СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДА Российский патент 1995 года по МПК A61K38/03 C07K7/06 

Изобретение относится к способу получения пептидов новых биологически активных соединений, которые могут найти применение в фармакологии.

Известны способы получения пептидов путем конденсации блочных фрагментов, кристаллизации, фильтрования, упаривания с последующей очисткой конечного продукта (Deigin V.I. Yarova E.R. "Synthesis of dermorphin and its analogs'//In: Peptides 1984, р.325-328).

Изобретение направлено для решения задачи получения биологически активных пептидов, обладающих, например, способностью оказывать противоалкогольное действие самостоятельно или при комплексном применении с другими фармакологическими пептидными препаратами.

Способ получения соединений формулы:
H-TYR-D-ALA-PHE-D-ALA-TYR-PRO- SER-NHME (1)
A. Получение ВОС-TYR-(BZL)-PRO-SER(BZL)-NHME:
1. BOC-SER(BZL)-NHME
16,1 г BOC-SER-(BZL)-OPFP растворяли в 50 мл диметилформамида, при перемешивании добавляли 5,0 г N-метилморфолина и 2,9 г гидрохлорида метиламина. Реакционную смесь перемешивали 3 ч при комнатной температуре. Растворители упаривали в вакууме до масла. Остаток растворяли в 200 мл этилацетата и экстрагировали 2% -ным раствором серной кислоты 2 раза по 100 мл, затем насыщенным раствором бикарбоната натрия 2 раза по 100 мл, отмывали водой до нейтральной среды, высушивали над безводным сульфатом натрия и упаривали в вакууме. Кристаллизовали из эфира с гексаном в соотношении 1:3. Выход 8,5 г (79,3%), Т.пл. 96,7 ^оС, R 0,73 (система: хлороформ: этилацетат: метанол 6:3: 1), R 0,68 (система: хлороформ: метанол 9:1).

2, BOC-TYR(BZL)-PRO-OH
11,1 г BOC-TYR(BZL)-OPFP растворяли в 50 мл тетрагидрофурана, добавляли раствор 3,45 г пролина и 3,18 г бикарбоната натрия в воде при перемешивании. Реакционную смесь перемешивали сутки при комнатной темпеpатуре. Растворители упаривали в вакууме, добавляли 70 мл этилацетата и подкисляли 70 мл 2%-ной серной кислоты до рН 2-3. Пептид экстрагировали дважды по 70 мл этилацетатом. Органический слой объединяли, промывали насыщенным раствором сульфата натрия, высушивали над безводным сульфатом натрия. Этилацетат отгоняли в вакууме до образования густого масла. Остаток заливали смесью эфир: гексан 1: 1 и оставляли на 2 ч при 4^оС. Масло промывали смесью эфира с гексаном (1: 1) и высушивали в вакууме до образования аморфного порошка. Выход: 8,95 г (92,5%). R_F 0,71 ((система: хлороформ: этилацетат: метанол: уксусная кислота 6:3:1:0,5), R_F 0,23 (система: хлороформ: метанол 9:1).

3, BOC-TYR(BZL)-PRO-SER(BZL)-NHME
10,9 г BOC-SER(BZL)-NHME растворяли в 80 мл 50%-ной трифторуксусной кислоты в хлороформе. Через 1 ч растворители упаривали в вакууме до густого масла. Остаток растворяли в диметилформамиде и добавляли N-метилморфолин и охлаждали до -15^оС. Смесь 10,9 г BOC-TYE(BZL)-PRO-OH и 2,6 мл N-метилморфолина в 50 мл диметилформамида охлаждали до -15^оС и при перемешивании добавляли 3,2 г изобутилхлорформиата. Через 2 мин к охлажденному раствору добавляли охлажденный раствор бензилового эфира метиламида серина. Реакционную смесь перемешивали 30 мин при -15^оС и 2 ч при комнатной температуре. Диметилформамид отгоняли в вакууме, остаток заливали 100 мл этилацетата и промывали 2%-ным раствором серной кислоты 2 раза по 50 мл, затем промывали насыщенным раствором бикарбоната натрия 2 раза по 80 мл, отмывали водой до нейтральной среды, высушивали над безводным сульфатом натрия. Этилацетатный слой упаривали в вакууме. Остаток кристаллизовали из эфира с добавлением гексана. Выход: 10,63 г (71,3=), т.пл. ) 112^оС. R_F 0,61 (система: хлороформ: этилацетат:метанол 6:3:1), R_F 0,53% (система: хлороформ:метанол 9:1).

В. Получение BOC-TYR(BOC)-D-ALA-PHE-D-ALA-OBZL.

1. BOC-PHE-D-ALA-OBZL.

Смесь 12,3 г BOC-PHE-OH и 2,6 мл N-метилморфолина в 50 мл диметилформамида охлаждали до -15^оС и при перемешивании добавляли 6,4 г изобутилхлорформиата. Через 2 мин к охлажденному раствору добавляли охлажденный раствор 8,26 г бензилового эфира D-аланина в 50 мл диметилформамида. Реакционную смесь перемешивали 30 мин при -15^оС и 2 ч при комнатной температуре. Диметилформамид отгоняли в вакууме, остаток заливали 1200 мл этилацетата и промывали 2% -ным раствором серной кислоты 2 раза по 50 мл, затем промывали насыщенным раствором бикарбоната натрия 2 раза по 80 мл, отмывали водой до нейтральной среды, высушивали над безводным сульфатом натрия. Этилацетатный слой упаривали в вакууме. Остаток кристаллизовали из эфира с добавлением гексана. Выход: 13,40 г (68,1%) Т.пл. 95,9^оС, R_F 0,91 (система: хлороформ: этилацетат: ментол 6:3:1), R_F 0,73 (cистема: хлороформ: метанол 9:1).

2. BOC-D-ALA-PHE-A-ALA-OBZL
8,14 г BOC-PHE-D-ALA-OBZL растворяли в 80 мл 50%-ной трифторуксусной кислоты в хлороформе. Через 1 час растворители упаривали в вакууме до густого масла. Остаток заливали 150 мл диэтилового эфира и затирали. Осадок отфильтровывали, промывали эфиром и высушивали на воздухе. Выход: 7,1 (88,1% ). Т.пл. TFA* H-PHE-DALA-OBZL 153^оС R 0,74 (система: хлороформ: метанол: 32% -ная уксусная кислота 60:45:20).

Смесь 3,2 г BOC-D-ALA-OH и 1,0 мл N-метилморфолина в 50 мл диметилформамида охлаждали до -15^оС и при перемешивании добавляли 2,3 изобутилхлорформиата. Через 2 мин вносили охлажденный раствор 7,0 г бензилового эфира трифторацетата H-PHE-D-ALA и 1,0 мл N-метилморфолина в 50 мл диметилформамида. Реакционную смесь перемешивали 30 мин при -15^оС и 2 ч при комнатной температуре. Диметилформамид отгоняли в вакууме, остаток заливали 100 мл этилацетата и промывали 2%-ным раствором серной кислоты 2 раза по 50 мл, затем промывали насыщенным раствором бикарбоната натрия 2 раза по 80 мл, отмывали водой до нейтральной среды, высушивали над безводным сульфатом натрия. Этилацетатный слой упаривали в вакууме. Остаток кристаллизовали из эфира с добавлением гексана. Выход: 8,0 (97,6%). Т.пл. 131^оС, R 0,78 (система: хлороформ: этилацетат: метанол 6:3:1), R 0,53 (система: хлороформ: метанол 9:1).

3. BOC-TYR(BOC)-D-ALA-PHE-D-ALA-OBZL
5,0 г BOC-D-ALA-PHE-D-ALA-OBZL растворяли в 80 мл 50%-ной трифторуксусной кислоты в хлороформе. Через час растворители упаривали до густого масла. Остаток растворяли в 50 мл диметилформамида и добавляли 1,3 мл N-метилморфолина. Смесь 3,2 BOC-TYR-OH и 1,0 мл N-метилморфолина в 50 мл диметилформамида охлаждали до -15^оС и при перемешивании добавляли 2,3 изобутилхлорформиата. Через 2 мин вносили охлажденный раствор 7,0 г бензилового эфира трифторацетата H-D-ALA-PHE-D-ALA и 1,0 мл N-метилморфолина в 50 мл диметилформамида. Реакционную смесь перемешивали 30 мин при -15^оС и 2 ч при комнатной температуре. Диметилформамид отгоняли в вакууме, остаток заливали 100 мл этилацетата и экстрагировали 2%-ным раствором серной кислоты 2 раза по 50 мл, затем промывали насыщенным раствором бикарбоната натрия 2 раза по 80 мл, отмывали водой до нейтральной среды, высушивали над безводным сульфатом натрия. Этилацетатный слой упаривали в вакууме. Остаток кристаллизовали из эфира с добавлением гексана. Выход: 8,0 г (97,6%). Т.пл. 153^оС. R_F 0,80 (система: хлороформ: этилацетат: метанол 6:3:1) R_F 0,56 (система: хлороформ: метанол 9:1).

С. Получение BOC-TYR(BOC)-D-ALA-PHE-D-ALA-TYR(BZL)-PRO-SER(BZL)- NHME
1. 5,1 г BOC-TYR(BOC)-D-ALA-PHE-D-ALA-OBZL растворяли в 150 мл этилового спирта, добавляли 0,8 г палладиевого катализатора на угле и пропускали ток водорода в течение 6 ч. Катализатор отфильтровывали, промывали 50 мл этилового спирта. Растворитель упаривали в вакууме досуха. Выход: 4,53 г (100% ).

2. 4,44 г BOC-TYR(BZL)-PRO-SER(BZL)-NHME растворяли в 80 мл 50%-ной трифторуксусной кислоты в хлороформе. Через час растворители упаривали в вакууме до густого масла. Остаток растворяли в 50 мл диметилформамида и добавляли 0,4 мл N-метилфорфолина (рН 8,5).

3. Смесь 4,53 г BOC-TYR(BOC)-D-ALA-PHE-D-ALA-OH и 0,4 мл N-метилморфолина в 50 мл диметилформамида охлаждали до -15^оС и при перемешивании добавляли 0,94 изобутилхлорформиата. Через 2 мин вносили охлажденный раствор 4,45 г H-TYR(BZL)-PROSER(BZL)-NHME в 50 мл диметилформамида. Реакционную смесь перемешивали 30 мин при -15^оС и 2 ч при комнатной температуре. Диметилформамид отгоняли в вакууме, остаток заливали 100 мл этилацетата и экстрагировали 2%-ным раствором серной кислоты 2 раза по 50 мл, затем промывали насыщенным раствором бикарбоната натрия 2 раза по 80 мл, отмывали водой до нейтральной среды, высушивали над безводным сульфатом натрия. Этилацетатный слой упаривали в вакууме. Остаток растирали в гексане. Осадок отфильтровывали, промывали гексаном, высушивали на воздухе. Выход: 8,24 (98,1%). Т.пл. 107^оС, с разложением R_F 0,55 (система: хлороформ: этилацетат:метанол6:3:1), R_F= 0,44 (система: хлороформ: метанол 9:1).

4. Получение. H-TYR-D-ALA-RHE-D-ALA-TYR-PRO-SER-NHME
1. 8,0 г BOC-TYR(BOC)-D-ALA-PHE-D-ALA-TYR(BZL)-PRO-SER(BZL)-NHME растворяли в 100 мл этилового спирта, добавляли 1,0 мл муравьиной кислоты, 0,8 г палладиевого катализатора на угле и пропускали ток водорода в течение 18 ч. Катализатор отфильтровывали, промывали этиловым спиртом. Растворитель упаривали в вакууме. К остатку добавляли 0,2 г дитиотриэтола и 100 мл 70%-ной водной трифторуксусной кислоты. Через час растворители упаривали в вакууме до густого масла, добавляли 100 мл воды и упаривали повторно. Остаток заливали диэтиловым эфиром. Осадок отфильтровывали, промывали эфиром, высушивали на воздухе. Выход: 5,0 г (94,3%), R 0,68 (система: бутанол: уксусная кислота: вода3:1: ), R 0,74 (cистема: этилацетат: пиридин: уксусная кислота: вода 6:5:1:3).

Очистку с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии проводили на колонке с Диасорбом 130 С-16/Т, размер колонки 24 х 250 мм, в градиенте от 10 до 40% за 15 мин ацетонитрила в 0,4%-ном растворе пиридинацетата. Скорость потока 25 мл/мин, λ 280 нм; Нагрузка 90 мг. Время выхода 17-ая минута. Выход: 3,5 (70,0%).

Получение соединения формулы H-TYR-TYR-PRO-SER-NHME (II)
Получение BOC-TYR-(BOC)-TYR(BZL)-PRO-SER(BZL)-NHME
6,6 г BOC-TYR(BZL)-PRO-SER(BZL)-NHME растворяли в 80 мл 50%-ной трифторуксусной кислоты в хлороформе. Через 1 ч растворители упаривали в вакууме до густого масла. Остаток растворяли в диметилформамиде и добавляли 0,7 мл N-метилморфолина и охлаждали до -15^оС. Смесь 4,2 г BOC-TYR(BZL)-OH и 0,7 мл N-метилморфолина в 50 мл диметилформамида охлаждали до -15^оС и при перемешивании добавляли 1,5 г изобутилхлорформиата. Через 2 мин к охлажденному раствору добавляли охлажденный раствор бензилового эфира метиламида трипептида. Реакционную смесь перемешивали 30 мин при -15^оС и 2 ч при комнатной температуре. Диметилформамид отгоняли в вакууме, остаток заливали 100 мл этилацетата и промывали 2% -ным раствором серной кислоты 2 раза по 50 мл, затем промывали насыщенным раствором бикарбоната натрия 2 раза по 80 мл, отмывали водой до нейтральной среды, высушивали над безводным сульфатом натрия. Этилацетатный слой упаривали в вакууме. Остаток кристаллизовали из эфира с добавлением гексана. Выход: 8,45 (92,9% ). Т.пл. 167,1^оС, R_F 0,76 (система: хлороформ: этилацетат: метанол: уксусная кислота 6:3:1:0,5), R_F 0,45 (система: хлороформ: метанол 9:1).

2. Получение H-TYR-PRO-SER-NHME
8,0 г BOC-TYR(BOC)-TYR(BZL)-PTO-SER(BZL)-NHME растворяли в 100 мл этилового спирта, добавляли 1,0 мл муравьиной кислоты, 0,8 г палладиевого катализатора на угле, пропускали ток водорода в течение 18 часов. Катализатор отфильтровывали, промывали этиловым спиртом. Растворитель упаривали в вакууме. К остатку добавляли 0,2 г дитиотриэтола и 100 мл 70%-ной водной трифторуксусной кислоты. Через час растворители упаривали в вакууме до густого масла, добавляли 100 мл воды и упаривали повторно. Остаток заливали диэтиловым эфиром. Осадок отфильтровывали, промывали эфиром, высушивали на воздухе. Выход: 5,0 г (94,3%), R 0,63 (система: бутанол: уксусная кислота: вода 3:1:1), R 0,68 (система: этилацетат: пиридин: уксусная кислота: вода 6:5:1:3).

Очистку с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии проводили на колонке с Диасорбом 130 C-16/Т, размер колонки 24 х 250 мм, в градиенте от 5 до 30% за 15 мин ацетонитрила в 0,1%-ном растворе трифторуксусной кислоты. Скорость потока 25 мл/мин, λ 220 нм. Нагрузка 100 мг. Время выхода 15-я минута. Выход: 3,5 г (70%).

Биологические испытания описываемых пептидов.

Пpотивоалкогольное действие предложенных пептидов, а также их корригирующее действие на противоалкогольную активность пептидов изучали на крысах линии WISTAR, длительно получавших 20%-ный раствор алкоголя и отобранных на "много" и "мало" пьющих алкоголь крыс при свободном доступе к воде и 15%-ному раствору этанола.

"Много" пьющие крысы получали дерморфин, даларгин и предложенный пептид (I) внутрибрюшинно в дозе 150 мкг/кг на протяжении 20-25 дней. Крысам, которые оказались резистентными к действию указанных пептидов, вводили дополнительно пептид (II) внутрибрюшинно в дозе 100 мкг/кг или интраназально в дозе 5 мкг/кг.

Результаты испытаний представлены в таблице.

Таким образом, применение пептида (II) в сочетании с дерморфином, даларгином и пептидом (I), потенциирует антиалкогольное действие последних и позволяет снизить потребление алкоголя.

П р и м е р 1. Крыса, содержавшаяся в условиях принудительного спаивания 20% -ным раствором алкоголя на протяжении 8 мес. после предоставления выбора между 15%-ным раствором этанола и воды потребляет в среднем 35 мл/кг алкоголя и 29 мл/кг воды. Введение внутрибрюшинно дерморфина в эффективной дозе 150 мкг/кг не изменило ее предпочтение к алкоголю. Дополнительное интраназальное введение заявленного пептида TYR-TYR-PRO-SER-NHME в дозе 5 мкг/кг вызывает снижение потребления раствора этанола и повышение количества выпиваемой воды (см.фиг.1).

П р и м е р 2. У крысы, содержавшейся в условиях согласно примеру 1, не наблюдали противоалкогольный эффект пептида TYR-D-ALA-PHE-D-ALA-TYR-PRO-SER-NHME. Дополнительное интpаназальное введение заявленного пептида TYR-TYR-PRO-SER-NHME вызывает снижение потребления раствора этанола (см.фиг.2).

Примеры свидетельствуют о возможности использования пептида для коррекции противоалкогольного действия пептидов.

Таким образом предложенный способ позволяет получить биологически активный пептид.

Изобретение касается способов получения пептидов новых биологически активных соединений, которые могут найти применение в медицине. Препараты на основе полученного пептида обладают способностью оказывать противоалкогольное действие самостоятельно или при комплексном применении с другими фармакологическими препаратами пептидной природы. Синтез соединения формулы A-TYR-PRO-SER-NH-B, где A H-TYR или X-TYR-Y-PHE-Z, X H или оптически активная основная аминокислота, Y D аминокислота, Z - оптически активная аминокислота, B H или алкильная группа, осуществляют путем синтеза в растворе, причем сначала проводят конденсацию фрагмента BOC-SER (BZL)-NH-B в присутствии N-метилморфолина, а жидкостную хромотографию проводят на Диасорбе 130 в растворе ацетонитрила. 2 ил. 1 табл.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДА путем конденсации С-концевого трипептида и N-концевого фрагмента, кристаллизации, фильтрования, упаривания с последующей очисткой конечного продукта жидкостной хроматографией, отличающийся тем, что вначале проводят конденсацию фрагмента BOC-SER-(BZL)-NH-B в присутствии N-метилморфолина, а жидкостную хроматографию проводят на Диасорбе 130 в растворе ацетонитрила с элюцией конечного продукта формулы
A-TYR-PRO-SER-NH-B,
где A-H-TYR или X-TYR-Y-PHE-Z;
X водород или оптически активная основная аминокислота;
Y D аминокислота;
Z оптически активная аминокислота;
B водород или алкильная группа.