СПОСОБ ТВЕРДОФАЗНОЙ ФЕРМЕНТАЦИИ ТРАВЯНОГО ЖОМА ЛЮЦЕРНЫ Российский патент 1995 года по МПК C12N1/22 

Изобретение относится к биотехнологии процессов биохимической трансформации полисахаридов вторичных растительных субстратов путем культивирования на них высших базидиальных грибов методом твердофазной ферментации и может быть использовано в микробиологической, гидролизной и комбикормовой промышленности.

Известны способы химической и биохимической трансформации полисахаридов воздушно-сухих растительных субстратов путем кислотного гидролиза с последующей биохимической трансформацией в условиях жидкофазной ферментации [1] микробиологической и ферментативной биоконверсии с последующим использованием низкомолекулярных гидролизатов в виде белково-углеродных растворимых веществ, как по прямому назначению непосредственно в качестве корма в животноводстве, так и в виде сырья для процессов биосинтеза физиологически активных соединений.

Такие биотехнологические процессы переработки воздушно-сухих полисахаридов вторичных растительных отходов в значительной степени нашли практическое применение, тогда как технологическое решение утилизации полисахаридов травянистых субстратов с высоким содержанием влаги 70-90% не найдено.

Во всех приведенных технологических схемах отсутствуют замкнутость цикла и экологическая чистота процесса. Так, для решения задачи безотходности процесса производства, в котором отсутствуют вторичные жидкие и твердые сбросы, разработаны способы моноферментной и полиферментной спонтанной твердофазной ферментации вторичных травяных субстратов, осуществляемые эпифитной бактериальной и дрожжевой микрофлорой, в частности представителями родов Pseudomonas, Mycobacterium, Сhromobacterium, Micrococcus, Bacillus, Rhоdotorula, Debaryomeces, Cаndida, Cryptococcus, Sporobоlomусеs, Schizosaccharomyces и др.

При биоконверсии растительных субстратов, богатых растворимыми углеводами, наиболее существенную роль играют сообщества микроорганизмов, интенсивно сбраживающих углеводы, и, в частности, кислотообразующие гомоферментативные молочнокислые бактерии Lactobacillus plantarum, L. Brevis, L. fermenti, L. casei, Streptococcus faecalis, S. mesenteroides, а также гетероферментативные кокки рода Leuconostoc и др.

Несмотря на общую эффективность процессов спонтанной твердофазной ферментации за счет эпифитной микрофлоры с преобладанием молочнокислых бактерий, такие процессы технологически малоуправляемы и зависят в основном от наличия исходной спонтанной микрофлоры, которая определяется величиной 10⁶-10¹² клеток/г cубстрата, степенью факультативной анаэробности, влажностью исходного субстрата, температурой протекания процесса и стартовым наличием в исходном субстрате моносахаридов. Эффективность такого процесса определяется количественным соотношением продуктов метаболизма молочнокислых и уксуснокислых бактерий 3:1, рН 4,2-4,7, отсутствием масляной кислоты.

Предложена схема осуществления процесса твердофазной ферментации растительных субстратов, где для создания элективности среды вносят 6% поваренной соли на 12-15% измельченной сахарной свеклы, а также добавляют 6-7% мелассы или уксусной кислоты.

Известен способ интенсификации микробиологических процессов консервации растительных субстратов за счет внесения закваски парной культуры Lactobacterium и Streprocоccus, где для обеспечения стартового количества водорастворимых сахаров также прибавляют мелассные растворы.

Указанные процессы основаны на создании консервирующего эффекта за счет интенсификации процессов гидратации и высокой степени диссоциации растворов поваренной соли, действующей на цитоплазматические структуры. Благодаря развитию микроорганизмов в процессе спонтанной твердофазной ферментации растительных субстратов содержание бактериального протеина увеличивается, однако не компенсирует потери растительного белка.

Травяной жом люцерны является отходом переработки зеленой массы люцерны, из которой после операций фракционирования получают зеленый сок, направляемый на коагуляцию белков с получением вторичного отхода безбелкового коричневого сока, а травяной жом, содержащий после прессования 28-32% сухих веществ, отправляют на сушку.

Наиболее близким к предлагаемому способу твердофазной ферментации является способ консервации травяного жома люцерны (прототип), где в целях регуляции процесса ферментации для обеспечения элективности среды используют поваренную соль в количестве 1% от массы субстрата, 0,3% смесь муравьиной и пропионовой кислот или вносят 1% молочнокислой закваски.

К недостаткам данного способа следует отнести частичную замену растительных белков на белок одноклеточных, в данном случае бактерий, с более низким уровнем перевариваемости и наличие в продукте карбоновых кислот. Кроме того, количество кормовых единиц, сырого и перевариваемого протеина, белково-экстрактивных веществ и другие важные характеристики продукта, полученного по способу-прототипу, практически не отличаются от таковых у нативного пресс-остатка (табл.1), в связи с чем существует альтернативный способ сохранения качества травяного жома люцерны путем его сушки, реализуемый в процессе переработки люцерны.

Целью изобретения является повышение содержания белка и витаминов в конечном продукте ферментации травяного жома люцерны.

Это достигается тем, что ферментацию травяного жома осуществляют культурой дереворазрушающего базидиального гриба вешенка обыкновенная Pleurotus ostreatus (Fr. ) Kumm. ИБК-1019, трансформирующего лигноцеллюлозный матрикс травяного жома в грибную биомассу, причем в качестве комплексного индуктора гидролитических и окислительных ферментов, участвующих в трансформации лигноцеллюлозы, используют отход переработки зеленой массы люцерны нативный безбелковый коричневый сок.

Для реализации этой цели в нативный коричневый безбелковый сок, содержащий 8,5-9,2% сухих веществ, последовательно добавляют и растворяют минеральные соли из расчета, г/л: 1,5-2,0 фосфата аммония однозамещенного; 0,4-0,5 магния сернокислого; 0,5-0,6 фосфата калия однозамещенного; 0,3-0,4 фосфата калия двузамещенного, полученным раствором увлажняют травяной жом люцерны до 62-65% устанавливают рН субстрата 5,0-6,0, стерилизуют при 115^оС в течение 40 мин, охлаждают, засевают мицелием чистой культуры гриба из расчета 5-10% от массы субстрата и осуществляют процесс твердофазной ферментации при температуре субстрата 28-30^оС в течение 5-7 cут.

П р и м е р. В нативный безбелковый коричневый сок последовательно вносили и растворяли минеральные соли из расчета, г/л: 1,5-2,0 фосфата аммония однозамещенного; 0,4-0,5 магния сернокислого; 0,5-0,6 фосфата калия однозамещенного и 0,3-0,4 фосфата калия двузамещенного. Полученным раствором увлажняли сухой травяной жом люцерны до влажности 62-65% в случае необходимости устанавливали рН субстрата в интервале 5,0-6,0 и автоклавировали в колбах Эрленмейера 40 мин при 115^оС. Стерильный субстрат, охлажденный до комнатной температуры, высыпали в кюветы слоем 8-10 см и одновременно засевали стандартным посевным мицелием (на зерне ржи) Р. ostreatus ИБК-1019 из расчета 5-10% от массы субстрата. Процесс ферментации проводили в термостате при температуре 28-30^оС в течение 5-7 сут.

В качестве контроля проводили твердофазную ферментацию нативного травяного жома люцерны по способу-прототипу, для чего в траншею на открытом воздухе закладывали травяной жом люцерны влажностью 68-72% затем вносили 1% поваренной соли или смесь органических кислот (муравьиная: пропионовая, 1:1) 0,3% или вносили в нативный жом 1,0% молочнокислой закваски. Процесс полной ферментации завершался в течение 6 месяцев при подзимней закладке жома в сентябре месяце.

Сравнительный анализ исходного субстрата с конечным продуктом ферментации по заявляемому способу или с аналогичным продуктом, полученным по способу-прототипу, показывает, что помимо значительного сокращения сроков ферментации в субстрате, ферментированном культурой вешенки обыкновенной, происходит его значительное обогащение протеином, витаминами, жиром, повышаются общее содержание аминокислот (в том числе и незаменимых) и их баланс, а также кормовая ценность ферментированного жома (табл. 1, 2, 3). В результате функционирования гидролитических и окислительных ферментов (табл.4) происходит деполимеризация таких растительных полимеров, как целлюлоза и лигнин, что значительно повышает перевариемость субстрата. Иммобилизированные на субстрате экзоклеточные целлюлозы и оксидазы вешенки, оптимум действия которых находится в пределах 40-50^оС, способствуют дальнейшей трансформации корма в желудке животных. Наличие монофенол-монооксигеназы благоприятно сказывается на стабилизации микрофлоры кишечника и нейтрализации продуктов ее жизнедеятельности.

Из сравнительных показателей готового продукта твердофазной ферментации травяного жома люцерны культурой вешенки обыкновенной следует, что предложенный способ существенно отличается от известных ранее технических приемов твердофазной ферментации травяного жома люцерны и соответствует критерию "Новизна". При изучении других известных решений в данной области биотехнологии, признаки, отличающие заявляемое изобретение от прототипа, не были выявлены, и поэтому они обеспечивают заявляемому биотехнологическому решению соответствие критерию "Существенные отличия".

Предлагаемый способ твердофазной ферментации травяного жома люцерны разработан по планам научно-исследовательских работ Института ботаники им. Н.Г. Холодного АН УССР и будет использован в дальнейших разработках Института, связанных с созданием безотходных биотехнологических процессов использования вторичных растительных ресурсов.

Область использования: микробиологическая, гидролизная комбикормовая промышленность. Способ твердофазной ферментации травяного жома люцерны включает увлажнение жома и засев при этом увлажнение жома осуществляется до влажности 62 65% раствором нативного коричневого безбелкового сока, содержащего 8,5 9,2% сухих веществ, в которых последовательно добавляют до полного растворения минеральные соли из расчета, г/л: фосфат аммония однозамещенного 1,5 2,0; магнии сернокислый 0,4 0,5; фосфат калия однозамещенного 0,5 0,6; фосфат калия двузамещенного 0,3 -0,4 с последующим доведением pH субстрата до 5,0 6,0, стерилизацией при 115°С в течение 40 мин и охлаждением, а вкачестве культуры микроорганизмом используют штамм гриба pleurotus ostreatus ИБК 1019 в количестве 5 10% от массы субстрата, при этом процесс твердофазной ферментации осуществляют при температуре 28 - 30°С в течение 5 7 сут. 4 табл.

СПОСОБ ТВЕРДОФАЗНОЙ ФЕРМЕНТАЦИИ ТРАВЯНОГО ЖОМА ЛЮЦЕРНЫ, включающий увлажнение жома и засев культуры микроорганизмов, отличающийся тем, что увлажнение жома осуществляют до влажности 61 65% раствором нативного коричневого безбелкового сока, содержащего 8,5 9,2% сухих веществ, в который последовательно добавляют до полного растворения минеральные соли в следующих количествах, г/л:
Фосфат аммония однозамещенного 1,5 2,0
Магний сернокислый 0,4 0,5
Фосфат калия однозамещенного 0,5 0,6
Фосфат калия двузамещенного 0,3 0,4
с последующим доведением рН субстрата до 5,0 6,0, стерилизацией при 115^oС в течение 40 мин и охлаждением, а в качестве культуры микроорганизмов используют штамм гриба Pleurotus ostreatus ИБК 1019 в количестве 5 10% от массы субстрата, при этом процесс твердофазной ферментации осуществляют при 28 30^oС в течение 5 7 сут.