Способ идентификации штаммов гомобазидиальных грибов Советский патент 1992 года по МПК C12Q1/68 C12Q1/02 C12Q1/06 C12Q1/34 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам определения идентичности мицелиальных культур, в частности гомобазидиальных грибов.

Определение видовой принадлежности гомобазидиомицетов базируется преимущественно на признаках строения плодового тела грибов. Идентификация культур этих грибов основана на комплексе признаков макро- и микроморфологии, ферментативной активности мицелия (макрохимические цветовые реакции) и линейной скорости роста колонии. Совокупность этих показателей, однако, не является надежным критерием для разграничения видов бази- диальных грибов, обладающих в отличие от других групп грибов достаточно однотипной структурой вегетативного мицелия.

Имеющиеся ключи для идентификации культур некоторых дереворэзрушающих афиллофоральных грибов во многих случаях позволяют провести определение только до рода, или же одно описание соответствует группе близких видов. Аналогичные ключи для агарикальных грибов не разработаны.

Отсутствие надежных видовых, а тем более штаммоспецифичных культуральных признаков гомобазидиомицетов делает актуальным хемотаксономические подходы в систематике этой группы грибов, основанные на определении изоферментных спектров методом гель-электрофореза.

При решении задачи разграничения штаммов гомобазидиальных грибов наиболее близким к изобретению по технической сущности является способ определения изоферментного состава глюкозо-6-фос- фат-дегидрогеназы, в частности показаны различия по данному показателю у четырех штаммов съедобного культивируемого гриба вешенка обыкновенная. Недостатком данного метода является изменчивость изоферментных спектров грибов, зависящая от возраста культуры или связанная с проявлением биоритмов различной длительности, что у базидиальных грибов выражается в наличии сезон-специфичных изоформ

ч S4

Jb 00 СЛ

СА

некоторых ферментов. Такая вариабельность изоферментных спектров приводит к тому, что этот показатель чаще используется при установлении границ между отдельными видами, например, в роде Agaricus, чем для диагностики штаммов,

Целью изобретения является повышение точности идентификации штамма гомо- базидиомицета в пределах одного вида.

Поставленная цель достигается благодаря тойу нтв идентификацию основывают на однозначном взаимодействии гаплоидных мицели§в, определяемом экспрессией штаммоспецифичных аллелей генов системы половой несовместимости, для чего проводят расщепление испытуемого дика- риотического штамма на две гаплоидные культуры, осуществляют скрещивание испытуемых гаплонтов с тестерными гаплон- тами базисного штамма и по результатам скрещивания, критерием осуществления которого является образование дикариоти- ческого мицелия с пряжками, устанавливают идентичность штаммов, где у видов с биполярной системой половой несовместимости гаплонты идентичных штаммов имеют частоту скрещивания 50%, а у видов с тетраполярной системой половой несовместимости гаплонты идентичных штаммов имеют частоту скрещивания 25%.

Пример 1. Требуется установить идентичность двух штаммов гомобазидио- мицета, имеющего биполярную систему половой несовместимости.

Споры из базидиоспорового отпечатка Phlebla merismoldes Fr. суспендируют в стерильной водопроводной воде и готовят из нее а малых химических пробирках с 5 мл стерильной водопроводной воды 3-5 последовательных разведений 1:10. Разведенную суспензию базидиоспор высевают по 0,5 мл в чашки Петри на агаризованное пивное сусло (8° по Баллингу, рН 5,5) и равномерно распределяют по поверхности ага- ра микробиологической петлей или шпателем. Через 24ч чашки помещают под световой микроскоп с объективом хЮ и находят проросшую спору. Убедившись в отсутствии в поле зрения других проросших или непроросших базидиоспор, выводят найденную проросшую спору в центр поля зрения микроскопа и полностью закрывают полевую диафрагму микроскопа. При этом в толще агара высвечивается световой столбик, на вершине которого находится необходимый проросток. Поворачивают в сторону револьвер с объективом и вырезают из чашки агаровый столбик со спорой, обрезанной медицинской иглой с заточенными краями. Диаметр иглы подбирают

меньше поля зрения микроскопа, но больше диаметра светового пучка при закрытой полевой диафрагме. Возвращают объектив в исходное положение и контролируют точность вырезания споры. Медицинскую иглу подсоединяют к стерильному шприцу и выдувают агаровый столбик с проросшей спорой в чашку Петри со свежей сусло-агаровой средой. На одну чашку помещают около десяти выделенных спор. Выросшие колонии микроскопируют и те, которые не имеют пряжек, отсевают на скошенный агар в пробирки. Отбор комплементарных гаплонтов проводят на сусло-агаровой среде в чашках

Петри, размещая тестируемые пары гаплонтов на расстоянии 2 см друг от друга. В случае мицелиального контакта двух колоний через 7-10 сут микроскопируют мицелий, образующийся в зоне контакта, и при

наличии пряжек отмечают такие кроссы как положительные (табл. 1).

Выявленные группы гаплонтов противоположного типа спаривания маркируют (произвольно) как группу с AI и Аа фактором

несовместимости. Любая из гаплоидных культур данной группы может быть тест-культурой для сконструированного ди- кариона. Например, для дикариона, составленного из гаплонтов 2 и 7, отличающегося

среди других дикарионов наибольшей цел- люлазной активностью, в качестве тест- культур данного дикариотического штамма могут выступать не только гаплонты 2 и 7, но и другие гаплонты, несущие AI и А2 факторы

половой несовместимости.

Для установления идентичности дикариотического штамма P. merismoides 27 (составлен из гаплонтов 2 и 7) с другим дикариотическим штаммом этого вида проводят расщепление испытуемого штамма на два гаплонта. Для этого мицелий испытуемого штамма вносят в колбы Эрленмейра емкостью 0,5 л, содержащие 0,15 л стерильного жидкого пивного сусла 4° по Баллингу,

рН 5,5. Выращивание проводят при 25°С в стационарныхуслооиях. Выросшую биомассу отделяют от культуральной жидкости, переносят в стакан гомогенизатора типа 302 (ПНР), доводят до контрольной метки стерильной водопроводной водой и измельчают при 10 тыс. оборотов в минуту в течение 5 мин. Гомогенат содержит фрагменты мицелия длиной не более 500 мкм, состоящие из нескольких клеток гифы. Полученный гомогенат разоодяг стерильной водопроводной водой 1:100 и используют в качестве инокулюма (0,5 мл) на 50 мл среды следующего состава, г/л: глюкоза 20,0; глицин 5,0; мясной пептон 10,0. Среду указанного состава стерилизуют в колбах Эрленмейра емкостью 0,Ь л 15 мин при давлении пара 0,1 мПа. По мере роста глубинных шариков мицелия периодически проводят микро- скопирование краевых гиф мицелия на наличие пряжек. Через 7-10 сут выращивания на качалке, когда мицелиальные шарики достигнут размера 2-4 мм и большинство из них не будет иметь краевых дикариотиче- ских гиф, биомассу отделяют от среды и проводят повторную гомогенизацию в ука- занном выше режиме. Полученный гомоге- нат разводят стерильной водопроводной водой 1:10 и высевают по 0,5 мл на агаризо- ванное пивное сусло в чашки Петри. Выросшие колонии проверяют под микроскопом на отсутствие пряжек и отсевают в качестве испытуемых гаплонтов. Один из произвольно выделенных гаплонтов скрещивают с 5-6 другими гаплонтами или с большим числом до тех пор, пока не обнаружится комплементарный гаплонт, формирующий дикари отический мицелий. Отобранные два комплементарных гаплонта испытуемого штамма скрещивают с тестерными гаплонтами базисного штамма. Если частота скрещивания между ними равна 50%, то сравниваемые дикариотические штаммы идентичны. При всех других значениях частоты скрещивания дикариотические штаммы имеют различное происхождение (табл. 2).

Пример 2. Требуется установить идентичность двух штаммов гомобазидио- мицета, имеющего тетраполярную систему половой несовместимости.

Выделяют гаплонты Pleurotus ostreatus (Fr.) Kumm. из базидиоспор, как это описано в примере 1. Для выделения тестерных гаплонтов производят скрещивание 14-16 культур, выделенных из базидиоспор, как это описано в примере 1 (табл. 3).

Выявленные группы гаплонтов противоположного типа спаривания маркируют (произвольно) как группы с AiBi, АаВз, AiB2 и AaBt факторами несовместимости. В каж- дои группе из четырех типов спаривания выбирают одну гаплоидную культуру в качестве тестерной. Например, выбраны гаплонты 3, 6,5, 12 и из первых двух составлен дикариотический штамм 36.

Для установления идентичности дика- риотического штамма 36 с другим дикариотическим штаммом этого вида производят расщепление испытуемого штамма на два комплементарных гаплонта, как это описано в примере 1. Эти два гаплонта скрещивают с тестерными гаплонтами базисного штамма. Если частота скрещивания между ними равна 25%, то сравниваемые дикариотические штаммы идентичны. При всех других значениях частоты скрещивания дикариотические штаммы имеют различное происхождение (табл. 4).

Таким образом, предлагаемый способ идентификации штамма гомобазидиэльных грибов может быть реализован на основе общепринятых микробиологических приемов обращения с культурами грибов, причем экспрессия уникальных генов системы половой несовместимости скрещиваемых гаплонтов определяется по морфологическому маркеру на гифах мицелия (пряжке) методом световой микроскопии.

Практическая реализация изобретения создает основу для решения проблем правоохранное™ объекта при внешнеторговой реализации лицензии и осуществлении авторского надзора за штаммом гомобазиди- ального гриба.

Формула изобретения

1.Способ идентификации штаммов го- мобазидиальных грибов, отличающий- с я тем. что, с целью повышения точности идентификации штамма в пределах одного вида, получают тестерные гаплонты из базисного штамма, выделяют гаплонты из исследуемого штамма, скрещивают полученные гаплонты и идентифицируют штамм по частоте скрещивания гаплонтов, которую выявляют по наличию пряжки у дикариоти- ческого мицелия.

2.Способ по п. 1,отличающийся тем, что при идентификации штаммов с биполярной системой несовместимости идентифицируют исследуемый штамм как идентичный базисному штамму при частоте скрещивания гаплонтов 50 %.

3.Способ по п. 1,отличающийся тем. что при идентификации штаммов с тет- раполярной системой несовместимости идентифицируют исследуемый штамм как идентичный базисному штамму при частоте скрещивания гаплонтов 25 %.

Таблица 1 Выявление комплементарных гаплонтов у P.merismoides

Использование: биотехнология, а именно способы определения идентичности мицелиальных культур. Сущность изобретения; способ заключается в скрещивании испытуемых гаплонтов с тестерными гаплонтами базисного штамма. По результатам образования дикариотического мицелия с пряжками устанавливают идентичность штаммов, где у видов с биполярной системой несовместимости гаплонты идентичных штаммов имеют частоту скрещивания 50%, а у видов с тетраполярной системой - 25%. 2 з.п.ф-лы.

Таблица2

Варианты скрещивания тестерных гаплонтов базисного дикариона Phlebia merismoides с гаплонтами дикарионов, имеющих различные аллели спаривания

Тестерные гаплонты базисного дикариона шт.2 AJ

шт.7 А2 Частота скрещивания

А +

iij.ii

фактор системы половой несовместимости, цифра обозначает

аллельность;

гаплоидные культуры совместимы, образуется дикариотический

мицелий с пряжками;

культуры несовместимы, контакт гиф и образование дикариона

не происходит

ц+

15%

100

явление комплементарных гаплонтов P.ostreatus

и. + - культуры совместимые; - - культуры несовместимые

Таблица 4

Варианты скрещивания тестерных гаплонтов базисного дикариона Pieurotus ostreatus с гаплонтами дикарионов, имеющих различные аллели спаривания

1771485

10 ТаблицаЗ