ИММУНОМОДУЛЯТОР Российский патент 2004 года по МПК A61K31/404 A61P37/02 

Изобретение относится к новым биологически активным веществам из класса алканкарбоновых кислот и может быть использовано в медицине и биологии в качестве основы для создания лекарственных препаратов

В настоящее время при лечении инфекционно-воспалительных, аутоиммунных и онкологических заболеваний в клинической медицине достаточно широко применяются лекарственные препараты, которые обладают иммуномодулирующими свойствами (И.Б.Михайлов. Настольная книга врача по клинической фармакологии. - Руководство для врачей. - СПб. - 2001. - 736 с.). Однако необходимо подчеркнуть, что существующие иммуномодуляторы не обладают достаточностью избирательностью действия на то или иное звено иммунитета, а также зачастую вызывают развитие нежелательных побочных реакций.

Например, известный врачам различных специальностей гетероциклический иммуномодулятор левамизол (Харкевич Д.А. Фармакология. - М. - 2001. - С. 485) способен усиливать слабые реакции клеточного иммунитета, ослаблять сильные и не действовать на нормально выраженные. Левамизол отличается дозозависимостью иммунотропного действия, которое порой носит оппозитный характер (при использовании больших доз препарата возможно наблюдать эффект иммуносупрессии вместо иммуностимуляции). Кроме того, применение левамизола может вызвать серьезные побочные явления самого разнообразного характера: неврологические нарушения, угнетение кроветворения, аллергические реакции и др.

Современные знания о патогенезе многих заболеваний, в основе которого лежат функциональные нарушения клеточно-гуморальных механизмов формирования иммунных реакций, требуют осуществления поиска новых иммуноактивных препаратов, отличающихся избирательностью действия на различные звенья иммунного ответа, а также максимально лишенные риска индуцирования побочных влияний на организм пациента.

С целью расширения арсенала эффективных и малотоксичных средств, обладающих иммуноактивными свойствами, предлагается использовать Трис-(2-гидроксиэтил)аммониевую соль 2-метилиндолилтиоуксусной кислоты в качестве иммуномодулятора.

Согласно литературным данным, Трис-(2-гидроксиэтил)аммониевая соль 2-метилиндолилтиоуксусной кислоты является стабилизатором клеточных мембран (Клиническая эффективность и безопасность цефалоспориновых антибиотиков производства ООО “АБОЛмед”. - Сб. трудов НИИКИ, АГМУ и МКБ.- Новосибирск, 2002. - С. 179).

Сущность изобретения заключается в том, что были исследованы иммуномодулирующие свойства трис-(2-гидроксиэтил)аммониевой соли 2-метилиндолилтиоуксусной кислоты в отношении регуляции пролиферативной активности иммуноцитов (митоген-стимулированная пролиферация клеток селезенки in vitro), a также в отношении способности данного соединения влиять на гуморальный (количество IgM - антителообразующих клеток - IgM АОК) и клеточный (реакция ГЗТ) иммунитет in vivo.

В работе использовали здоровых половозрелых животных мышей - гибридов (CBAxC57BL/6)Fl (CBF1) обоего пола, 8-10 недельного возраста, массой тела 18-20 г. Разброс в группах по исходной массе тела не превышал ±10%. Контрольные и опытные животные одного возраста и получены одновременно из одного питомника ("Рассвет", г. Томск). До и в период эксперимента контрольные и опытные животные содержались в виварии в одинаковых условиях: стандартных пластиковых клетках с мелкой древесной стружкой (не более 10 особей) на стандартном рационе. Все исследования проводились в одно и то же время суток (утром).

Полученные данные обрабатывались по непараметрическому критерию U Вилкоксона-Манна-Уитни.

Пример 1. Спонтанная, Con А- и PWM-индуцированная пролиферация клеток селезенки.

Клетки селезенки мышей культивировали в круглодонных планшетах для иммунологических реакций ("Linbro") при +37°С в атмосфере 5% СO₂ и 95% воздуха. Абсолютное количество клеток, вносимых в лунку, составляло 200000. Клетки стимулировали митогенами - конканавалиномА (Con A, Sigma) или митогеном лаконоса (PWM, Sigma). Концентрации митогенов подбирались предварительным титрованием и использовались в оптимальной дозе, что составило для Con A 2 мкг/мл, а для PWM -1 мкг/мл. Соединение в трех дозах вносили в лунки одновременно с митогенами. Пролиферативную активность клеток оценивали по включению Н³-тимидина в ДНК делящихся клеток. Метку вносили за 16 час до конца культивирования по 1 мкКи в каждую лунку планшета. Для этого основной раствор Н³-тимидина сначала растворяли в среде RPMI-1640 до концентрации 100 мкКи/мл, а затем по 10 мкл раствора добавляли в каждую лунку планшета. По окончании инкубации клетки собирали на стеклянно-волокнистые фильтры ("Flow Lab") с помощью аппарата Harvester ("Titertek"). Фильтры высушивали и помещали во флаконы для сцинтилляционного счета, и радиоактивность подсчитывали в толуольном сцинтилляторе (4 г дифенилоксазола, 0,1 г дифенил-оксазолилбензола на 1 л толуола) в жидкостном сцинтилляционном счетчике "Delta" (США). Результаты выражали в имп/мин включенного тимидина на 2×10⁵ клеток, представлены средние данные по триплету.

Как видно из таблицы 1, исследуемое соединение в дозе 300 мкг/мл достоверно ингибирует спонтанную и PWM- индуцированную пролиферацию

Пример 2. Определение количества Ig М антителообразующих клеток in vivo.

Соединение в дозе 1/10 LD₅₀ и в дозе 1/100 LD₅₀ (в объеме 0,5 мл) вводили мышам внутрибрюшинно один раз в сутки ежедневно в течение 5 дней. Контрольным животным в таком же объеме и режиме вводили растворитель соединения (воду). В день последнего введения соединения животных иммунизировали внутривенно эритроцитами барана (ЭБ) в дозе 0,5×10⁷/мышь. Количество IgM AOK в селезенке мышей оценивали на 4-е сутки после иммунизации по количеству зон локального гемолиза в полужидкой среде модифицированным методом Cunningham (1968). Результаты выражали в абсолютном количестве IgM AOK в селезенке.

Как видно из таблицы 2, трис-(2-гидроксиэтил)аммониевая соль 2-метилиндолил-тиоуксусной кислоты в дозе 300 мг/кг проявляет выраженный стимулирующий эффект на первичный гуморальный ответ, в то время как в дозе 30 мг/кг - стимулирующий эффект недостоверен.

Пример 3. Реакция гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) in vivo.

Опытной группе животных соединение вводили в дозе 1/10 LD₅₀ внутрибрюшинно ежедневно в течение 5 дней в объеме 0,5 мл. В день последнего введения соединения мышей сенсибилизировали внутрибрюшинным введением 0,25% ЭБ в объеме 0,5 мл; на 4-е сутки после сенсибилизации вводили разрешающую дозу антигена под подошвенный апоневроз правой задней лапы (50% ЭБ в объеме 50 мкл). В контрлатеральную лапу вводили растворитель в том же объеме. Контрольным животным в таком же объеме и режиме вводили растворитель соединения (воду). Реакцию ГЗТ оценивали по методике локальной ГЗТ (Crowie, 1975). Учет реакции производили через 24 часа после введения разрешающей дозы ЭБ, величину отека оценивали штангенциркулем. Результаты выражали в процентах или абсолютных значениях.

Как видно из таблицы 3, соединение достоверно ингибирует клеточный иммунный ответ (ГЗТ) в дозе 300 мг/кг (1/10 LD₅₀).

Приведенные примеры иллюстрируют наличие у трис-(2-гидрокси-этил)аммониевой соли 2-метилиндолилтиоуксусной кислоты способности избирательно воздействовать иммунные реакции (стимуляция гуморального иммунитета, ингибиция клеточного иммунитета и пролиферативной активности иммуноцитов селезенки). Это позволяет отнести данное соединение к иммуномодуляторам разнонаправленного действия и в будущем создавать на его основе лекарственные препараты для лечения различных иммунокомпрометированных состояний.

Предложено: применение трис-(2-гидроксиэтил)аммониевой соли 2-метилиндолил тиоуксусной кислоты в качестве иммуномодулятора, ранее известной как стабилизатор клеточных мембран. Изобретение расширяет арсенал средств заявленного назначения. 3 табл.

Применение трис-(2-гидроксиэтил)аммониевой соли 2-метилиндолилтио-уксусной кислоты в качестве иммуномодулятора.