СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОГО ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА, ОБЛАДАЮЩЕГО ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ И АМИЛОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЯМИ Российский патент 1995 года по МПК C12N11/00 A61K9/20 

Изобретение относится к биотехнологии (способу получения иммобилизованной оразы) и может быть использовано в медицине при ряде патологических и амилолитических ферментов в желудочно-кишечном тракте.

Для устранения нарушений в процессах гидролиза и всасывания пищи в целях заместительной терапии применяют различные ферментные препараты, например солизим липазу из Pen. solitum, сомилазу комплекс милаз из Pen. solitum; α-амилазу из Bac. subtilis и оразу на основе комплекса протеолитических и литических ферментов из Asp. oryzee.

Одной из причин низкой эффективности ферментов для заместительной терапии считается их инактивация в желудочно-кишечном тракте, особенной под действием кислого содержимого желудка и температурных воздействий.

Для защиты фермента от инактивирующего воздействия проведена модификация амилолитического фермента водорастворимым сополимером винилпирролидона и акролеина [1]
Однако при взаимодействии α-амилазы с полимером, содержащим альдегидные группы, образуются азометиновые связи, легко гидролизующиеся в кислой среде, поэтому при данном способе иммобилизации в условиях желудочно-кишечного тракта наблюдается быстрая инактивация фермента. Кроме того, не увеличивается термоустойчивость полученного препарата.

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения иммобилизованного протосубтилина [2] согласно которому раствор ферментного препарата смешивают с раствором полиэтиленоксида с М.М. 600-2000 кД в соотношении 1: 7,5-1: 8,5, полученную смесь фермента с носителем подвергают обработке γ-лучами в дозе 2,3-2,7 мрад.

Общими признаками прототипа и пpедлагаемого изобретения являются:
использование полиэтиленоксида;
осуществление связывания радиохимическим воздействием ( γ-обработка);
иммобилизация фермента, обладающего протеолитической и амилолитической активностью.

Причины, по которым по прототипу не может быть достигнут предлагаемый технический результат:
отсутствие в данной композиции дренирующего материала (пшеничных волокон);
водорастворимость иммобилизованного препарата;
низкая устойчивость при кислых значениях рН, что не позволяет получить стабильные при кислых значениях рН препараты (а именно такие рН в желудочно-кишечном тракте).

Так в способе [2] при рН 6,0 сохраняется 47% максимальной активности, при рН 3,0 иммобилизованный протосубтилин полностью теряет свою активность в течение 20 мин;
кроме того, в этом решении нет данных о комплексном сохранении протеолитической и амилолитической активности;
иммобилизован протосубтилин препарат, который в отличие от оразы не рекомендован для заболеваний, связанных с желудочно-кишечным трактом.

Предлагаемое изобретение предназначено для получения препарата (иммобилизованной оразы), используемого в целях заместительной терапии.

Использование изобретения позволяет достигнуть следующий технический результат:
получить закрепленный ферментный препарат оразу с комплексным сохранением как протеолитической, так и амилолитической активности (73-75% исходной протеолитической и 80-85% исходной амилолитической активности), не теряющих активности при γ-стерилизации (сохраняется 60% протеолитической и 90% амилолитической активности);
получить препарат, отличающийся устойчивостью в кислой среде;
обеспечить создание пролонгированного концентрационного градиента;
использование в качестве носителя пищевых волокон приводит к регулированию гомеостаза.

Предлагаемый способ иммобилизации оразы включает пропитку предварительно промытых водой пищевых волокон из пшеничных отрубей 20%-ный раствором полиэтиленоксида с растворенной в нем оразой (рН 7,0) при массовом соотношении пищевые волокна: ораза 1:(0,3-0,6), перемешивание, высушивание препарата при комнатной температуре, γ-облучение дозой 2,5 мрад.

Новым в предлагаемом способе является использование пшеничных отрубей в качестве носителя в сочетании с полиэтиленоксидом.

Причинно-следственная связь между совокупностью предлагаемых признаков и достижением технического результата состоит в следующем:
γ-облучение смеси пищевых волокон, полиэтиленоксида и оразы образует закрепленные на твердой матрице (пищевых волокнах) комплекса оразы, т.е. производит более жесткое закрепление оразы, которое, учитывая ионообменные свойства пищевых волокон, приводит к стабилизации оразы при кислых значениях рН. Так, если для нативной оразы рН-оптимум протеолитической активности 5,5, то для иммобилизованной он расширен до 4,5-6,5. Если нативный препарат и препарат, иммобилизованный по способу-прототипу, при 37^оС, рН 3,0 теряет полностью свою активность в течение 50 и 20 мин соответственно, то иммобилизованный предлагаемым способом сохраняет 88% активности в течение 150 мин и 25% исходной активности в течение 300 мин.

В отличие от известного применения полиэтиленоксида для целей иммобилизации протеолитических ферментов на угольных материалах с использованием буры (авт. св. СССР N 1596769), где включение фермента происходило благодаря сшивке бурой, закрепление происходило γ-облучением.

Таким образом, резюмируя вышесказанное, можно заключить:
Предлагаемый способ позволяет получить закрепленный ферментный препарат оразу с комплексным сохранением как протеолитической, так и амилолитической активности.

Получить препарат, отличающийся устойчивостью в кислой среде.

Обеспечить создание пролонгированного концентрационного градиента, так как в отличие от растворимого в воде иммобилизованного по прототипу [2] протосубтилина, иммобилизованная по предлагаемому способу ораза отличается пониженной растворимостью.

Согласно заключению НИИ гигиены питания Республиканского научно-гигиенического центра Минздрава Украины иммобилизованная на пищевых волокнах ораза проявляет наиболее существенный клинический эффект и может быть рекомендована для лечения больных, страдающих хроническим холециститом с сопутствующим гастритом и склонностью к запорам.

Способ осуществляется следующим образом.

Предварительно промытые водой пищевые волокна из пшеничных отрубей пропитывали 20% -ным раствором полиэтиленоксида с растворенной в нем оразой (рН 7,0). Препарат перемешивали, высушивали при комнатной температуре, затем подвергали γ-облучению дозой 2,5 мрад. До и после γ-облучения определяли амилолитическую и протеолитическую активность, рН-оптимум, устойчивость при кислых значениях рН и повышенной температуре.

В качестве пищевых волокон использовали пищевые волокна пшеничных отрубей, полученных кислотным методом, разработанным в Одесском технологическом институте пищевой промышленности. Ораза производства завода ферментных препаратов (г.Вышний Волочек). Использовали 20%-ный водный раствор полиэтиленоксида 400. Амилолитическую и протеолитическую активность определяли согласно (В. Ф. Рудюк, А.М.Корчагина. Оптический метод определения активности оразы. Фармация, 1982, 31, N 3, с.63-64).

Амилолитическую активность выражали количеством крахмала, расщепленного 1 г препарата за 1 мин.

За единицу протеолитической активности принимали такое количество фермента, которое за 1 мин при 37^оС катализирует расщепление казеина до неосаждаемых трихлоруксусной кислотой продуктов, содержание которых выражается в микромолях тирозина.

Облучение проводили дозой 2,5 мрад.

П р и м е р 1. 1 г высушенных пищевых волокон из пшеничных отрубей пропитывали 4 л 20%-ного раствора полиэтиленоксида 400 растворенной в нем оразой (0,5 г). Препарат тщательно перемешивали и высушивали при комнатной температуре. Затем подвергали γ-облучению дозой 2,5 мрад. До и после γ-облучения определяли протеолитическую и амилолитическую активность, она составляет до γ-облучения 73 и 85% от исходной соответственно, после γ-облучения 60 и 88% (табл. пример 4). Для иммобилизованной оразы рН-оптимум (по протеолитической активности) 4,5 и 5,0 (по амилолитической активности). Для нативного препарата рН-оптимум протеолитической и амилолитической активностей 6,5 и 6,0 соответственно. При рН 3,0 (температура 37^оС) в течение 150 мин иммобилизованный препарат сохраняет 88% а в течение 300 мин 25% тогда как нативный препарат и препарат, иммобилизованный по способу-прототипу, при 37^оС теряет полностью свою активность в течение 50 и 20 мин.

П р и м е р ы 2-4. Иммобилизация проводилась аналогично примеру 1, только соотношения пищевые волокна: ораза составляют 1:0,3, 1:0,4, 1:0,6 (табл. примеры 2, 3, 5). Примеры иллюстрируют осуществимость способа при указанных соотношениях.

П р и м е р 5. Иммобилизация проводилась аналогично примеру 1, только соотношение пищевые волокна: ораза составляет 1:0,2 (табл. пример 1). Так как при этом сохраняется 54% исходной протеолитической активности и 67% амилолитической активности, проводить иммобилизацию при таком соотношении нецелесообразно.

Использование: биотехнология и может быть использовано в медицине при ряде патологических процессов, связанных с недостаточным количеством протеолитических и амилолитических ферментов в желудочно-кишечном тракте. Сущность изобретения: способ позволяет получить стабильные в кислой среде препараты, при этом в качестве носителя ферментного препарата оразы используют волокна пшеничных отрубей с закреплением фермента полиэтиленоксидом с последующим γ -облучением, соотношение носитель: ораза составляет 1 : (0,3 - 0,6). 1 табл.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОГО ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА, ОБЛАДАЮЩЕГО ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ И АМИЛОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЯМИ, предусматривающий взаимодействие раствора исходного ферментного препарата с носителем полиэтиленоксидом и последующее облучение смеси γ -лучами в дозе 2,5 мрад, отличающийся тем, что в качестве исходного ферментного препарата используют ферментный препарат оразу, а перед g -облучением полученной смесью пропитывают волокна пшеничных отрубей, используемых в качестве носителя фермента.