ШТАММ МИКОБАКТЕРИЙ MYCOBACTERIUM AVIUM, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ЛЕПРЫ Российский патент 1997 года по МПК C12N1/20 A61K39/04 C12N1/20 C12R1/32 

Изобретение относится к микробиологии и представляет собой штамм микобактерий Mycobacterium avium, активно растущий на плотных яичных средах, используемый для диагностики лепры.

Возбудитель лепры Mycobacterium leprae не растет на питательных средах. Для серологической лепры используют антигены микобактерий лепры, выделенных из тканей больных лепрой людей или зараженных лепрой крыс и броненосцев, что весьма трудоемко и дорого.

Предлагается штамм микобактерий Mycobacterium avium ГИСК N 43, характеризующийся активным ростом на плотных яичных средах и антигенными свойствами, сходными с антигенными свойствами Mycobacterium leprae, что позволяет использовать его для серологической диагностики лепры.

Штамм Mycobacterium avium ГИСК N 43 выделен в Центральной бактериологической лаборатории г. Нижнего Новгорода из мокроты больного с поражением легких в 1985 г. Штамм депонирован в коллекции Государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича (ГИСК) под регистрационным номером 43.

Штамм микобактерий Mycobacterium avium N 43 характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки: бактерии представляют собой грам-положительные палочки длиной 2,0-3,5 мкм; по Цилю-Нильсену окрашиваются в красный цвет.

Культуральные свойства: на плотной питательной среде бактерии образуют плоские белого цвета колонии S-формы. В жидкой питательной среде помутнение не отмечается, на поверхности бактерии образуют тонкую морщинистую пленку белого цвета. На картофельно-глицериновой среде Павловского вырастают за 12-16 дней при температуре 37^oC, на плотной яичной среде Левенштейна-Йенсена скорость роста при температуре 37^oC 12-15 дней, при температуре 45^oC 13-16 дней, при температуре 22^oC роста нет. Оптимум роста отмечается при температуре 38-40^oC. Бактерии хорошо растут на среде с салицилатом натрия и на среде с 5% хлористого натрия.

Ферментативные свойства: отсутствуют активные ферменты уреаза, -галактодидаза, нитратредуктаза.

Серологические свойства: по реакции агглютинации на стекле с типоспецифическими сыворотками к трем серотипам M._avium штамм M._avium ГИСК N 43 отнесен к серотипу 2.

Хемотаксономические свойства: состав жирных кислот, определенный методом сопиролитической газовой хроматографии, соответствует видовому составу M. _avlum..

Вирулентные свойства: после заражения морских свинок бактерийной массой в количестве 1,0-1,1 мг внутримышечно животные в течение 3 мес (срок наблюдения) оставались здоровыми, на вскрытии патологоанатомическая картина микобактериоза отсутствовала.

Антигенные свойства: штамм M._avium ГИСК N 43 обладает антигенными свойствами, сходными с антигенными свойствами референс-штамма M._avium(ГИСК им. Л.А. Тарасевича) и штаммами M._leprae, выделенными от больных лепрой и зараженных лепрой крыс и броненосцев, что позволяет использовать его для серологической диагностики лепры.

Антигенные свойства штамма M._avium ГИСК N 43 и возможность его использования для диагностики лепры подтверждаются следующими примерами.

Пример 1. Излучение антигенных свойств 18 штаммов M._avium различного происхождения (выделены от больных микобактериозами людей, из лимфоузлов коров и свиней), включая штамм M._avium ГИСК N 43, и штамма M._leprae, выделенного из тканей зараженной лепрой крысы, проводят в реакции преципитации в геле (РПГ) с сывороткой от больных лепрой. На пластиковую панель наслаивают 1% расплавленный агар, после застывания пробойником выбирают центральное отверстие и 18 отверстий вокруг него. В центральное отверстие помещают сыворотку больного лепрой, а в периферические отверстия водорастворимые антигены изучаемых штаммов с концентрацией белка не менее 10-12 мг на 1 мл раствора. Панель устанавливают во влажную камеру. Реакцию читают через 24-48 ч на темном фоне. Из 18 штаммов M._avium только штамм M._avium ГИСК N 43 обладает сходством линий преципитаций со штаммом M._leprae..

Пример 2. Изучение антигенных свойств M._avlum ГИСК N 43 и штаммов M. _leprae, выделенных из тканей больного лепрой и зараженных лепрой броненосца, крысы и мыши, проводят методом встречного иммуноэлектрофореза (ВИЭФ) с сывороткой от больного лепрой. Для ВИЭФ используют прибор ВИЭФ-01. На пластиковую панель наслаивают 1% расплавленный агар (20 мл). После застывания агара пробойником выбивают два параллельных ряда лунок один ряд лунок для антигенов, другой ряд для сыворотки. Растворы антигенов заливают в лунки со стороны катода, а сыворотку со стороны анада. После заполнения лунок панель устанавливают в электрофоретическую камеру с веронал-медилановым буфером (pH 8,6) и включают блок питания. Режим работы: напряжение 30 В, время реакции - 15-20 мин. Антигены мигрируют к аноду, а антитела перемещаются к катоду. Результаты реакции оценивают визуально при косом освещении на темном фоне. Штамм M. _avium ГИСК N 43 образует в ВИЭФ против сыворотки больного лепрой одну линию преципитации, такую же линию преципитации образует штамм M. _leprae..

Пример 3. Сравнительное изучение антигенных свойств штаммов 12 видов микобактерий (M. tuberculosis, M. bovis, M. avium (ГИСК N43), M. Kansasii, M. scrotulaceum, M. gordonae, M. phlei, M. marinum, M. vaccae, M. tortuitum, M. smegmatis, M. leprae) проводят в РПГ с сывороткой больных лепрой, как в примере 1. Обнаруживаются видоспецифические линии преципитации у штаммов M. _leprae и M. _avium (ГИСК N 43), очень слабые линии преципитации у штамма M. _smegmatis и отсутствие видоспецифических линий преципитации у штаммов других видов.

Пример 4. Сравнительное изучение активности антигена M._avium (ГИСК N 43) и антигена M. _leprae (штамм, выделенный из тканей зараженной лепрой крысы) проводят в РПГ и ВИЭФ с сыворотками больных при различных клинических формах лепрозного процесса.

Результаты представлены в таблице.

Из таблицы видно, что антигены M._avium ГИСК N 43 и M._leprae одинаково активно выявляют антитела в сыворотке больных лепрой в двух иммунологических тестах.

Таким образом, заявляемый штамм M. avium ГИСК N 43, растущий на плотных яичных средах известного состава, обладая морфологическими признаками, культуральными, ферментативными, хематоксономическими и вирулентными свойствами, характерными для M. avium, обнаруживает антигенные свойства, отличающие его от известных штаммов M. avium и сходные с антигенными свойствами штаммов M. Leaprae, выделенных из тканей больных лепрой и зараженных лепрой броненосцев, крыс и мышей. Возможность использования штамма M. avium ГИСК N 43 для диагностики лепры подтверждена изучением сравнительной активности антигена M._avium ГИСК N 43 и M. Leprae в РПГ и ВИЭФ с сыворотками больных, лиц с незавершенным регрессом и с клинически устойчивым регрессом.

Использование: микробиология, иммунология. Сущность изобретения: штамм Mycobacterium avium ГИСК N 43 выделен из мокроты больного с поражением легких, хорошо растет на плотной яичной среде и обладает антигенными свойствами, сходными с антигенными свойствами M. leprae, что позволяет использовать его для серологической диагностики лепры, например, в РПГ и ВИЭФ с сыворотками больных, лиц с незавершенным регрессом и с клинически устойчивым регрессом. 1 табл.

Штамм микобактерий Mycobacterium avium ГИСК N 43, используемый для диагностики лепры.