ДИЭТИЛАМИНОЭТИЛОВЫЙ ЭФИР ЦЕЛЛЮЛОЗЫ В КАЧЕСТВЕ СОРБЕНТА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ И СПОСОБ ОЧИСТКИ СТРЕПТОКИНАЗЫ Российский патент 1997 года по МПК C08B11/145 C08B15/06 C12N9/70 B01J20/24 

Изобретение относится к физико-химическому разделению веществ, а именно к матрицам для хроматографии и способам их получения и применения для очистки биологически активных веществ (БАВ).

Известно широкое применение для хроматографии гелей на основе агарозы, производных декстранов, полиакриламидов (1-4).

Недостатком этих сорбентов является их высокая стоимость, в ряде случаев токсичность или плохие гидродинамические характеристики, относительно низкая проницаемость, отсутствие комплекса необходимых характеристик, что затрудняет их применение в медицине и биотехнологии, сложная технология их получения.

Широкое применение в биотехнологии получили сорбенты на основе целлюлозы, в частности микрокристаллическая целлюлоза (МКЦ) (5).

МКЦ обладает достаточно высокой прочностью, перспективна в качестве матрицы для создания сорбентов на ее основе.

Недостатком МКЦ являются низкие гидродинамические характеристики, недостаточно развитая поверхность, широкая дисперсия свойств, низкий предел проницаемости.

Известны способы получения дисперсий целлюлозы с частицами более правильной формы. Так, предлагается получать гранулы из растворов вискозы или раствора целлюлозы в реактиве Швейцера с последующим диспергированием в неполярных жидкостях для получения сферических микрогранул целлюлозы (6, 7).

Недостатком этих способов является слабая разветвленность поверхности сорбента, относительно малая жесткость частиц, большой разброс свойств по размерам частиц, трудность получения воспроизводимых свойств материалов.

Прототипом изобретения является способ получения микрогранулированной целлюлозы, основанный на диспергировании целлюлозы кальций тиоционатного водного раствора или геля в органическом растворителе с последующим выделением целлюлозы добавкой метанола. Частицы обладали высокой пористостью и прочностью, что позволяет проводить процессы гельфильтрации с высокими скоростями. Кроме того, варьирование концентрации и молекулярного веса целлюлозы позволяет получать материал с регулируемым размером пор от сот до нескольких тысяч ангстрем.

Технология включает в себя промывание МКЦ и растворение ее в 59%-ном растворе роданистого кальция при 120-140^oC в отсутствии воздуха, охлаждение раствора до 80^oC, диспергирование в 3-4 объемах дихлорбензола в присутствии диспергатора моноолеата сорбитола (СПАН-80) с последующим введением больших объемов метанола, отмывкой частиц геля метанолом, водой с последующим фракционированием (8).

Недостатками прототипа являются многостадийность, повышенные требования к качеству исходных реагентов, использование токсичных веществ.

Авторы рассмотрели проблему упрощения технологии получения микрокристаллической целлюлозы при одновременном решении проблемы получения крупнопористой матрицы, пригодной для создания новых сорбционных материалов на ее основе.

Известен способ выделения стрептокиназы из смеси белков обработкой ее сначала восстановителем, а затем реагентом, связывающим белки, и их отделением. (акц. ЕПВ N 0365278).

Недостатком способа является низкая чистота продукта, нетехнологичность способа.

Известен способ очистки стрептокиназы (а.с. N 1147749), заключающийся в диализе против фосфатного буфера с последующей хроматографией на фосфате кальция.

Недостатком способа является многостадийность, малая разделительная способность сорбента, относительно низкий выход целевого продукта
Прототипом сорбента и способа очистки стрептокиназы из смеси (а.с. N 840100) и сорбент ДЭАЭ-агароза. Способ заключается в подкислении реакционной смеси и последующей хроматографии на двуокиси кремния или на ДЭАЭ-агарозе, элюцией фермента в линейном градиенте смесью фосфатного буфера и хлористого натрия при рН 7,6-8,0.

Выход стрептокиназы около 50% активность 60-80 тыс. ед/мг.

Из упомянутых источников следует, что в качестве сорбентов для очистки стрептокиназы использовались двуокись кремния, фосфат кальция, а также являющаяся прототипом ДЭАЭ -агарозы (а.с. N 840100).

Недостатками сорбентов является их относительно низкая разделительная способность.

Задачей авторов являлось создание более эффективного способа получения матрицы, сорбента для выделения и очистки ферментов и технологии хроматографической очистки стрептокиназы.

Первая часть задачи была решена путем замены дихлорбензола на трансформаторное масло и применением для выделения частиц вместо метанола - гексана и ацетона.

Полученный продукт имеет узкий диапазон физико -химических параметров и не требует дополнительного фракционирования благодаря высокому выходу целевой фракции. Полученный гранулированный препарат, которому дали название "Сфероцелл", может быть сразу конвертирован в сорбенты с характеристиками, превышающими характеристики сорбентов, полученных на основе известных матриц целлюлозы.

В частности, был получен сорбент, названный диэтиламиноэтил сфероцелл (ДЭАЭ-сфероцелл), общей формулы (С₂H₃)₂N-V₂H₄-O-R, где R матрица "Сфероцелл", который обладал повышенными сорбционными свойствами по отношению к ферментам, что позволяло его использовать для выделения и очистки стрептокиназы.

Сорбент получают обработкой матрицы "Сфероцелла" эпихлоргидрином и гидрохлоридом диэтиламино-этилхлорида (ДЭАЭ-НСl) в щелочной среде при повышенной температуре в диапазоне 40-60^oC.

Сопоставление свойств заявляемого сорбента с наиболее близким к нему по свойствам сорбентом Whatman ДЕ (9) показывает, что при близости физико-химических характеристик использование нового сорбента позволяет существенно повысить выход стрептокиназы. Сопоставление характеристик приведено в табл. 1.

Очистка стрептокиназы осуществляется пропуска6нием смеси белков, содержащей стрептокиназу, через сорбент, уравновешенный фосфатным буфером с электропроводностью 5,9±0,3 мк сим/см и элюированием фосфатным буфером с электропроводностью 10,0±0,6 мк сим/см, причем весь процесс осуществляют при рН 7,0±0,1.

Выход за пределы рН и электропроводности снижает чистоту получаемого продукта.

В изученной литературе отсутствуют данные об использовании аналогичной технологии матрицы и сорбентов на ее основе с улучшенными характеристиками, что позволяет сделать вывод о соответствии указанной группы изобретений критериям "новизна" и "изобретательский уровень".

Пример 1. Получение матрицы "Сфероцелл". 1,8 кг микрокристаллической целлюлозы загружают в аппарат, содержащий 26 л 59%-ного раствора роданистого кальция, где выдерживают для набухания в течение 5-12 ч при 20-24^oC в атмосфере аргона, после чего нагревают до 115±5^oС до полного растворения МКЦ, после чего диспергируют в 0,6%-ном растворе СПАН-80 в трансформаторном масле в течение 1 ч и охлаждают. Из двух слоев жидкости верхний (масло) сливают, а нижний обрабатывают 40 л гексана, декантируют гексан-масляный слой, после чего отмывают гексаном и ацетоном и дистиллированной водой. Выход гидратированной дисперсии сфероцелла (влагосодержание 90%) 21,8 кг.

Пример 2. Получение ДЭАЭ-Сфероцелла.

В суспензию Сфероцелла в воде, содержащую 22 кг гранул (влагосодержание 90% ) и 25 л воды, добавляют 1,5 л эпихлоргидрина и 5 кг гидрохлорида диэтиламиноэтилхлорида. Смесь перемешивают 2 ч при 20-24^oC, затем при перемешивании добавляют 10 кг NaOH, после чего выдерживают 4 ч при 60±5^oC, охлаждают, нейтрализуют добавкой 16 л концентрированной НСl. Отделяют и отмывают гранулы, после чего процедуру обработки гранул диэтиламиноэтилхлоридом повторяют еще раз.

Отмытую дисперсию обрабатывают 100 л 0,1 н. NaOH в течение 2 ч при 20-24^oC, затем гранулы отделяют декантацией. Выход 27 кг.

Пример 3. Очистка стрептокиназы.

Процесс очистки стрептокиназы проводят при значениях рН буферных растворов в интервале от 6,9 до 7,1. За пределами этого интервала наряду с целевым продуктом стрептокиназой -сорбируется стрептолизин "0", отделение от которого является целью процесса. Кроме того, при рН > 7,1 активность стрептокиназы падает вследствие конформационной неустойчивости молекулы.

Исходный раствор осадка сырой стрептокиназы с активностью 2,16•10⁶ МЕ/мл и концентрацией белка 7,8% разбавляют до концентрации белка в растворе С_б 4,5% Получают раствор для хроматографии с активностью стрептокиназы 1,208•10⁶ МЕ/мл и специфической активностью 167,8 МЕ/мкг.

На колонку (1х30) со Сфероцелл-ДЭАЭ загружают 12 мл раствора для хроматографии, т.е. 14.496•10⁶ МЕ. Элюцию ведут при рН 7,0 и электропроводности 6,2 мСм/см, получают 316 мл элюата 1 с активностью 6800 МЕ/мл, всего 2,15•10⁶ МЕ стрептокиназы или 14,8%
Элюцию 2 ведут фосфатным буфером рН 7,02 и κ=10,2 мСм/см. Получают 225 мл алюата с активностью 53125 МЕ/мл, суммарно 11,96•10⁶ МЕ или 82,6% Специфическая активностью А_сп 503 МЕ/мкг азота.

Пример 4. Очистка стрептокиназы.

Исходный раствор сырой стрептокиназы А_ск 2,16•10⁶ МЕ/мл, концентрация белка 7,8% А_сп 173 МЕ/мкг азота, разбавляют до концентрации белка в растворе 3,55% На колонку (1х30 см) загружают 15 мл разбавленного раствора для хроматографии с активностью 0,98•10⁶ МЕ/мл и Сбелка 3,55%
Элюцию 1 ведут при рН 6,93 и электропроводности 5,6 мСм/см. Получают 285 мл элюата с активностью 6175 МЕ/мл, суммарно: 1,76•10⁶ МЕ, т.е. 11,97
Элюцию 2 ведут при рН 7,05 и κ=9,8 мСм/см.. Получают 178 мл раствора с активностью 69380 МЕ/мл, суммарно: 12,35•10⁶ МЕ, т.е. 84%
В отдельном эксперименте изучалась зависимость очистки стрептокиназы от электропроводности буфера 1 (табл. 2).

При снижении электропроводности буфера 1 потери стрептокиназы в элюате 1 систематически снижаются. Специфическая активность стрептокиназы при изменении электропроводности от 5,6 до 6,2 мСм/см практически не изменяется, но значительно снижается при использовании буфера с электропроводностью 4,5 мСм/см, т. е. значительно ухудшается очистка стрептокиназы. При увеличении электропроводности свыше 6,2 мСм/см резко снижается сорбция стрептокиназы, она не удерживается на сорбенте, попадает в проскок.

При изменении электропроводности буфере 2 с 8,6 до 11,6 несколько возрастает выход стрептокиназы в элюате 2. При электропроводности 8,6 и ниже стрептокиназа начинает десорбироваться вместе со стрептолизином, т.е. очистка очень мала. При электропроводности 11,6 мСм, начинает десорбироваться балластный фермент стрептодорназа, очистка также ниже требований.

Пример 5. Хроматографическое выделение интерлейкина 1 генноинженерного происхождения на сорбенте Сфероцелл ЛЕАЕ.

Через колонку (К 50х30), содержащую 150 см³ Сфероцелла ДЕАЕ, с помощью перистальтического насоса прокачивают раствор белка с концентрацией 0,7 мг/см³ в трис-ацетатном буфере (концентрация 0,01 моль/дм³, рН 8,10±0,05) в количестве 1 дм³, со скоростью 150±10 см³/ч. Затем сорбент промывают 1±0,05 дм³ трис-ацетатного буфера (концентрация 0,01 моль/дм³, рН 8,1±0,05). Элюцию осуществляют также трис-ацетатным буфером (концентрация 0,05 моль/дм³, рН 8,1±0,05).

Активную фракцию начинают собирать через 75-100 см³. Ее объем равен 700±10 см³, концентрация белка составляет 0,42 мг/см³. Степень очистки по белку составляет 2,5 раза ±0,1.

Пример 6. Хроматографическая очистка гепарина на сорбенте Сфероцелл ДЕАЕ.

На колонку (К 50х30), содержащую 200 см³ Сфероцелл ДЕАЕ, наносят пробу белка: 800 мг в 5 мл (0,05 м/л, NH₄Cl; 0,5 м/л NaCl; 3,0 м/л мочевина, рН 7,9), элюцию ведут раствором того же состава с градиентом NaCl от 0,5 до 1,5 м/л (объем 400 мл). Активность основной фракции повышается на 30% (120 ед. (исх), 160 ед. (очищ.)) при выходе 74%
Как следует из приведенных данных, в результате использования изобретения удалось получить матрицу и новый анионит, позволяющий повысить выход высокоочищенных биопрепаратов.

Изобретение используется на полупромышленном производстве ГосНИИ ОЧБ и НИИТИФВ (в г. С.-Петербурге) с 1992 года.

Сущность изобретения. Диэтиламиноэтиловый эфир целлюлозы общей формулы: (C₂H₅)₂NC₂H₄-OR, где R - матрица микросферической гранулированной целлюлозы, которую получают растворением микрокристаллической целлюлозы в водном растворе роданида кальция, диспергированием полученного раствора в трансформаторном масле и выделением путем обработки полученной смеси гексаном с последующим отмыванием выделенного продукта гексаном, ацетоном и водой. Предложенное соединение используют в качестве сорбента для выделения и очистки ферментных препаратов, в частности для очистки стрептокиназы. 2 с. п. ф-лы, 2 табл.

1. Диэтиламиноэтиловый эфир целлюлозы общей формулы
(С₂Н₅)₂-NC₂H₄-OR,
где R матрица микросферической гранулированной целлюлозы, полученной растворением микрокристаллической целлюлозы в водном растворе роданида кальция, диспергированием полученного раствора в трансформаторном масле и выделением обработкой полученной смеси гексаном с последующим отмыванием выделенного продукта гексаном, ацетоном и водой,
в качестве сорбента для выделения и очистки ферментных препаратов. 2. Способ очистки стрептокиназы, включающий хроматографирование с использованием сорбента на основе диэтиламиноэтилового эфира полисахарида и выделение целевого продукта элюированием фосфатным буфером, отличающийся тем, что используют сорбент по п. 1, хроматографирование проводят путем обработки сорбента исходным раствором белков, содержащим стрептокиназу, в фосфатном буфере с электропроводностью 5,9 6,2 мкСим/см при рН 6,9 7,1 и выделяют целевой продукт элюцией фосфатным буфером с электропроводностью 9,4 10,6 мкСим/см при рН 6,9 7,1.