СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛАТЕКСНОГО АНТИГЕННОГО МИКОБАКТЕРИАЛЬНОГО ДИАГНОСТИКУМА Российский патент 1998 года по МПК G01N33/569 G01N33/545 

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно - к способам получения иммуносорбентов, которые могут быть использованы в диагностике особо опасных инфекций, и касается способа получения латексного антигенного микобактериального диагностикума.

Известен способ получения латексного антигенного микобактериального диагностикума, включающий сенсибилизацию частиц латекса (АКР-2) белками сониката микобактерий при pH 8,0 - 8,6 с последующим блокированием свободных альдегидных групп латекса глицином.

Цель изобретения - повышение срока годности.

Поставленная цель достигается дополнительным барбатированием гелием.

Способ осуществляется следующим образом.

Бактериальную массу микобактерий, выращенную на синтетической жидкой среде, инактивируют 2%-ным раствором фенола в течение 2 - 3 сут., отмывают от фенола дистиллированной водой до отрицательной реакции на фенол с применением центрифугирования при 10000 об/мин в течение 30 мин. Разрушение клеток проводят на аппарате УЗДН-2Т при частоте 20 кГц с водным охлаждением 10 циклами по 2 мин. Концентрация белка - 350 мкг/мл±50 мкг/мл. Латекс отмывают фосфатным буфером (pH 7,6 - 7,8) с последующим центрифугированием при 5000 об/мин в течение 5 мин. 5%-ную суспензию розового латекса АКР-2 добавляют по каплям к раствору микобактериальных антигенов в 0,1 М фосфатном буфере. Конечная концентрация латекса - 0,3%. Свободные альдегидные группы блокируют глицином. Диагностикум разливают во флаконы по 2,0 мл, закрывают резиновой пробкой. Через иглу, вколотую в пробку, пропускают гелей в течение 2 мин. Расход газа - 30 - 40 см³, давление - 1,2 атм. Готовый диагностикум хранят при температуре от 4 до 10^oC.

Сущность способа поясняется примерами.

Пример 1. Получение латексного антигенного микобактериального диагностикума.

Бактериальную массу М. bovis (штамм Vallee), выращенную на жидкой синтетической среде, инактивируют 2%-ным раствором фенола в течение 2 - 3 дней, отмывают от фенола дистиллированной водой до отрицательной реакции на фенол (проба с 10%-ным раствором бария), центрифугированием при 10000 об/мин в течение 30 мин. Микобактерии разрушают на дезинтеграторе УЗДН-2Т с охлаждением бактериальной массы в ледяной бане в режиме прерывистых циклов (2 мин разрушения - 2 мин пауза) при частоте 20 кГц (10 циклов). Концентрация белка в соникате - 300 - 500 мкг/мл. Латекс АКР-2 отмывают 2 раза водой (pH 7,6 - 7,8) с последующим центрифугированием при 5000 об/мин в течение 5 мин. 5%-ную суспензию латекса в 0,1М фосфатном буфере по каплям добавляют к раствору микобактериальных антигенов в 0,1М фосфатном буфере. Конечная концентрация латекса 0,3%. Полученную смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 3 ч при постоянном помешивании на магнитной мешалке ММ-5 со скоростью 400 об/мин. Сенсибилизированный белками латекс отмывают дистиллированной водой 1 раз и инкубируют в 1%-ном растворе глицина в фосфатном буфере 0,1М (pH 7,8 - 8,0) при комнатной температуре в течение 1 ч для блокирования свободных альдегидных групп. Полученную суспензию сенсибилизированного латекса отмывают 2 раза дистиллированной водой с последующим центрифугированием при 5000 об/мин в течение 5 мин и разливают по 2,0 мл в пенициллиновые флаконы, которые закрывают резиновой пробкой. По игле, вколотой в пробку, пропускают гелий из расчета 30 - 40 см³ при давлении 1,2 атм в течение 2 мин, затем герметически укупоривают флаконы.

Пример 2. Активность латексного антигенного микобактериального диагностикума в зависимости от срока хранения определяют в реакции агглютинации с кроличьей иммунной сывороткой к М. bovis, штамм Vallee. Учет реакции проводят визуально по общепринятой четырехкрестной системе на чистых сухих серологических пластинах, на белом фоне. Результаты представлены в табл. 1. Как видно из табл. 1, хранение обработанных гелием диагностикумов в течение 18 месяцев практически не повлияло на их качество.

Пример 3. Активность латексного диагностикума трех серий (11, 12, 13) в зависимости от срока хранения определяют, как в примере 2, с кроличьей иммунной сывороткой к M. avium. Результаты представлены в табл. 2.

Как видно из табл. 2, ни одна из трех испытанных серий не дала с гипериммунной кроличьей сывороткой к M.avium агглютинационного титра выше 1:20, что указывает на видовую специфичность диагностикума независимо от срока хранения.

Пример 4. Сравнительное изучение латексных антигенных микобактериальных диагностикумов, полученных известным и предлагаемым способами, проводят как в примере 2, на сыворотках крупного рогатого скота из неблагополучных по туберкулезу хозяйств Нижегородской области. За диагностический принят титр 1: 40. Результаты представлены в табл. 3.

Как видно из табл. 3, практически отсутствуют различия в активности латексных антигенных микобактериальных диагностикумов, полученных известным и предлагаемым способами.

Пример 5. Изучение специфической активности латексных антигенных микобактериальных диагностикумов, полученных известным и предлагаемым способами, проводят, как в примере 2, с сыворотками крупного рогатого скота из благополучных по туберкулезу хозяйств Нижегородской области. За диагностический принят титр 1:40. Результаты представлены в табл. 4.

Как видно из табл. 4, практически отсутствуют различия в специфической активности латексных антигенных микобактериальных диагностикумов, полученных известным и предлагаемым способами. Ни одно из здоровых животных не дало с диагностикумами реакции в титре 1:40 и выше.

Таким образом, в предлагаемом техническом решении удалось подобрать такие условия, при которых срок годности увеличивается до 18 месяцев при сохранении активности латексного антигенного микобактериального диагностикума, что расширяет возможности его применения.

Изобретение касается получения иммуносорбентов, используемых в диагностике особо опасных инфекций. Частицы латекса АКР-2 сенсибилизируют белками сониката микобактерий. Затем блокируют свободные альдегидные группы латекса глицином. Полученный диагностикум барботируют гелием. Готовый диагностикум хранят при температуре 4 - 10^oC. При сохранении активности латексного антигенного микобактериального диагностикума срок годности увеличивается до 18 мес. 4 табл.

Способ получения латексного антигенного микобактериального диагностикума, включающий сенсибилизацию частиц латекса белками сониката микобактерий с последующим блокированием свободных альдегидных групп латекса глицином, отличающийся тем, что дополнительно осуществляют барботирование гелием.