Штамм перевиваемых клеток мозга эмбрионов ARVIcoLa теRRеSтRIS для репродукции поксвирусов Советский патент 1990 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к области экспериментальной биологии и может быть использовано для генетических исследований вирусов.

Целью изобретения является получение стабильного штамма перевиваемых клеток водяной полевки, свободного от контаминантов, культивируемого 1га доступных питательных средах, обеспечивающего репродукцию вирусов, поражающих водяные полевки.

Штамм перевиваемых клеток мозга эмбрионов водяной полевки (МЭВЦ) получает трипсинизацией мозга пяти эмбрионов от одной самки водяной полевки (Arvicola terrescris). Эмбрионы извлекают с соблюдением правил асептической работы и помещают в стерильную чашку Петри с раствором Эрла, содержащим пенициллин и

стрептомицин в десятикратной концен-. традии. Пр.омывают трехкратной сменой того же раствора, переносят эмбрионы по одному г. сухую стерильную чашку Петри. Извлекают головной мозг и переносят его в новую чашку Петри, промыцают раствором Эрла, содержащим 200 мкл/мл пенициллина и 200 мкл/мл стрептомицина. Мозговито ткань пяти эмбрионов измельчают, промывают тем же раствором Эрла, пере- . носят в колбу для трипсинизации, за- лив ают 0,25%-ным раствором трипсина, подогретым до 37°С и оставляют на 5-10 мин при комнатной температуре. Затем трипсин нейтрализуют небольшим количеством сыворотки, клетки осторожно дважды отмывают средой Игла МЕМ, заливают новую порцию среды Игла МЕМ, содержащей 100 мкг/мл канамицина и энергично пиг 1етир1тот.

со

N5

00

Подсчитывают количество жизнеспособных клеток, доводят kx концентрац1-ш до (2-2,5)-10 кл/мл средой Игла MEM, содержащей 10% эмбриональной сьшоротки крупного-рогатого скота 0,6 г/л глютамина, 100 ед/мл кана- мицина.. Разливают суспензию клеток в сосуды для культивирования. Монослой образуется через 48 ч. Через 72 ч клетки пассируют 1:3. Последующие пересевы осуществляют через 3- 4 сут. Клетки снимают смесью 0,02%- нрго версена ( 2/3-4/5) и 0,25%-ного трипсина (1/3-1/5), без центрифуги- ров ания, дважды обмьш монослой прогретой до 36,5°С смесью и проинкубировав в течение 5-10 мин при комнатной температуре. Затем клетки ресус- пендируют в свежей среде Игла МЕМ, содержащей 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, 0,6 г/л глютамина и один из антибиотиков, обладающих антимикоплазменным действием в профилактической дозе.

Штамм перевиваемых клеток- МЭВП депонирован в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток сельскохозяйственных и проныс ловых животных Всесоюзного НИИ экспе риментальной ветеринарии ВАСХШ4Л ВСКК (СХЖ) под номером 21.

Штамм перевиваемых клеток МЭВП ийеет следующие морфологические и кариологические характеристики.

Клетки линии МЭВП имеют морфологию, гяиальных клеток с многочисленными отростками. Иногда встречаются нейроноподобные клеткио Ядра округлой и овальной форм. Ядрышки различной величины и формы от двух до семи в ядре. Морфология клеток культуры на разных уровнях пассаокей сох эаняется. Кариотипический анализ. Распреде лейие числа хромосом определяют подсчетом хромосом в 100 метафазных пластинках. На каждом исследованном пассаже анализируют не менее 20 метафазных пластинок , окрашенных G- методом дифференциального окрашивания хромосом.

. Кариологический анализ показывае что клетки штамма МЭВП сохраняют хр мосомы, характерные для нормального кариртипа до 40 пассажа. Однако уже на 10 пассаже появляются полиплрвд- ные клетки (.14%), на 20 пассаже чис

10

15

20

25

ЗО

зО, - 11928

ло их уменьшается до 4% и возрастает до 35% к 30 пассажу. На 40 пассаже популяция на 65% состоит из-полиплоидных клеток, имеющих 70 хромосом. Хромосомные перестройки не обнаружены.

На 50-м пассаже доля полиплоидных клеток составляет 27%, клетки с 36 хромосомами выделяются в модаль- ный класс.

На 56-м пассаже полиплоидные клетки составляют 14%, Модальный , класс представлен клетками с числом хромосом 36(36%) и 37(31%),

Гетерогенность обусловливается вариацией в числе гомологов по отдельным парам хромо сом. Так, часть клеток популяции содерлшт в первой паре два неперестроениьк гомолога; второй тип клеток - один неперестро- енньй гомолог, второй - с делецией короткого плеча; третий тип клеток содержит три гомолога; два неперестроенных, короткое плечо третьего гомолога делецировано. Почти во всех клетках вторая пара представлена тремя гомологами; наблюдаются потери самых метасих хромосом набора в 15 17-й парах. .

С 72 пассажа начинается стабилизация хромосомного набора культуры« Процент полиплоидных клеток понижается до 27%, клетки с 36 хромосомами становятся преобладающим классом и составляют 55% от всей популяции клеток.

На 90-м пассаже модельный класс составляют клетки с 36 хромосомами (55%) доля полиплоидных клеток (68- 72 хромосомы) равной 11%.

Таким образом, кариотип клеток линии МЭВП псевдодишюидный, т,е сохраняет нормальное диплоидное число (2п 36), но структура кариоти- па этих клеток отличается от нормы. Культуральные признаки. Среда

35

40

45

для культивирования - среда Игла МЕМ, содержащая 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, 0,6 г/л глютамина и 100 ед/мл кана- мицина. Культивирование проводят при 37°С. Посевная доза 1 IQ-.кл/мл. Частота пассирования 3-4 сут. Кратность рассева 1:3-1:6,

I .

Изоферментная ха1)актеристика Сопоставление электрофоретической подвижности глюкозо-6-фосфатдегидрогена 1

зы и лактатдегидрогеназы клеток штамма МЭВП на уровнях 20, 35 пассажей с харатеристикой ферментов в стандартных образцах обнаруясивает наличие изоферментов с идентичной электрофоретической подвижностью. Эти данные подтверждают видовую принадлежность клеток.

Контаминация. При электронно-микроскопическом анализе штамма МЭВП на уровне 10, 70 пассажей посторонних агентов не обнаружено. При изучении в люминесцентном микроскопе препаратов, окрашенных ДНК-флюорохромами контаминанты, не выявлены.

При выделении на селективных средах клетки влтамма МЭВП свободны от вирусной, микоплазменной, гибковой и бактериальной контаминации, на уровнях 10, 65, 90 пассажей.

Хранение клеток штамма МЭВП. Клетки штамма МЭВП хранят в замороженном состоянии в жидком азоте при .

Режим замораживания; снятые со стекла смесью версена. и трипсина и ресуспендированные в свежей среде клетки центрифугируют и ресуспендируют в новой порции ростовой среды, содержащей 10% эмбириональной сыворотки КРС до концентрации (5-10) х X 10 кл/мл. Затем медленно при пос- трянном перемешивании добавляют равный объем свежей ростовой среды, содержащей 10% эмбриональной сыворотки КРС и 20% глицерина. Суспензию разливают по ампулам и заморажива от в смеси спирта и-жидкого азота при понижении температуры на 1 0/мин до -40°С с последующим погружением в хранилище биопродуктов,

Режим восстановления. с клетками после извлечения из жIiдкoгo азота помещают в водяную баню с температурой , постоянно меняя положение ампулы. Суспензию разморожен -- ных клеток переносят в колбу с соблюдением правил асептики. Пор1щями, постоянно перемешивая с интервалом в 1-2 мин, добавляют ростовую среду в количестве, составляющем 0,5; 0,5; 1; 2; 3 части на обьем содержимого ампулы. Затем суспензию пентрифуги- руют, осадок ресуспендируют в свежей ростовой среде, подсчитывают общее количество клеток, долю жизнеспособных и разводят ростовой средой до концентрации жизнеспособных клеток ЫО кл/мл.

8 ,

П р им е р 1. Способ культивирования вируса оспы крыс.

Из культурального сосуда с клетками

щтамма МЭВП на уровне 90-го пассажа удаляют среду культивирования. Ноно- слой клеток дважды ополаскивают подогретой до 36,5 С смесью 0,25%-ного раствора трипсина (1/3-1/5) И).0,02%-г

ного раствора версена (2/3-4/5), Сосуд с клетками помещают в термостат при Зб, на 3-5 мин (до начала отслаиван 1я клеток) . Оставшиеся клетки ресуспендируют в среде роста Игла MEM с 10% змбрирнальной сыворотки КРС и разливают на пять культураль- пых сосудов. Культуру 91-го пассажа инкубируют при 37°С в течение 2 сут до момента формирования сплошного

слоя.

Перед заражением среду из культу- ральных сосудов сливают, клетки дважды отмывают раствором Эрла и вводят 1 мл среды, содержащей З Ю ОСЕ

вируса. KoirraKT осуи(ествляют при в течение 1 ч. Затем монослой трижды отмывают раствором Эрла для удаления неадсорбировавшегося вируса, залиишот средой Игла МЕМ с 2%-ной

эмбриональной сыворотки КРС и инкубируют при 37°С. Сбор вируса производят через 72 ч после заражения. Клеточную культуру дваядт,ы замораживают и оттаивают для освоботкдения внутриклеточного вируса в поддерживающую среду и определяют титр вируса по образованию 6jmiiieK а культуре клеток CER, Титр равен 6,2+0,5 Ig БОЕ/мл. При к шьтивировании вируса в клетках

линий ВПК-21 (с 13) и Vero его титр равен 5,2iO,5 Ig БОЕ/мл и 5,9±0,5 Ig БОЕ/МЛ соответственно.

П р и м е р 2. Способ культивирования поксвируса водяной полевки.

Монослой клеток МЭВП на уровне 95 пассажа получают по способу, описанному в примере 1, инфицируют поксви- русом водяной полевки в дозе 3 х X Ю СОЕ, титр вируса при культипировании составляет 5,9+0,5 Ig БОЕ/мл,. При культивировании вируса на клетках линий ВПК-21 (с13).и Vero титр равен 4,8±.0,5 Ig БОЕ/мл и 5,4+ Ю,5 Ig БОЕ/МЛ соотвественно.

Результаты репродукции вирусов оспы крыс и водяных Полевок 135 в различных культурах клеток представлены в таблице.

Таким образом, штамм может быть использован для рейродукции и изучения вирусов, поражающих водяных полевок.

Формула изобретения

Штамм перевиваемых клеток мозга эмбрионов Arvieola terrestris ВСКК | (СХЖ) К 21, для репродукции поксвирусов.

Изобретение относится к экспериментальной биологии и может быть использовано для генетических исследований вирусов. Целью изобретения является получение стабильного штамма перевиваемых клеток водяной полевки, свободного от контаминантов, культивируемого на доступных питательных средах, обеспечивающего репродукцию вирусов, поражающих водяные полевки. 1 табл.

Культура клеток

Титры вируса в Ig БОЕ/мл

Оспа крыс

5,2+0,5 5,9+0,5 6,2+0,3

Вирус водяных полевок штамм 135

А,8+0,5 5,4+0,5 5,9+0,5