СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ПНЕВМОЦИСТОЗА Российский патент 1995 года по МПК G09B23/28 

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к инфектологии и паразитологии, к способам создания модели пневмоцистоза.

Модель пригодна для скрининга антипневмоцистных препаратов, изучения взаимоотношений в системе паразит-хозяин и выяснения особенностей патогенеза диссеменированых и смешанных инфекций.

Пневмоцистоз человека, вызываемый Pneumocystis carinii, относится к оппортунистическим инфекциям, развивающимся на фоне ослабления резистентности организма хозяина и тем самым отягощающим состояние здоровья больных гематологического и онкологического профиля, ослабленных недоношенных детей, лиц с эндокринной патологией, тяжелыми изменениями гормонального статуса, больных пожилого и старческого возраста с хроническими заболеваниями и возрастной инволюцией иммунной системы, реципиентов трансплантированных органов. Пневмоцистоз часто поражает больных с ВИЧ-инфекцией. По данным центра по контролю за болезнями (США), пневоцистная пневмония встречается у 65-85% больных СПИДом, являясь для них основной причиной летальных исходов.

Моделирование пневмоцистной инвазии на лабораторных животных начали проводить с 1955 г. (Weller R. Zur Erzeugung von Pneumocysro sen in Tierversach. Z. Kinderheilkit, 1955, 76, 366-378; Weller R. Weitere Untersuchungen uber experimente Rattenpneumocystose in Hiblick auf die interstittelle Pneumonte der Fruhgeborenen. Z. Kinderheilkd, 1956, 78, 166-176).

Пневмоцистную инвазию удалось воспроизвести на крысах, мышах, кроликах, хорьках. Своеобразие полученной модели состояло в том, что животные оказались пневмоцистоносителями и для воспроизведения модели не было необходимости в их заражении возбудителем пневмоцистоза, а основное значение имело иммунодефицитное состояние которое обусловило реактивацию латентной инфекции.

Для реактивации латентной инфекции применялись различные способы: кортикостероиды в больших дозах (Weller R. Zur Erzeugung von Pneumocystoen in Tirvezsuch. Z. Kinderheilkd, 1955, 76- 366-378; Frenkel J. et al. Latent Pneumocystis infection of rats, relapse and chemotherapy. Lab. Invest. 1966, 15, 1559-1577); цитостатики, радиоактивное облучение, тимэктомия, спленэктомия (Frenkel J. et al. 1966), безбелковая диета (Hughes W. et al. Protein calorie malnutrition. Am. J. Dis Child, 1974, 128, 44-51).

Многочисленными экспериментами было показано, что наиболее эффективными средствами для реактивации латентного пневмоцистоза являются кортикостероиды; цитостатики малоэффективны или эффективны лишь в сочетании с кортикостероидами; радиоактивное облучение или спленэктомия не вызывают развития пневмоцистной пневмонии, а тимэктомия вызывает ожидаемый результат только у новорожденных крысят. Наиболее широко используется модель пневмоцистоза на линейных крысах (Wistar, Sprague-Dawley), которым повторно вводят кортикостероиды, назначают низкокалорийную диету и к питьевой воде добавляют тетрациклин с целью профилактики других вторичных инфекций.

Однако применяемая экспериментальная модель пневмоцистоза имеет ряд недостатков, ограничивающих возможности ее использования: необходимость длительного срока введения иммунодепрессанта; многократное введение препарата, вызывающего иммуносупрессию; отсутствие контроля динамики супрессии; непостоянная воспроизводимость модели; нестабильная интенсивность моделируемой инвазии; отсутствие перехода инвазии в генерализованную стадию.

В качестве прототипа принят способ моделирования пневмоцистоза на линейных крысах (Hughes W.T. Animal models for Pmeumocystis Carinii. J. Pneumonia Protozoology, 1989, 36, 41-45), путем повторных введений кортикостероида дексаметазона в сочетании с низкокалорийной диетой и антибиотикотерапией подопытных животных.

Однако известный способ имеет ряд существенных недостатков: медленное и длительное развитие пневмоцистоза до стадии, пригодной для исследования по химиотерапии (6-13 недель); непостоянная воспроизводимость модели пневмоцистоза (50-70% ); нестабильная интенсивность экспериментальной инвазии (диффузное поражение легких в 30% случаев); необходимость в специальной низкокалорийной диете; многократное введение иммунодепрессанта (12-26 введений); отсутствие перехода инвазии в генерализованную стадию.

Задачей изобретения является создание способа моделирования пневмоцистоза, позволяющего сократить сроки получения модели, повысить ее воспроизводимость и обеспечить переход экспериментальной инвазии в генерализованную стадию.

Сущность изобретения состоит в том, что в способе моделирования пневмоцистоза путем введения в организм лабораторного животного иммунодепрессанта, в качестве иммунодепрессанта используют трикорд-40, при этом в организм предварительно супрессированного животного дополнительно вводят возбудитель висцерального лейшманиоза.

Задача была решена путем применения иммунодепрессанта пролонгированного действия, не применявшегося ранее для данных целей, в сочетании с дополнительным супрессорным кофактором возбудителем висцерального лейшманиоза.

Использование предложенного способа моделирования пневмоцистоза позволяет получить следующий технический результат:
способ позволяет воспроизводить экспериментальную инфекцию, максимально приближенную к таковой у больных СПИДом (прогрессирующая инвазия с переходом в генерализованную стадию);
удешевить стоимость экспериментальной модели за счет уменьшения курсовой дозы иммунодепрессанта, продолжительность его введения, сокращение затрат на содержание животных и специальную диету;
сократить срок создания модели (до 3-7 недель против 6-13 недель);
проводить более быстрый и адекватный по отношению к инфекции у человека скрининг противопнемоцистозных препаратов;
благодаря тому, что впервые в мировой практике при моделиовании пневмоцистоза в качестве дополнительного супрессорного кофактора используется возбудитель лейшманиоза и таким образом воспроизводится модель микст-инвазии, обеспечивается возможность одновременного скрининга на этой модели противопневмоцистозных и противолейшманийных препаратов.

Способ осуществляется следующим образом.

Линейным крысам Wistar обоего пола массой 90-200 г вводят подкожно трикорд-40 (индийский аналог кеналога-40 производства Югославии) в дозе 2-4 мг/кг препарата на первое введение. 1 ампула трикорда-40 содержит 4 мг активного вещества. На фоне развивающейся супрессии животные ежедневно получают питьевую воду с добавлением тетрациклина в концентрации 0,8-1,6 мг/мл. Последующие введения иммунодепрессанта проводят через 10-19 дней после первого введения в дозе 1,5-4,0 мг/кг в зависимости от динамики супрессии, проявляющейся в самочувствии животных (адинамия, одышка и другие симптомы).

Для сокращения срока получения модели пневмоцистоза и перехода ее в генерализованную стадию в качестве дополнительного супрессорного кофактора крысам вводят внутрибрюшинно однократно по 10-20⁶ амастигот Leishmania donovani infantum от экспериментально зараженных золотистных хомяков-доноров через 3-7 дней после первого введения трикорда-40.

Наличие пневмоцистной инфекции, ее интенсивность и диссеминацию определяют путем микроскопического исследования мазков-отпечатков легких, печени, селезенки, костного мозга. Микроскопию мазков проводят после их окраски методами, принятыми для идентификации пневмоцист (окраска по Романовскому-Гимза, по Гомори-Грохотту).

Интенсивность пневмоцистной инвазии оценивают по балльной сиcтеме, применяемой в экспериментальных и клинических исследованиях (Bartlett M.S. et al. New rat model of Pneumocystis carinii intection. J. Clin. Microbiology, 1988, 26): степенями +5, +4, +3, +2, +1 оценивается обнаружение соответственно более 100, 11-100, 1-10 пневмоцист в поле зрения и 2-9 и 1 пневмоциста в 10 или более полях зрения.

П р и м е р. Экспериментальную модель пневмоцистоза воспроизводят у крысы линии Wistar, самки массой 90 г вводят подкожно 3,7 мг/мг трикорда-40. В питьевую воду для животного добавляют тетрациклин в концентрации 1 мг/мл. Через 7 дней после введения трикорда-40 крысе вводят внутрибрюшинно около 2,5 амастигот лейшманий из селезенки экспериментально зараженного золотистого хомяка-донора.

Для этого селезенку помещают в сосуд со стерильным физраствором для отмывания от клеток крови на 10 мин. Затем селезенку протирают через мельничный газ с диаметром ячеек 0,3 мм в физрастворе с антибиотиками (1,28 мг/мл гентамицина и 8000 ЕД/мл пенициллина). 2,0 мл полученного таким образом инокулята, содержащего свободные и заключенные в макрофагах амастигта лейшманий, вводят подопытному животному. Расчет заражающей дозы проводят исходя из числа макрафагов в 1 мл инокулята и числа паразитов в каждой клетке. Второе подкожное введение трикорда-40 в дозе 1,5 мг/кг вводят на 19-й день после начала эксперимента. На 6-й день после второго введения иммунодепрессанта животное забивают ввиду резкого ухудшения его состояния (адинамия, выраженная одышка, диарея). При микроскопиии мазков-отпечатков разных долей обоих легких и печени, окрашенных по Романовскому-Гимза и по Гомори-Грохотту, обнаруживают до 15-20 пневмоцист в поле зрения в мазках-отпечатках легких и до 8-10 пневмоцист в 10 и более полях зрения в мазках-отпечатках печени.

Результаты паразитологического исследования свидетельствуют о том, что срок воспроизведения модели генерализованного пневмоцистоза составляет 25 дней при кратности введения иммунодепрессанта в среднем 1 раз в 2 недели в суммарной дозе 5,2 мг/кг. Наличие и интенсивность лейшманийной инвазии у подопытной крысы определяют с помощью микроскопии окрашенных по Романовскому-Гимза мазков-отпечатков селезенки, печени и костного мозга. В мазках-отпечатках селезенки обнаруживают 10-100 лейшманий в поле зрения, аналогичную пораженность костного мозга и в мазках-отпечатках печени 1-10 лейшманий в поле зрения. Полученные данные подтверждают наличие у подопытных животных микст-инфекции генерализованного пневмоцистоза и висцерального лейшманиоза.

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к инфектологии и паразитологии. Сущность способа состоит в том, что в организм лабораторного животного подкожно вводят иммунодепрессант, в качестве которого используют трикорд-40 в дозе 2 4 мг/кг. На фоне развивающейся супрессии в организм животного дополнительно вводят внутрибрюшинно однократно возбудитель висцерального лейшманиоза. Способ позволяет воспроизвести экспериментальную инфекцию, максимально приближенную к таковой у больных СПИДом, сокращается срок создания модели, удешевляется стоимость экспериментальной модели за счет уменьшения курсовой дозы иммунодепрессанта, продолжительности его введения, сокращения затрат на содержание животных и специальную диету. Способ позволяет проводить более быстрый и адекватный по отношению к инфекции у человека скрининг противопневмоцистозных препаратов, обеспечивается возможность одновременного скрининга на одной модели противопневмоцистозных и противолейшманиозных препаратов.

СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ПНЕВМОЦИСТОЗА, включающий введение в организм экспериментального животного иммунодепрессанта, отличающийся тем, что в качестве иммунодепрессанта используют трикорд-40, при этом в организм предварительно супрессированного животного дополнительно вводят возбудитель висцерального лейшманиоза.