ШТАММ БАКТЕРИЙ PHOTOBACTERIUM PHOSPHOREUM - ПРОДУЦЕНТ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ, УЗНАЮЩЕЙ И РАСЩЕПЛЯЮЩЕЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ НУКЛЕОТИДОВ 5 - GG (T/C)(AG)CC-3' Российский патент 1998 года по МПК C12N9/14 C12N9/14 C12R1/01 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и генной инженерии и касается получения нового штамма, продуцирующего сайт-специфическую эндонуклеазу, способную узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5'-GG(T/C)(A/G)CC-3'.

Рестриктаза такой специфичности может быть использована для исследования первичной структуры ДНК, физического картирования различных геномов. Данная эндонуклеаза является удобной моделью для изучения специфичности белок-нуклеиновых взаимодействий.

Известен штамм Enterobacter cpecies RFL6, продуцирующий рестриктазы Ese6 I и Ese6 II (сайты узнавания 5'-CCGCGG-3' и 5'-CCWGG-3' соответственно [1]. Недостатком данного штамма является то, что в одной биомассе находятся две рестриктазы. Это затрудняет процедуру очистки, причем ни одна из рестриктаз не способна узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5'-GG(T/C)(A/G)CC-3'. Культуральные и биотехнологические свойства штамма не опубликованы.

Известен штамм Bacillus aneuri nolyticus, продуцирующий рестриктазу Ban I (сайт узнавания 5'-GG(T/C)(A/G)CC-3') [2]. Штамм растет при 30^oC на традиционных средах. Основным недостатком данного штамма является то, что помимо Ban I он продуцирует рестриктазу Ban II и Ban III. Это затрудняет процедуру выделения из данного штамма чистого фермента с нужной специфичностью.

Наиболее близким к заявляемому штамму - прототипу, является штамма Herpetosiphon giganteus, продуцирующий рестриктазу Hig HI, узнающую и расщепляющую последовательность нуклеотидов. 5'-GG(T/C)(A/G)CC-3' [3]. Для культивирования этого штамма требуется традиционные среды. Недостатком данного штамма является то, что выход рестриктазы не превышает 500 ед/г сырой биомассы. Кроме того, выделение затруднено наличием двух интерферирующих эндонуклеазных активностей: Hgi H II и Hgi H III.

Технической задачей изобретения является получение штамма, продуцирующего единственную рестриктазу, узнающую и расщепляющую нуклеотидную последовательность 5'-GG(T/C)(A/G)CC-3', с высоким выходом фермента.

Поставленная цель достигается выявлением и использованием штамма Photobacterium phosphoreum 14 - продуцента сайт-специфической реструктазы Pph14 I.

Предлагаемый штамм выделен из морской воды в результате поиска продуцентов рестриктаз.

Полученный штамм Photobacterium phosphoreum14 депонирован в ВКПМ ВНИИ генетика под регистрационным номером В-6667, а продуцируемая им рестриктаза названа Pph14 I согласно общепринятой номенклатуре.

Штамм Photobacterium phosphoreum характеризуется следующими признаками:
Морфологические признаки.

Клетки палочковидные, короткие, прямые, 0,8 - 1,3•2 - 2,4 мм, подвижные. В старой культуре при неблагоприятных условиях роста наблюдаются плеоморфные формы. Окраска по Граму - грамотрицательны.

Культурные признаки.

Штамм не требователен к факторам роста, хорошо растет на обычных питательных средах (СПА, МПА, МПВ) с добавлением NaCl до концентрации 2 - 3%. Все добавления NaCl рост отсутствует. На агаризованных средах образует круглые, непигментированные, плоские колонии, блестящие, с ровным краем.

Оптимальная температура роста 30^o, pH 7,0 - 7,2.

Культуру поддерживают пересевом на плотных средах, хранят в растворе глицерина при 70^oC или в лиофильно-высушенном состоянии.

Физические признаки.

Восстанавливает нитраты, положителен в реакции Фогес-Проскауэра; не гидролизует крахмал, желатин, каталазоположителен, растет при концентрации NaCl до 4% и при 4^oC, на среде с пептоном образует аммиак, не наблюдали роста в анаэробном агаре, индолотрицателен; не образует сероводород.

Для культивирования Photobacterium phosphoreum B-6667 применяют среду следующего состава (г/л): рыбный гидролизат 37, NaCl до 25, вода дистиллированная остальное. Культивирование проводят при 30^oC и интенсивной аэрации до достижения фазы замедления роста.

Выход целевого фермента: 10000 ед/г сырой биомассы с удельной активностью 20000 ед/мл.

Определяющим отличием предлагаемого штамма от штамма-прототипа являются: наличие единственной эндонуклеазы рестрикции; высокая продуктивность штамма в 20 раз превышающая по данному показателю штамм-прототип.

Поскольку предлагаемый штамм получен впервые и для выделения рестриктазы, имеющей сайт узнавания 5'-GG(T/C)(A/G)CC-3', никогда не использовался, можно сделать вывод о соответствии предлагаемого штамма критериям изобретения "новизна" и "изобретательский уровень".

На чертеже представлена электрофорограмма продуктов гидролиза ДНК фаза лямбда ферментом Pphi14 I (доп. 1), Pphi14 I и Ban I (New England Biolabs, сайт узнавания 5'-GG(T/C)(A/G)CC-3') (доп. 2), Ban1 I (доп. 3), фаг лямбда (доп. 4).

Как видно из представленного чертежа, идентичность полос расщепления при параллельном и совместном гидролизе подтверждает их изошизомерию.

Пример 1. Получение биомассы и выделение фермента.

Перед началом работы клетки штамма-продуцента пересевают бактериологической петлей на агаризованную среду. Чаши Петри помещают в термостат на 30^oC. После 10-часовой инкубации подросшие клетки пересевают в колбы со свежей питательной средой, состоящей из (г/л): рыбный гидролизат 37, NaCl 25, вода дистиллированная остальное. Культивирование проводят при 30^oC с аэрацией 1,5 об/мин, при перемешивании 150 об/мин, до фазы замедления роста. Клетки собирают центрифугированием при 1500 г и температуре 4^oC. Дезынтеграцию, выделение и очистку проводят по методике Bickle, Pirotta, Imber [4].

Пример 2. Определение специфичности и активности фермента.

Специфичность фермента определяется по картинке параллельно и совместного гидролиза субстратной ДНК (см. чертеж). Идентичность картин гидролиза на 1 - 3 дорожках говорит о том, что эти ферменты узнают и расщепляют одинаковую последовательность нуклеотидов 5'-GG(N/C)(A/G)CC-3'.

Выход фермента Pph14 I определяется по электрофоретической картинке гидролиза ДНК фага лямбда. За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкл ДНК фага лямбда в течение 1 ч при температуре 37^oC. Выход фермента составляет 10000 ед/г сырой биомассы, удельная активность 20000 ед/мл. Фермент хранится при -20^oC в глицерине.

Таким образом, получен штамм, обладающий следующим преимуществом по сравнению с известным: наличие единственной эндонуклеазы рестрикции; высокая продуктивность штамма.

Поскольку рестриктаза Pphi14 I имеет сайт узнавания 5'-GG(T/C)(A/G)CC-3', идентичный сайту узнавания рестриктазы HgiH I, она может заменить прототип во всех генно-инженерных работах.

Использование: микробиология и биотехнология. Сущность изобретения: предложен новый штамм Photobacterium phosphoreum ВКПМ В-6687 - продуцент рестриктазы Pph14 1, выделенный из морской воды в результате поиска продуцентов рестриктаз. Положительный эффект: выход фермента составляет 10000 ед/г сырой биомассы, удельная активность целевого фермента составляет 20000 ед/мл. Рестриктаза Pph14 1 является изошизомером рестриктазы HgiH 1 и может заменить последнюю во всех генно-инженерных работах. 1 ил.

Штамм бактерий Photobacterium phosphoreum ВКПМ В-6667 - продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'-GG(T/C)(AG)CC-3'.