Ser Pro Ser Tyr Tyr

1 5 10

<210> 109

<211> 13

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (7)..(7)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<400> 109

Arg Arg Gln Arg Arg Arg Xaa Phe Ser Trp Pro Ser Tyr

1 5 10

<210> 110

<211> 16

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (12)..(12)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<220>

<221> разное

<222> (14)..(14)

<223> Xaa может быть любой природной аминокислотой

<400> 110

Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Xaa Phe Xaa Tyr Tyr

1 5 10 15

<210> 111

<211> 19

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (8)..(8)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<400> 111

Tyr Tyr Ser Gly Ser Arg Phe Xaa Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys

1 5 10 15

Arg Gly Tyr

<210> 112

<211> 13

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<400> 112

Tyr Ser Pro Trp Ser Phe Pro Arg Arg Arg Gln Arg Arg

1 5 10

<210> 113

<211> 14

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<400> 113

Tyr Ser Pro Trp Ser Phe Pro Arg Arg Arg Gln Arg Arg Arg

1 5 10

<210> 114

<211> 16

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (3)..(3)

<223> Xaa может быть любой природной аминокислотой

<220>

<221> разное

<222> (5)..(5)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<400> 114

Tyr Tyr Xaa Phe Xaa Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Gly Tyr

1 5 10 15

<210> 115

<211> 15

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (2)..(2)

<223> Xaa может быть любой природной аминокислотой

<220>

<221> разное

<222> (4)..(4)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<400> 115

Tyr Xaa Phe Xaa Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Gly Tyr

1 5 10 15

<210> 116

<400> 116

000

<210> 117

<211> 14

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (1)..(1)

<223> Xaa может быть любой природной аминокислотой

<220>

<221> разное

<222> (3)..(3)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<400> 117

Xaa Phe Xaa Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Gly Tyr

1 5 10

<210> 118

<400> 118

000

<210> 119

<211> 9

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (1)..(1)

<223> Xaa может быть любой природной аминокислотой

<220>

<221> разное

<222> (3)..(3)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<400> 119

Xaa Phe Xaa Arg Arg Arg Gln Arg Arg

1 5

<210> 120

<211> 9

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (1)..(1)

<223> Xaa может быть любой природной аминокислотой

<220>

<221> разное

<222> (2)..(2)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<400> 120

Xaa Xaa Phe Arg Arg Arg Gln Arg Arg

1 5

<210> 121

<400> 121

000

<210> 122

<211> 8

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (1)..(1)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<400> 122

Xaa Phe Arg Arg Arg Gln Arg Arg

1 5

<210> 123

<211> 13

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (7)..(7)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<400> 123

Tyr Ser Ser Trp Ser Phe Xaa Arg Arg Arg Gln Arg Arg

1 5 10

<210> 124

<211> 13

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (2)..(2)

<223> Xaa обозначает Бензоил-фенилаланин

<220>

<221> разное

<222> (7)..(7)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<400> 124

Tyr Xaa Ser Trp Ser Phe Xaa Arg Arg Arg Gln Arg Arg

1 5 10

<210> 125

<211> 10

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (1)..(1)

<223> Xaa обозначает Бензоил-фенилаланин

<220>

<221> разное

<222> (2)..(2)

<223> Xaa может быть любой природной аминокислотой

<220>

<221> разное

<222> (3)..(3)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<400> 125

Xaa Xaa Xaa Phe Arg Arg Arg Gln Arg Arg

1 5 10

<210> 126

<211> 9

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (1)..(1)

<223> Xaa обозначает Бензоил-фенилаланин

<220>

<221> разное

<222> (2)..(2)

<223> Xaa может быть любой природной аминокислотой

<400> 126

Xaa Xaa Phe Arg Arg Arg Gln Arg Arg

1 5

<210> 127

<211> 13

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (2)..(2)

<223> Xaa обозначает Бензоил-фенилаланин

<220>

<221> разное

<222> (7)..(7)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<400> 127

Asp Xaa Ser Trp Ser Phe Xaa Arg Arg Arg Gln Arg Arg

1 5 10

<210> 128

<211> 13

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (1)..(1)

<223> Xaa обозначает Бензоил-фенилаланин

<220>

<221> разное

<222> (7)..(7)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<400> 128

Xaa Asp Ser Trp Ser Phe Xaa Arg Arg Arg Gln Arg Arg

1 5 10

<210> 129

<211> 12

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (1)..(1)

<223> Xaa обозначает Бензоил-фенилаланин

<400> 129

Xaa Ser Trp Ser Asp Phe Arg Arg Arg Gln Arg Arg

1 5 10

<210> 130

<211> 12

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (1)..(1)

<223> Xaa обозначает Бензоил-фенилаланин

<220>

<221> разное

<222> (5)..(5)

<223> Xaa обозначает Бензоил-фенилаланин

<220>

<221> разное

<222> (6)..(6)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<400> 130

Xaa Ser Trp Ser Xaa Xaa Arg Arg Arg Gln Arg Arg

1 5 10

<210> 131

<211> 10

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (1)..(1)

<223> Xaa обозначает Бензоил-фенилаланин

<220>

<221> разное

<222> (2)..(2)

<223> Xaa может быть любой природной аминокислотой

<220>

<221> разное

<222> (3)..(3)

<223> Xaa обозначает Бензоил-фенилаланин

<220>

<221> разное

<222> (4)..(4)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<400> 131

Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Arg Arg Gln Arg Arg

1 5 10

<210> 132

<211> 12

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (1)..(1)

<223> Xaa обозначает Бензоил-фенилаланин

<220>

<221> разное

<222> (6)..(6)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<400> 132

Xaa Pro Trp Pro Phe Xaa Arg Arg Arg Gln Arg Arg

1 5 10

<210> 133

<211> 12

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (1)..(1)

<223> Xaa обозначает Бензоил-фенилаланин

<220>

<221> разное

<222> (6)..(6)

<223> Xaa обозначает 2-Naphthyl-alanyl

<400> 133

Xaa Pro Trp Pro Phe Xaa Arg Arg Arg Gln Arg Arg

1 5 10

<210> 134

<211> 12

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (6)..(6)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<400> 134

Phe Pro Trp Pro Phe Xaa Arg Arg Arg Gln Arg Arg

1 5 10

<210> 135

<211> 7

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (1)..(1)

<223> Xaa обозначает Бензоил-фенилаланин

<220>

<221> разное

<222> (6)..(6)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<400> 135

Xaa Cys Trp Arg Phe Xaa Cys

1 5

<210> 136

<211> 8

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (7)..(7)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<400> 136

Tyr Cys Pro Trp Arg Phe Xaa Cys

1 5

<210> 137

<211> 6

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<400> 137

Arg Arg Arg Gln Arg Arg

1 5

<210> 138

<211> 7

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (7)..(7)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<400> 138

Tyr Ser Pro Trp Ser Phe Xaa

1 5

<210> 139

<211> 6

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная

последовательность

<220>

<221> разное

<222> (1)..(1)

<223> Xaa обозначает Бензоил-фенилаланин

<220>

<221> разное

<222> (6)..(6)

<223> Xaa обозначает Циклогексил-аланин

<400> 139

Xaa Ser Trp Ser Phe Xaa

1 5

<---

Иллюстрации к изобретению RU 2 739 201 C2

Реферат патента 2020 года ПЕПТИДЫ И ПЕПТИДОМИМЕТИКИ В КОМБИНАЦИИ С АГЕНТАМИ, ИНГИБИРУЮЩИМИ КОНТРОЛЬНЫЕ ТОЧКИ, ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА

Изобретение относится к способу профилактики или лечения пролиферативного нарушения у млекопитающего. Способ включает введение млекопитающему платина-содержащего лекарственного средства, ингибитора иммунной контрольной точки, содержащего анти-CTLA-4 антитело, анти-PD1 антитело или анти-PD-L1 антитело, и пептидного соединения, содержащего (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (SEQ ID NO:1). Указанное комбинированное лечение показало значительные сокращения роста опухоли по сравнению с млекопитающим, обработанным только указанным платина-содержащим лекарственным средством, или ингибитором иммунной контрольной точки, или их комбинацией. Комбинация платина-содержащего лекарственного средства и пептидного соединения (SEQ ID NO:1) усиливает противоопухолевую активность ингибитора иммунной контрольной точки. 42 з.п. ф-лы, 32 ил., 15 табл., 11 пр.

Формула изобретения RU 2 739 201 C2

1. Способ профилактики или лечения пролиферативного нарушения у млекопитающего, включающий введение млекопитающему платина-содержащего лекарственного средства, ингибитора иммунной контрольной точки и пептидного соединения, причем ингибитор иммунной контрольной точки содержит анти-CTLA-4 антитело, анти-PD1 антитело или анти-PD-L1 антитело, и пептидное соединение содержит (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (SEQ ID NO:1).

2. Способ по п. 1, в котором ингибитор иммунной контрольной точки представляет собой анти-PD1 антитело.

3. Способ по п. 1, в котором ингибитор иммунной контрольной точки представляет собой анти-PD-L1 антитело.

4. Способ по п. 1, в котором ингибитор иммунной контрольной точки представляет собой анти-CTLA-4 антитело.

5. Способ по любому из пп. 1-4, в котором антитело включает подпоследовательность, связывающуюся с CD28, OX40, GITR, CD137 или CD27.

6. Способ по любому из пп. 1-5, в котором антитело включает биспецифическое антитело, связывающееся с одним или более CD28, OX40, GITR, CD137, CD27, HVEM, CTLA-4, PD1, PD-L1, PDL2, VISTA, TIM3, LAG 3 и BTLA.

7. Способ по любому из пп. 1-6, в котором антитело или подпоследовательность включают антитело млекопитающего, человеческое, гуманизированное, приматизированное или химерное антитело.

8. Способ по любому из пп. 1-7, в котором антитело или подпоследовательность включают человеческое или гуманизированное антитело.

9. Способ по любому из пп. 1-8, в котором антитело или подпоследовательность включают Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, Fd, одноцепочечное Fv (scFv), дисульфидсвязанные Fvs (sdFv), V_L, V_H, верблюжий Ig, V-NAR, VHH, триспецифическое (Fab₃), биспецифическое (Fab₂), диатело ((V_L-V_H)₂ или (V_H-V_L)₂), триатело (трехвалентное), тетратело (четырехвалентное), мини-тело ((scF_V-CH3)₂), биспецифическое одноцепочечное Fv (бис-scFv), IgGдельтаCH2, scFv-Fc, (scFv)₂-Fc, аффитело, авимер или нанотело.

10. Способ по любому из пп. 1-9, в котором млекопитающее имеет количество лейкоцитов меньше чем приблизительно 10000 лейкоцитов на микролитр (wbc/мкл) крови.

11. Способ по любому из пп. 1-9, в котором млекопитающее имеет количество лейкоцитов меньше чем приблизительно 9000 лейкоцитов на микролитр (wbc/мкл) крови.

12. Способ по любому из пп. 1-9, в котором млекопитающее имеет количество лейкоцитов от приблизительно 4000 до приблизительно 9000 лейкоцитов на микролитр (wbc/мкл) крови.

13. Способ по любому из пп. 1-9, в котором млекопитающее имеет количество лейкоцитов меньше чем приблизительно 8000 лейкоцитов на микролитр (wbc/мкл) крови.

14. Способ по любому из пп. 1-9, в котором млекопитающее имеет количество лейкоцитов меньше чем приблизительно 7000 лейкоцитов на микролитр (wbc/мкл) крови.

15. Способ по любому из пп. 1-14, в котором пептидное соединение, платина-содержащее лекарственное средство и ингибитор иммунной контрольной точки вводятся в форме композиции или фармацевтического состава.

16. Способ по п. 15, в котором фармацевтический состав содержит фармацевтически приемлемую соль, выбранную из ацетата, сульфоната, сульфата, пиросульфата, бисульфата, сульфита, бисульфита, фосфата, моногидрофосфата, дигидрофосфата, метафосфата, пирофосфата, хлорида, бромида, йодида, пропионата, деканоата, каприлата, акрилата, формиата, изобутирата, капроата, гептаноата, пропиолата, оксалата, малоната, сукцината, суберата, себацината, фумарата, малеата, бутин-1,4-диоата, гексин-1,6-диоата, бензоата, хлорбензоата, метилбензоата, динитробензоатов, гидроксибензоатов, метоксибензоатов, фталатов, ксилолсульфоната, фенилацетата, фенилпропионата, фенилбутирата, цитрата, лактата, γ-гидроксибутирата, гликолята, тартрата, метансульфоната, пропансульфоната, нафталин-1-сульфоната, нафталин-2-сульфоната и манделата.

17. Способ по любому из пп. 1-16, в котором пептидное соединение дополнительно включает молекулу проникновения в клетку, присоединенную к нему или конъюгированную с ним.

18. Способ по п. 17, в котором молекула проникновения в клетку присоединена к пептидному соединению ковалентной связью или пептидным или непептидным линкером.

19. Способ по п. 17, в котором пептид проникновения в клетку включает чередующуюся структуру из полярных/заряженных аминокислот и неполярных гидрофобных аминокислот.

20. Способ по п. 17, в котором пептид проникновения в клетку включает поликатионную или амфифильную структуру альфа-спирали.

21. Способ по п. 1 или 17, в котором пептидное соединение и/или пептид проникновения в клетку включает L- или D-изомер аминокислоты или смесь L- и D-изомеров аминокислот.

22. Способ по п. 17, в котором пептид проникновения в клетку включает последовательность полиаргинина (Arg).

23. Способ по п. 17, в котором пептид проникновения в клетку включает или состоит из (d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg).

24. Способ по любому из пп. 1-23, в котором платина-содержащее лекарственное средство содержит цисплатин, карбоплатин, недаплатин, митаплатин, сатраплатин, пикоплатин, триплатин, мириплатин или оксалиплатин.

25. Способ по п. 24, в котором платина-содержащее лекарственное средство содержит цисплатин.

26. Способ по п. 25, в котором платина-содержащее лекарственное средство содержит карбоплатин.

27. Способ по любому из пп. 1-26, в котором пролиферативное нарушение включает опухоль или рак.

28. Способ по п. 27, в котором пролиферативное нарушение включает метастатическую опухоль или рак.

29. Способ по п. 27 или 28, в котором опухоль или рак включают опухоль или рак легкого.

30. Способ по п. 29, в котором опухоль или рак легкого включают мелкоклеточный или немелкоклеточный рак легкого.

31. Способ по п. 29 или 30, в котором опухоль или рак легкого включают аденокарциному, плоскоклеточный рак или крупноклеточный рак.

32. Способ по п. 27 или 28, в котором опухоль или рак включают карциному, саркому, лимфому, лейкоз, аденому, аденокарциному, меланому, глиому, глиобластому, менингиому, нейробластому, ретинобластому, астроцитому, олигодендроцитому, мезотелиому, ретикулоэндотелиальную, лимфатическую или гематопоэтическую неоплазию, опухоль, рак или злокачественное образование.

33. Способ по п. 32, в котором саркома включает лимфосаркому, липосаркому, остеосаркому, хондросаркому, лейомиосаркому, рабдомиосаркому или фибросаркому.

34. Способ по п. 32, в котором гематопоэтическая неоплазия, опухоль, рак или злокачественное образование включает миелому, лимфому или лейкоз.

35. Способ по п. 27 или 28, в котором опухоль или рак включают неоплазию, опухоль или рак легкого, щитовидной железы, головы или шеи, носоглотки, горла, носа или пазух, мозга, позвоночного столба, молочной железы, надпочечника, гипофиза, щитовидной железы, лимфы, желудочно-кишечного тракта (рот, пищевод, желудок, двенадцатиперстная кишка, подвздошная кишка, тощая кишка (тонкая кишка), толстая кишка, прямая кишка), мочеполовой системы (матка, яичник, шейка, эндометрий, мочевой пузырь, яичко, половой член, предстательная железа), почки, поджелудочной железы, печени, кости, костного мозга, лимфы, крови, мышцы или кожи.

36. Способ по п. 27 или 28, в котором опухоль или рак включают рак молочной железы, рак предстательной железы, рак поджелудочной железы, рак желудка, плевральную мезотелиому, рак ободочной кишки, рак прямой кишки, рак толстой кишки, рак тонкой кишки, рак пищевода, рак двенадцатиперстной кишки, рак языка, фарингеальный рак, рак слюнной железы, опухоль мозга, шванному, рак печени, рак почек, рак желчного протока, рак эндометрия, рак шейки матки, рак тела матки, рак яичника, рак мочевого пузыря, рак уретры, рак кожи, ангиому, злокачественную лимфому, злокачественную меланому, рак щитовидной железы, рак паращитовидной железы, рак носа, рак околоносовых пазух, рак органа слуха, карциному дна полости рта, рак гортани, рак околоушной железы, подчелюстной рак, опухоль кости, ангиофиброму, сетчаточную саркому, рак полового члена, тестикулярную опухоль, педиатрический солидный рак, саркому Капоши, опухоль верхнечелюстной пазухи, фиброзную гистиоцитому, лейомиосаркому, рабдомиосаркому, лимфому, множественную миелому или лейкоз.

37. Способ по любому из пп. 1-36, в котором млекопитающее является человеком.

38. Способ по любому из пп. 1-37, в котором пептидное соединение включает: (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg) или (d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha).

39. Способ по любому из пп. 1-38, дополнительно включающий введение агента, активирующего Т-клетки, млекопитающему.

40. Способ по п. 39, где агент, активирующий Т-клетки, нацеливается на CD28, OX40, GITR, CD137, CD27 или HVEM.

41. Способ по п. 39 или 40, где агент, активирующий Т-клетки, содержит анти-CD28, анти-OX40, анти-GITR, анти-CD137, анти-CD27 или анти-HVEM антитело.

42. Способ по любому из пп. 1-41, где пептидное соединение вводят до, одновременно с или после ингибитора иммунных контрольных точек.

43. Способ по любому из пп. 1-42, дополнительно включающий введение пеметрекседа млекопитающему.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2020 года RU2739201C2

Устройство для закрепления лыж на раме мотоциклов и велосипедов взамен переднего колеса	1924	Шапошников Н.П.	SU2015A1
Устройство для закрепления лыж на раме мотоциклов и велосипедов взамен переднего колеса	1924	Шапошников Н.П.	SU2015A1
Устройство для закрепления лыж на раме мотоциклов и велосипедов взамен переднего колеса	1924	Шапошников Н.П.	SU2015A1
MAHONEY K.M
et al., Combination cancer immunotherapy and new immunomodulatory targets., Nature Reviews, 2015.08, Vol.14, p.561-584
Способ защиты переносных электрических установок от опасностей, связанных с заземлением одной из фаз	1924	Подольский Л.П.	SU2014A1
Способ и приспособление для нагревания хлебопекарных камер	1923	Иссерлис И.Л.	SU2003A1
Колосоуборка	1923	Беляков И.Д.	SU2009A1
МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА ЧЕЛОВЕКА К БЕЛКУ ПРОГРАММИРУЕМОЙ СМЕРТИ 1 (PD-1) И СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ РАКА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ АНТИ-PD-1-АНТИТЕЛ САМОСТОЯТЕЛЬНО ИЛИ В КОМБИНАЦИИ С ДРУГИМИ ИММУНОТЕРАПЕВТИЧЕСКИМИ СРЕДСТВАМИ	2006	Корман Алан Дж. Сринивасан Мохан Ван Чанюй Селби Марк Дж. Чэнь Бин Кардарелли Жозефин М. Хуан Хайчунь	RU2494107C2

RU 2 739 201 C2

Авторы

Кавабе, Такуми

Даты

2020-12-21—Публикация

2016-10-24—Подача

название	год	авторы	номер документа
ПЕПТИДЫ И ПЕПТИДОМИМЕТИКИ ДЛЯ КОМБИНИРОВАННОГО ПРИМЕНЕНИЯ И ЛЕЧЕНИЯ В СУБПОПУЛЯЦИЯХ ПАЦИЕНТОВ С РАКОВЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ	2014	Кавабе Такуми Мине Наоки Саито Наоя Сакакибара Кейити Сато Такудзи	RU2732440C2
ПЕПТИДНЫЙ АНАЛОГ АЦИЛИРОВАННОГО ОКСИНТОМОДУЛИНА	2018	Янг, Джэ-Сунг Ли, Кайунг-Сеок Чэ, Ю-На Баек, Гайе-Рим Ким, Тае-Хайонг Юнг, Илл-Хун Рю, Чэ-Лим Им, Веон-Бин	RU2752787C1
КОНСТРУКЦИИ, ИМЕЮЩИЕ SIRP-АЛЬФА ДОМЕН ИЛИ ЕГО ВАРИАНТ	2016	Понз Хауме Деминг Лаура Гудман Кори Сим Банг Джанет Каудер Стивен Эллиот Вань Хун Ко Трэйси Чиа-Чиэнь	RU2740672C2
ДВОЙНОЙ АГОНИСТ РЕЦЕПТОРОВ ГЛЮКАГОНОПОДОБНОГО ПЕПТИДА-1 И ГЛЮКАГОНА ДЛИТЕЛЬНОГО ДЕЙСТВИЯ	2021	Ян, Чэ-Сон Ли, Кюн-Сок Чхэ, Ю-На Ким, Тэ-Хюн Чон, Илл-Хун Лю, Чхэ-Лим Ли, Тхэ-Юн	RU2799327C1
СОЕДИНЕНИЯ-АГОНИСТЫ GIP И СПОСОБЫ	2015	Шелтон Пернилла Тофтенг Норрегаард Пиа Дерябина Мария Александровна Ларсен Бъярн Дью Фог Джейкоб Улрик	RU2716985C2
УЛУЧШЕННЫЕ ПЕПТИДНЫЕ ЛЕКАРСТВЕННЫЕ СРЕДСТВА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ NASH И ДРУГИХ РАССТРОЙСТВ	2019	Нестор, Джон Дж.	RU2790209C2
АНТИТЕЛО, СПЕЦИФИЧНО СВЯЗЫВАЮЩЕЕСЯ С ICAM-1, И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ	2019	Мун, Ю Ри Джи, Гил Йонг Йун, Сангсун Ким, Джунг Сик	RU2789757C2
ПЕПТИД, ОБЛАДАЮЩИЙ АКТИВНОСТЬЮ БЕЛКА SLURP-1 ЧЕЛОВЕКА, И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ПОДАВЛЕНИЯ РОСТА КАРЦИНОМ И ГЛИОМ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПОДАВЛЕНИЯ РОСТА КАРЦИНОМ И ГЛИОМ, И СПОСОБ ПОДАВЛЕНИЯ РОСТА КАРЦИНОМ И ГЛИОМ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ УКАЗАННОГО ПЕПТИДА	2022	Люкманова Екатерина Назымовна Шенкарев Захар Олегович Шулепко Михаил Анатольевич Бычков Максим Леонидович Кульбацкий Дмитрий Сергеевич Кирпичников Михаил Петрович	RU2792364C1
АНТИ-TIGIT АНТИТЕЛА И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ	2016	Гроган, Джейн, Л. Джонстон, Роберт, Дж. Ву, Ян Лянг, Вэй-Чинг Лупардус, Патрик Ядав, Манеш Сешасайее, Дхайа Хэйзен, Мередит	RU2732591C2
АНТИ-TIGIT АНТИТЕЛА И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ	2016	Гроган, Джейн, Л. Джонстон, Роберт, Дж. Ву, Ян Лянг, Вэй-Чинг Лупардус, Патрик Ядав, Манеш Сешасайее, Дхайа Хэйзен, Мередит	RU2817838C2

Описание патента на изобретение RU2739201C2

Похожие патенты RU2739201C2

Иллюстрации к изобретению RU 2 739 201 C2

Реферат патента 2020 года ПЕПТИДЫ И ПЕПТИДОМИМЕТИКИ В КОМБИНАЦИИ С АГЕНТАМИ, ИНГИБИРУЮЩИМИ КОНТРОЛЬНЫЕ ТОЧКИ, ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА

Формула изобретения RU 2 739 201 C2

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2020 года RU2739201C2

RU 2 739 201 C2