ШТАММ БАКТЕРИИ DELEYA AQUAMARINA - ПРОДУЦЕНТ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ, УЗНАЮЩЕЙ И РАСЩЕПЛЯЮЩЕЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ НУКЛЕОТИДОВ 5'-GTGCAC-3' Российский патент 1998 года по МПК C12N9/14 C12N9/14 C12R1/01 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и генной инженерии и касается получения нового штамма, продуцирующего сайт-специфическую эндонуклеазу, способную узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5'-GTGCAC-3'.

Рестриктаза такой специфичности может быть использована для исследования первичной структуры ДНК, физического картирования различных геномов. Данная эндонуклеаза является удобной моделью для изучения специфичности белок-нуклеиновых взаимодействий.

Известен штамм Enterobacter species RFL6, продуцирующий рестриктазы Ese I и Ese II (сайты узнавания 5'-CCGCGG-3' и 5'-CCWGG-3', соответственно) [1]
Недостатком данного штамма является то, что в одной биомассе находятся 2 рестриктазы. Это затрудняет процедуру очистки, причем ни одна из рестриктаз не способна узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5'-GTGCAC-3'. Культуральные и биотехнические свойства штамма не опубликованы.

Известен штамм Deleya marina. Это морской штамм, способный продуцировать эндонуклеазу рестрикции Dma I (сайт узнавания 5'-CAGCTG-3') [2] При культивировании используются аэробные условия, температура культивирования 30^oC. Выход эндонуклеазы рестрикции 8.800 ед. на 40 г сырой биомассы. Основными недостатками данного штамма являются то, что выход эндонуклеазы рестрикции невелик (220 ед./г) и то, что он не продуцирует рестриктазы, способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5'-GTGCAC-3'.

Наиболее близким к заявляемому штамму является штамм Vibrio nereis, продуцирующий рестриктазу Vnel [3] прототип. Для культивирования этого штамма требуются традиционные среды. Недостатком данного штамма является то, что выход рестриктазы не превышает 15.000 ед/г сырой биомассы.

Технической задачей изобретения является получение штамма, продуцирующего единственную рестриктазу, узнающую и расщепляющую нуклеотидную последовательность 5'-GTGCAC-3', с высоким выходом фермента.

Поставленная цель достигается выявлением и использованием штамма Deleya aquamarina продуцента сайт-специфической рестриктазы Daq I.

Предлагаемый штамм выделен из морской воды в результате поиска продуцентов рестриктаз.

Полученный штамм Deleya aquamarina депонирован в ВКПМ ВНИИ генетика под регистрационным номером B-6665, а продуцируемая им рестриктаза названа Daq I согласно общепринятой номенклатуре.

Штамм Deleya aquamarina характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Клетки палочковидные или кокковидные, короткие, прямые, 0,7-0,8x1,5-2,0 мкм, подвижные. Преимущественно одиночные. В старой культуре при неблагоприятных условиях роста наблюдается в основном округлые формы. Окраска по Граму грамотрицательны.

Культуральные признаки. Штамм нетребователен к факторам роста, хорошо растет на обычных питательных средах (СПА, МПА, МПБ) с добавлением NaCl до концентрации 2-3% Без добавления NaCl рост отсутствует. На агаризованных средах образует круглые, непигментированные, плоские колонии.

Оптимальная температура роста 28-30^oC, pH 7,0-7,2. Культуру поддерживают пересевом на плотных средах, хранят в растворе глицерина при -70^oC или в лиофильно-высушенном состоянии.

Физиологические признаки. Не гидролизует крахмал, желатин; каталазоположителен; оксидазоположителен. Растет при концентрации NaCl до 4% и при температуре 4^oC. Не наблюдается роста в анаэробном агаре.

Для культивирования Deleya aquamarina B-6665 применяют среду следующего состава (г/л): рыбный гидролизат 37, NaCl до 25, вода дистиллированная - остальное. Культивирование проводят при 30^oC и интенсивной аэрации до достижения фазы замедления роста.

Выход целевого фермента 18.000 ед/г сырой биомассы с удельной активностью 20.000 ед/мл.

Определяющим отличием предлагаемого штамма от штамма-прототипа является высокая продуктивность штамма, превышающая по данному показателю штамм-прототип.

Поскольку предлагаемый штамм получен впервые и для выделения рестриктазы, имеющей сайт узнавания 5'-GTGCAC-3', никогда не использовался, можно сделать вывод о соответствии предлагаемого штамма критериям изобретения "новизна" и "изобретательский уровень".

На чертеже представлена электрофореграмма продуктов гидролиза ДНК фага лямбда ферментом Daq I (дор. 2), Daq I и Vne I ("СибЭнзим", сайт узнавания 5'-GTGCAC-3') (дор. 3), Vne I (дор. 4), фаг лямбда (дор. 1).

Как видно из чертежа, идентичность полос расщепления при параллельном и совместном гидролизе подтверждает их изошизомерию.

Изобретение иллюстрируется примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Получение биомассы и выделение фермента.

Перед началом работы клетки штамма-продуцента пересевают бактериологической петлей на агаризованную среду. Чашки Петри помещают в термостат на 30^oC. После 10-часовой инкубации подросшие клетки пересевают в колбы со свежей питательной средой, состоящей из (г/л):
рыбный гидролизат 37, NaCl 25, вода дистиллированная остальное. Культивирование проводят при 30^oC с аэрацией 1,5 объема/мин, при перемешивании 150 об/мин, до фазы замедления роста. Клетки собирают центрифугированием при 1500 g и температуре 4^oC. Дезинтеграцию, выделение и очистку проводят по методике Bickle, Pirotta, Imber [4]
Пример 2. Определение специфичности и активности фермента.

Специфичность фермента определяют по картине параллельного и совместного гидролиза субстратной ДНК (чертеж). Идентичность картин гидролиза на 1-3 дорожках говорит о том, что эти ферменты узнают и расщепляют одинаковую последовательность нуклеотидов 5'-GTGCAC-3'.

Выход фермента Daq I определяют по электрофоретической картине гидролиза ДНК фага лямбда. За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 1 ч при температуре 37^oC. Выход фермента составляет 18.000 ед/г сырой биомассы, удельная активность 20.000 ед/мл.

Фермент хранится при -20^oC в глицерине.

Таким образом, получен штамм, обладающий более высокой продуктивностью по сравнению со штаммом-прототипом.

Поскольку рестриктаза Daq I имеет сайт узнавания 5'-GTGCAC-3', идентичный сайту узнавания рестриктазы ApaLI, она может заменить прототип во всех генноинженерных работах.

Литература
1. Roberts R. J. Macelis D. Nucl, Acids Res. 1992. V. 20, suppl. P. 2167-2180.

2. Mizuno H. Suzuki T. Yamada Y. Akagawa M. Yamasato K. Agric. Biol. Chem. 1990. V. 54. P. 2863-2867
3. Дегтярев С.Х. Речкунова Н.И. Нетесова Н.А. Чижиков В.Е. Малыгин Э.Г. Кочкин А. В. Михайлов В.В. Рассказов В.А. Биоорг. химия. 1987. Т. 13. С. 422-423.

4. Bickle T. A. Pirotta V. Imber R. Nucl. Acids Res. 1977. V. 4. P. 2561-2572щ

Использование: биотехнология и генна инженерия, может быть использовано для исследования первичной структуры ДНК, физического картирования различных геномов. Сущность изобретения: штамм De leya aguamarina - продуцент рестриктазы Dog 1, выделен из морской воды в результате поиска продуцентов рестриктаз, обеспечивает получение рестриктазы, узнающей и расщепляющей нуклеотидную последовательность 5'-GTGCAC-3'. Выход фермента составляет 18.000 ед/г сырой биомассы, удельная активность целевого фермента составляет 20.000 ед/мл. Рестриктаза Dag 1 является изошизомером рестриктазы и может заменить последнюю во всех генноинженерных работах. 1 ил.

Штамм бактерии Deleya aquamarina ВКПМ В-6665 продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'-GTGCAC-3'.