Штамм бактерий BRUceLLa авоRтUS, используемый для приготовления вакцины против бруцеллеза крупного рогатого скота Советский патент 1991 года по МПК C12N1/20 A61K39/10 

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к биологическим препаратам, и может быть использова- но для приготовления вакцины против бруцеллеза крупного рогатого скота.

Одним из средств для успешной профилактики бруцеллезной инфекции является применение в комплексе противобруцел- лезных мер средств специфической профилактики бруцеллеза.

В настоящее время для изготовления противобруцеллезной вакцины применяются штаммы бруцелла абортус № 19 и шт. № 82.

Штамм № 19 по культурэльным признакам является стойким вариантом Brucetla abortus, хорошо растет на обычных питательных средах, умеренно продуцирует сероводород, растет на средах с основным фуксином 1:50000 и 1:100000 и не растет на средах в тех же разведениях, но с добавлением тионина, проявляет высокую чувствительность к пенициллину. Обладает сравнительно высокой иммуногенностью (75-80%).При окраске колоний по У-Вилсону шт.№ 19 и полевых штаммов колонии в 3-6- суточном возрасте имеют фиолетовый ободок и светло-желтый центр а колонии R-штаммов - синий цвет

К недостаткам известного штамма следует отнести то, что штамм №19 Brucella abortus высокоагглютиногенен. обладает длительной приживаемостью в организме

ч

О

СА

ммунизированных животных (5-8 лет), облаает остаточной вирулентностью, абортогенно- тью. Отсутствие способа дифференциации не позволяет применять его на взрослом погоовье скота в очагах инфекции и в угрожаеых по бруцеллезу стадах.

Вакцина из шт, № 82 Brucella abortus - ивая, слабоагглютиногенная, обладет им- муногенностью 75-100% на морских свинках, зараженных через 5 мес после их ммунизации.

У шт. № 82 при окраске по У-Вилсону на -й сутки роста колонии мелкие и имеют иолетовый ободок и светло-желтый центр, на 4-й день у них появляется исчерченность и включения в центре, к 5-6-му дню колонии при окраске становятся синими.

При на среду с агаром в чашках Петри образует колонии SR-формы, кругые, гладкие, прозрачные с голубоватым отенком.

Агглютинирует в растворах S- и R-cne- цифических бруцеллезных сывороток, дает слабую пробу в трипафлавине, термоагглютинация слабая или не агглютинирует.

Растет на средах с фуксином 1:50000 и не растет с тионином (1 ;25000). При росте на агаре образует сероводород. Обладает слабыми йгголютиногенными и вирулентными свойствами. Однако штамм № 82 Brucella abortus в SR-форме не стабилен, абортоге- нен (10-20% абортов у стельных коров и нетелей). Культура шт. N° 82 в образцах производственных серий вакцины характеризуется неоднородностью формы колоний, антигенные свойства субкультур генетически не закреплены, субкультуры в S-, SR- и R-формах имеют различную вирулентность. У 0,4-0,8% вакцинированных животных сохраняются поствакцинальные реакции на длительный период.

Целью изобретения является получение штамма бруцелла абортус, обладающего стабильными свойствами, безвредностью и высокой иммуногенностью.

В результате отбора и исследований был селекционирован штамм бруцелла абортус 75/79-А, отвечающий основным требованиям вакцинного штамма бруцеллеза крупного рогатого скота. Штамм Brucella abortus 75/79-А депонирован в коллекции Всесоюзного Государственного научно-исследовательского института ветеринарных препаратов под номером 75/79-А(35).

Штамм 75/79-А бруцелла абортус - диссоциированный штамм в SR-форме, выделен из высева надвымянного лимфоузла реагирующей на бруцеллез коровы в виде колоний бруцелла абортус в анаэробных условиях на 7-е сутки инкубации в термостате

Полученной из заявляемого штамма вакциной прививают крупный рогатый скот {например, стельных телок) в дозе 100 млрд микробных клеток.

Селекционированный штамм бруцелла

абортус 75/79-А имеет следующие морфологические, культурально биохимические характеристики.

Морфологические признаки. Штамм

бруцелла абортус 75/79-А - это очень мелкие микроорганизмы, в микроскопических препаратах встречаются одновременно в кокковидных и палочковидных формах, при окраске по Козловскому окрашиваются в

красный цвет, хорошо растет на твердых питательных средах: мясопептонном печеночном глюкозо-глицериновом агаре, печеночном глюкозо-глицериновом агаре как с добавлением перевара Хоттингера так и

без него.

Культура л ьно-биохимичес кие признаки. Штамм 75/79-А полностью (75-100%) агглютинируется S- и R-бруцеллезными сыворотками, не агглютинируется с физраствором, дает положительную реакцию (++++) в пробе с акрифлавином. положительную или слабоположительную реакцию тер- моагглютинации. На агаре в чашках популяция однородная, колонии ровные.

гладкие, выпуклые, блестящие. При окраске по Уайт-Вилсону 3-4-суточные колонии культуры исходного штамма и 5-го пассажа через организм морской свинки, выращенные на косяках агара Щелковского биокомбината, ВГНКИ и Алтайской НИВС, окрашиваются однородно в основном (до 80%) как SR-форма (по сине-фиолетовому фону желтая исчерненность по диагонали, середине, иногда по периметру колоний

ближе к краю), 5-20% колоний - как RS-фор- ма. R- и S-формы колоний в популяции не наблюдались.

Штамм и его субкультура хорошо растет на средах с тионином и фуксином 1:50 тыс

(++), не чувствителен к зритритолу и натриевой соли бензилпенициллина в концентрации до 50 ЕД в 1 мл среды Продуцирует HsS (1-29 мм).

По морфологическим, культуральным.

агглютинабельным свойствам, реакции термоагглютинации и пробе с акрилфлавином штамм 75/79-А представляет собой диссо- циант бруцелл, аналогичный штамму

Brucella abortus fe 82. Отличием изучаемого штамма от последнего является относительная однороднсть популяции и отсутствие в ней микробных клеток, образующих на 3-4-е сутки инкубирования колоний в S-или R-фор- ме.

П р и м е р 1. Приживаемость и возможность миграции штамма 75/79-А (5-й пассаж) изучены в опыте на 50 морских свинках, 25 из которых были иммунизированы в дозе 1 млрд. микробных клеток исодер- жались вместе с непривитыми в течение 4 мес. Морских свинок по 5 голов из каждой группы убивали через 15,30,60,90.120 дней и проводили бактериологическое и серологическое исследования материала на бру- целлез.

В результате проведенных исследований установлено, что штамм 75/79-А приживается в организме иммунизированных морских свинок в генерализованной форме в течение 60 дней.

При серологическом исследовании в РБП, РА, РСКс биофабричными антигенами и в РСК с R-антигеном КВИ сывороток крови от иммунизированных морских свинок по- ложительная реакция с биофабричным антигеном была получена только у одного животного через 60 дней в РБП и СК в титре 1:20. В РСК с R-антигеном КВИ все морские свинки положительно реагировали с 15 дня до 60 в титрах 1:5-1:80. Через 90 дней отмечена положительная РСК в титре 1:5 у двух морских свинок из пяти, через 120 дней все животные утратили серопозитивность к R- антигену. При совместном содержании в те- чение 120 дней иммунизированных морских свинок и животных контрольной группы не установлено явление миграции изучаемого штамма, что подтверждается результатами бактериологического и серологического ис- следований.

П р и м е р 2. Остаточная вирулентность и агглютинабельные свойства штамма 75/79-А (5 пассаж) изучали в опыте с ВГНКИ на 90 морских свинках в сравнении со штам- мами Kb 82 и вирулентным шт. Brucella abortus 54, Животных иммунизировали взвесью двухсуточных агаровых культур в дозах 10, 100, 1 тыс., 10 тыс. и 1 млрд. микробных клеток по оптическому стандарту мутности. Морских свинок убивали через 20 и 40 дней,проводя бактериологическое и серологическое исследования на бруццелез, отмечая в эти сроки видимые патолого-ана- томические изменения в лимфоузлах и орга- нах животных, вычисляя индекс селезенки.

В результате проведенных исследований установлено, что штамм 75/79-А обладает низкими вирулентными свойствами, так как в указанные строки генерализовано расселяется в организме морских свинок. привитых только в дозе 1 млрд.м.клеток,-а приживается а дозе от 1 тыс.м.клеток, в то время как шт. № 82 - от 10 микробных клеток.

При серологическом исследовании в РБП, РА и РСК на бруцеллез в сыворотке крови морских свинок, привитых разными дозами культуры штамма Brucella abortus 75/79-А, отсутствовали антитела, выявляемые антигенами биофабричного производства. В РСКс R-антигеном в первый срок убоя выявлены специфические антитела у всех морских свинок, иммунизированных в дозе 1 млрд.м.клеток (титр 1:10-1:20), через 40 дней в аналогичной группе положительно реагировали все животные в высоком титре (1:40), в остальных группах - по 1-3 м.свинки в титре 1:5.

П р и м е р 3. Безвередность (абортоген- ность) штамма 75/79-А изучена на 8 беременных морских свинках, привитых 1, 2, 7 5, 10 млрд.м.клеток суспензией двухсуточной агаровой культуры исходного штамма и его пассажей. За период наблюдения в сроки 15, 20, 30, 60 сут перечисленные дозы штамма аборта не вызывали, а при послеу- бойном вскрытии из полостей маток 8 бере- менных морских свинок извлечено 26 сформировавшихся плодов.

П р и м е р 4. Абортогенность и агглюти- ноггеность штаммов 75/79-А и шт. № 82 изучены на 9 (2-3 мес. стельности) телках, иммунизированных в дозе 100 млрд.микро- бных клеток каждого штамма.

За 7 мес. опыта установили следующее.

В группе телок (4 головы), иммунизированных 100 млрд. микробных клеток двухсуточной суспензии штамма 75/79-А, аборта не отмечалось. Все телки, иммунизированные суспензией штамма 75/79-А, благополучно растелились, а из 5 телок, иммунизированных штаммом N 82 в дозе 100 млрд.м.к. биофабричной вакцины, через 2 мес после иммунизации одна телка абортировала.

Результатами серологических исследований сывороток крови животных обоих групп в сроки 12 дней, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 мес после иммунизации установлено, что у телок опытной группы все реакции с биофабричными антигенами дали отрицательные результаты исследований на бруцеллез через 2 мес после иммунизации, в РСК с R-антигеном 16/4 ИЭВСиДВ через 3 мес, тогда как из 5 телок, иммунизированных шт. № 82, у одной сохранились реакции в РСК со стандартным антигеном (в титре 1:10++++и РСК с R-16/4 антигеном ИЭВСиДВ 1:40++++).

П р и м е р 5. Иммуногенность штамма 75/79-А на морских свинках высокая и колеблется от 66,6 до 100% при заражении через 3,5 мес. после их иммунизации. В опытах при апробации штамма совместно с ВГНКИ на 94 морских свинках иммуногенность штамма 75/79-А (5 пассаж на морских свинках) в дозе 2 млрд. микробных клеток составила 88,8% при индексе инфицирован- ности (ИИ) 8,3, у штамма № 82 в той же дозе иммунитет составил 65% (ИИ 20,0), у шт. N 19 в дозе 1 млрд.м.к. иммуногенность составила 84,2% при ИИ 11,5.

Использование штамма 75/79-А(35) Brucella abortus в качестве противобруцел

лезной вакцины позволит применить ее в комплексе мер по профилактике бруцеллеза крупного рогатого скота любого возраста и без учета стельности,

Формула изобретения Штамм бактерий Brucella abortus ВГНКИ №75/79А(35), ипользуемый для приготовления вакцины против бруцеллеза крупного рогатого скота.

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к получению биологических препаратов, и может быть использовано для приготовления вакцины против бруцеллеза крупного рогатого скота. Целью изобретения является штамм бру- целла абортус, обладающий стабильными свойствами, безвредностью и высокой им- муногенностью. Штамм бактерий Brucella abortus Ns 75/79A (35) депонирован в коллекции Всесоюзного государственного научно- исследовательского института ветеринарных препаратов. Использование штамма Brucella abortus 75/79A(35) в качестве противобру- целлезной вакцины позволяет использовать ее в комплексе мер по профилактике бруцеллеза крупного рогатого скота любого возраста, без учета периода стельности. СП с