Способ выделения рибонуклеазы Советский патент 1980 года по МПК C12D13/10 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способу выделения рибонуклеазы, используемой в пищевой промышленности для удаления ВНК из белкововитаминных концентратов и.улучшения их пищевой ценности, в медицине, а также в биохимических синтезах полинукл отидов и их исследованиях, изучения. строения рибонуклеиновых кислот и белков. Известен способ выделения и очист ки щелочной РНКазы из культуральной жидкости Penicit-feium brevicompactum согласно которому для получения щелочной РНКазы из культуральной жидкости осаждают ферменты сульфатом аммония при 0,9 насыщении, осадок от деляют на суперцентрифуге, растворяю повторно центрифугируют и диализуют Раствор после диализа очищают хрома тографией на ДЭАЭ-целлюлозе, КМ-целл лозе и сефадексе G-75, Перед каждой стадией хроматографии растворы с фе ментом концентрируют и диализуют, Концентрат щелочной РНКазы хранят при +4 С или при -5° С в глицерине 1 Известен способ выделения рибонуклеазы из культуральной жидкости Penici.ium..brevicorapactum,. являющийся наиболее близким техническим решением к изобретению, предусматривающий хроматографирование культуральной жидкости, ультрафильтрацию полученного элюата и диализ 2. Однако известный способ предусматривает п.олучение только кислой рибонуклеаэы, при зтом способ является лабораторным и ке позволяет получить большие количества фермента. Целью изобретения является разработка промьиаченного способа получения кислой и щелочной рибонуклеазы в одной технологической схеме, повышение степени их чистоты, упрощение процесса и повышение выхода целевого продукта. Поставленная цель достигается тем, что хроматографирование культуральной жидкости осуществляют в три стадии, ка первой из которых культуральную жидкость пропускают через последовательно установленные среднеосновной и высокоосновной аниониты, после чего элюат концентрируют ультрафильтрацией и диа.пизуют, на второй стадии полученный раствор хромйтографируют на КМ-целль лозе, концентрируют ультрафильтрацией и диалиэуют, затем на третьей стадии проводят гель-хроматографию на сефадексе G-75 с получением двух фракций, одну из которых, содержащую кислую рибонуклеазу, диализуют и сушат, а другую - щелочную риеЭонуклеазу - концентрируют ультрафильтрацией и кристаллизуют диализом При этом в качестве среднеосновного анионита используют смолу ЭДЭ-1ОП в Сб -форме, а в качестве высокоосноного анионита - анионообменное волокно ЦМ-А2 в сг -форме.

Сущность способа заключается в следующем.

Отфильтрованную культуральную жидкость Penicietium Ьrevicompacturn пропускают с высокой скоростью сначала через колонку со среднеосновным анионитом, например ЭДЭ-1ОП, где удаляются сильнокислотные примеси, затем через колонку, заполненную высокоосновным анионообменным волокном на целлюлозной основе, например ЦМ-А2. Насыщенную ферментом колонку промывают водой и десорбируют ферменты 0,5 н. NaCe в 0,1 н. ацетатном буферном растворе с рН-5,0. Активные элюаты концентрируют ультрафильтрацией, диализуют, хроматографируют на КМ-целлюлозе и сефадексе G-75. После сефадекса G-75 получают гомогенные фракции кислой и отдельно щелочной рибонуклеаз. Выход растворов кислой РНКазы составляет 50-60%, а щелочной РНКазы 26-30%.

Затем раствор щелочной РНКазы диализуют против 0,01 н. трис-ацетатного буферного раствора с рН-3,5. При диализе щелочная РНКаза выкристаллизовывается. Кристаллы фильтруют и сушат под вакуумом.

Раствор кислой РНКазы диализуют против 0,01 н. трис-НС буферного раствора с рН-7,0 и сушат лиофильно, как обычно.

Пример. 2бОл отфильтрованной культуральной жидкости с температурой 4-бС пропускают со скоростью 100 л/ч через колонку (80x200 см) с 8 кг анионита .10П (Се -форма) .

Затем раствор подщелачивают до рН-7,1 и пропускают со скоростью 90 л/ч через колонку (20x130 см) с 5 кг анионообменного волокна ЦМ-А2 (Сб-форма)-. Колонку промывают 100 л дистиллированной воды с той же скоростью. Десорбцию ведут 0,5 н. NaCE в 0,1 н. ацетатном буферном растворе с рН-5,0 со скоростью 5 л/ч. Активные элюаты (30 л) концентрируют

при рН-7,0 на ультрафильтре с мембранной УАМ-100 при давлении 2 атм. Получают 500 мл концентрата, который диализуют через целлофан против 0,01 н. трис-ацетатного буфера с рН-4,3. Раствор наносят на колонку (10x50 см) с КМ-целлюлозой, их промывают 0,01 н. трис-ацетатным буфером с рН-4,5 и элюируют ферменты линейным градиентом NaCt. от О до 1 н. в 0,01 н. трис-ацетатном буфере с рН-4,5 со скоростью 100 мл/ч. Полученные 1000 мл активных фракций концентрируют ультрафильтрацией, диализуют и наносят на колонку (3x100 см с сефадексом G-75. Элюцию ведут 0,1 н. КСе в 0,05 н. трис-НСС буфере с рН-7,5 со скоростью 60 мл/ч. Получают 200 мл фракции, содержащей кислую РНКазу и 210 мл фракции, содержащей щелочную РНКазу. Препараты электрофоретически гомогенны и не проявляют ФМЭ-азной, ФДЭ-азной и ДНК-азной активности. Раствор кисло РНК-азы диализуют против 0,01 н. трис-НСС буфера с рН 7,0 и сушат лиофильно, как обычно.

Раствор щелочной РНК-азы концентрируют ультрафильтрацией до 10 мл и диализуют против 0,01 н. трис-ацетатного буфера с рН-3,5. В процессе диализа выпадает кристаллическая соль щелочной РНК-азы, которую отфильтровывают и сушат в вакуум-сушильном шкафу без нагрева. Получают 500 мг кристаллического порошка с выходом 26,0% от содержания щелочно РНК-азы в культуральной жидкости

В таблице даны следующие этапы очистки предлагаемым способом:

1)осаждение сульфатом аммония, центрифугирование, растворение осадка, центрифугирование;

2)диализ, гель - хроматографии на G-100;

3)ультрафильтрация, диализ, хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе;

4)ультрафильтрация, диализ, хроматография на КМ-целлюлозе;

известным способом:

1)очистка на ЭДЭ-10, сорбция, десорбция на ЦМ-2, ультрафильтрация

2)диализ, хроматографии на КМ-целлюлозе;

3)ультрафильтрация, диализ, гель-хроматография на G-75.

В таблице приведены данные указаного примера в сравнении очистки килой рибонуклеазы с литературными даными известного лабораторного метод получения кислой рибонуклеазы. Применение предлагаемого метода позволяет одновременно получать оба фермента в одном технологическомпро цессе, повышенной степени чистоты, значительно упростить технологичес} ую схему и повысить вьоход кислой РНК-азы до стадии диализа и сушки в среднем на 12% против известного лабораторного способа. Предлагаемый способ позволяет получать большие ко личества ферментов в промышленных ус ловиях. Формула изобретения 1. Способ выделения рибонуклеазы из культуральной жидкости Penici im brevicompactmn, предусматривающий хроматографирование культуральной жидкости, ультрафильтрацию полученно го элюата и диализ, отличающ и и с я тем, что, с целью одновре менного выделения кислой и щелочной рибонуклеаз, повышения степени их чистоты, упрощения процесса и увеличения выхода ферментов, хроматографирование культуральной жидкости осу ществляют в три стадии, на первой и которых культуральную жидкость пропускают через последовательно уста-новленные среднеосновной и высокоосновной аниониты, после чего элюат концентрируют ультрафильтрацией и диализуют, на второй стадии полученный раствор хроматографируют на КМ-целлюлозе, концентрируют ультрафильтрацией и диализуют, затем на третьей стадии проводят гель-хроматографию на сефадексе G-75 с получением двух фракций, одну из которых, содержс1щую кислую рибонуклеазу, диализуют и сушат, а другую - щелочную рибонуклеазу - концентрируют ультрафильтрацией и кристгшлиэуют диализом. 2. Способ по п. 1, отличающ и и с я тем, что в качестве среднеосновного анионита используют смо-. лу ЭДЭ-ЮП в се -форме, а в качестве высокоосновного анионита - анионообменное волокно ЦМ-А2 в Ct -форме. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1,Прикладная биохимия и микробиология, 1974, т. 5, вып. 3, с. 432. 2.Прикладная биохимия и микробиология. 1972, т. 8, вып. 2, с. 226 (прототип).