СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К Т-ЛИМФОТРОПНОМУ ВИРУСУ ЧЕЛОВЕКА I ТИПА Российский патент 1995 года по МПК A61K38/02 G01N33/53 

Изобретение относится к иммунной биотехнологии и лабораторной диагностике и может быть применено при конструировании диагностических тест-систем, предназначенных для определения антител к Т-лимфотропному вирусу человека I типа HTLV-I.

Для скринирующего определения противовирусных антител, в настоящее время, используют иммунодиагностические тест-системы на основе иммуноферментного анализа (ИФА), радиоиммунного анализа РИА), иммунофлюоресценции (ИФ), реакции пассивной агглютинации (РПА) и других методов, в которых в качестве антигенного компонента применяют вирусный лизат, рекомбинантные белки и синтетические пептиды. Тест-системы на основе синтетических пептидов, имитирующих антигенные детерминанты вирусных белков и способных к специфическому взаимодействию с противовирусными антителами, представляют диагностикумы нового поколения и являются наиболее перспективными (Применение синтетичнеских антигенов для диагностики инфекционных болезней. Доклад Научной группы ВОЗ. Женева, 1991, с. 75), поскольку они обладают рядом преимуществ, а именно:
инфекционной безопасностью антигенного компонента как при производстве, так и при применении;
высокой диагностической специфичностью;
высокой стандартностью антигенного компонента в результате доступности структуры для контроля;
стабильностью неопределенно долгое время;
низкой себестоимостью.

В последние годы синтетические пептиды стали применять и для скринирующего определения антител к Т-лимфотропному вирусу человека I типа (HТLV-I) возбудителю Т-клеточного лейкоза/лимфомы взрослых и HТLV-I-ассоциированной миелопатии/тропического спастического парапареза. Так, в исследованиях, проведенных Палкером и соавт. показано, что синтетический пептид с аминокислотной последовательностью 120-130 матрикского белка р19 gag HTLV-I специфически связывается с анти-HTLV-I антителами у 16 из 18 (89% диагностической чувствительности (HTLC-I-инфицированных пациентов (Palker T.J. et al.//J. of Immunol, 1986. vol. 136, р 2393-2397). Лал и соавт. установили, что синтетический пептид с аминокислотной последовательностью 102-117 из этого же белка HTLV-I распознается сыворотками 79 из 87 (91%) HTLV-I-инфицированных пациентов (Lal R.B. et al.//J. of Virology, 1991, vol. 65, р.1870-1876). Для синтетического пептида с аминокислотной последовательностью 100-130, содержащего последовательности 120-130 и 102-117 двух вышеописанных синтетических пептидов белка р19 gag HTLV-I, описано выявление антител к HTLV-I в 94 из 94 (100% ) сывороток HTLV-I-инфицированных людей (Kuroda M. et al.//Int. J. Cancer, 1990, vol.45, р.865-868). Однако, в исследовании, проведенном с использованием другого набора сывороток, содержащих антитела к HTLV-I, установлена лишь 97% диагностическая чувствительность тест-системы ИФА с синтетическим пептидом, соответствующим аминокислотной последовательности 100-130 белка р19 gag HTLV-I (Rasulee A. et al.//Predictiom and recognition of antigenic determinants (A satellite meeting of the 8th Int. Congr. of Immunol. ). Budepest, 1992, р.12).

Для синтетических пептидов из других структурных белков HTLV-I в работах нескольких независимых групп исследователей также установлена диагностическая чувствительность, не достигающая 100% Так, пептиды, соответствующие аминокислотным фрагментам 190-209, 175-199 и 191-215 оболочного белка gp46 env HTLV-I выявляли соответственно 27 из 36 (78%) (Palker T.J. rt al.//J. of Immunol, 1989, vol.142, р. 971-978), 86 из 94 (91%) (Kuroda N. et al.//Int. J. Cancer. 1990, vol. 45, p.865-868) и 48 из 52 (92%) (Lal R.B. et al.//J. of Infect. Dis. 1991, vol.163, p.41-46) сывороток, содержащих антитела к HTLV-I.

Важно отметить, что по современным требованиям, для эффективного контроля за распространением HTLV-I-инфекции (осуществляемого, например, при переливании донорской крови) уровень диагностической чувствительности тест-систем должен стремиться к 100% и быть не менее 98% При невыполнении этого условия, возможны ситуации, когда к переливанию будет допущена HTLV-I-инфицированная кровь, что может вызвать передачу HTLV-I-инфекции. Использование же в иммунодиагностических тест-системах синтетических пептидов белков р19 gag и gp46 env HTLV-I по отдельности, как описано выше, не позволяет достигнуть 100% и обеспечивает лишь 92-97% диагностическую чувствительность.

Наиболее близким аналогом данного изобретения является способ диагностики антител к HTLV-I с индивидуальным использованием синтетического пептида 100-130 р19 gag HTLV-I (Kuroda N. ra al.//Int. J. Cancer. 1990, vol. 45, p. 865-868).

Целью изобретения является повышение эффективности способа. Технический результат выражается в повышении диагностической чувствительности иммунодиагностических тест-систем, предназначенных для определения антител к HTLV-I. Технический результат достигается тем, что в качестве антигенного компонента иммунодиагностических тест-систем, в едином антигенном комплексе совместно используют несколько синтетических пептидов, соответствующих разным антигенным детерминантам белков HTLV-I и обладающих иммунореактивностью с анти-HTLV-I антителами разной специфичности. Это позволяет в одном анализе определять в исследуемом образце биологической жидкости суммарное присутствие разноспецифичных антител, направленных против разных антигенных детерминант HTLV-I. Таким образом, происходит суммация диагностической чувствительности нескольких использованных синтетических пептидов, происходящая по типу взаимодополнения.

Отличительным от наиболее близкого аналога признаком является совместное использование нескольких синтетических пептидов HTLV-I, а не индивидуальное использование одного синтетического пептида HTLV-I.

Предпочтительным является совместное использование в скринирующих иммунодиагностических тест-системах (ИФА, РИА, ИФ, РПА и др.) для определения антител к HTLV-I синтетических пептидов, соответствующих аминокислотной последователь- ности нескольких белков HTLV-I, в диапазоне концентраций от 0,001 мкг/мл до 1000 мкг/мл.

Более предпочтительным является совместное использование в скринирующей иммунодиагностической тест-системе ИФА для определения антител к HTLV-I синтетических пептидов, соответствующих аминокислотной последовательности оболо- чечного gp46 env и матриксного белков р19 gag HTLV-I, в диапазоне концентраций от 0,1 мкг/мл до 100 мкг/мл.

П р и м е р 1. При конструировании диагностической иммуноферментной тест-системы, предназначенной для скринирующего исследования сывороток крови на наличие антител к HTLV-I, применяют
А) совместное использование двух синтетических пептидов, соответствующих аминокислотной последовательности белков р19 gag и gp46 env HTLV-I (формулы пептидов приведены в табл.1) и
В) индивидуальное использование синтетического пептида, соответствующего аминокислотной последовательности белка P19 gag HTLV-I.

Пептиды синтезируют твердофазным методом по стандартной методике (Andreev S.M. et al.//Biomed. Sci. 1991, vol.2. p.271-278). Получение антигенного компонента тест-системы осуществляют (в случае А посредством совместной иммобилизации обоих синтетических пептидов в одной лунке иммуноферментного планшета, в случае Б индивидуальной иммобилизацией синтетического пептида) по следующей схеме.

Готовят отдельные растворы пептидов (I) и (II) в концентрациях 16 и 4 мкг/мл соответственно в 0,01 М карбонатном буфере (рН 9,6). Полученные растворы пептидов смешивают в объемном соотношении 1:1 (в случае А). Приготовленную смесь растворов пептидов (в случае А) или раствор одного пептида в концентрации 8 мкг/мл (в случае Б) вносят по 100 мкл в лунки 96-лучного полистиролового планшета "Greiner" (Германия) на 12-16 ч при +4^оС. По истечении указанного времени сорбции пептидов, лунки планшета четырехкратно отмывают 0,01 М фосфатносолевым буфером, содержащим 0,05% Твина-20 (ФСБ-Т).

Свободный сайты твердой фазы забивают путем сорбции 3% раствора бычьего сывороточного альбумина (БСА) в ФСБ-Т по 100 мкл в лунку при +37^оС в течение 1 ч, после чего лунки двукратно отмывают раствором ФСБ-Т.

Анализ исследуемых образцов сывороток крови человека проводят по следующей методике.

Сыворотки в разведении 1:20 и ФСБ-Т, содержащем 0,5% БСА, вносят по 100 мкл в лунку планшета с сорбированными пептидами и инкубируют при +37^оС 0,5 ч, после чего лунки четырехкратно отмывают раствором ФСБ-Т.

В лунки вносят по 100 мкл протеина А St. aureus в рабочем разведении в ФСБ-Т, содержащем 0,5% БСА, и инкубируют 0,5 ч при +37^оС, после чего лунки четырехкратно отмывают ФСБ-Т.

В лунки вносят по 100 мкл хромогенного энзим-субстрата, содержащего 0,032% ОФД в 0,1 М цитратно-фосфатном буфере рН 5,0) и 0,01% H₂O₂, и инкубируют 10 мин в темноте при комнатной температуре. Ферментативную реакцию останавливают добавлением в каждую лунку по 50 мкл 3 М раствора H₂SO₄.

Величину экстинкции определяют с помощью фотометра при длине волны 492 нм.

Интерпретацию результатов осуществляют следующим образом.

Вычисляют величину контрольного уровня (КУ) по формуле КУ М х 2, (где М среднее значение экстинкции, полученное при испытании контрольных сывороток, не содержащих антитела к вирусу HTLV-I). Результат испытания считают положительным, если уровень экстинкции, полученный для испытуемого образца, находится в пределах +/- 5% КУ (результат "+/-") или более, чем на 5% превышает КУ (результат "+", "++", "+++"). Результат испытания считают отрицательным, если уровень экстинкции, полученный для испытуемого образца, более, чем на 5% ниже КУ (результат "-").

Результаты испытания контрольных сывороток, содержащих и не содержащих антитела к HTLV-I, представлены в табл.2.

Результаты свидетельствуют, что сочетанное использование синтетических пептидов, соответствующих аминокислотным последовательностям структурных белков р19 gag и gp46 env HTLV-I, путем их совместной иммобилизации в одной лунке планшета, приводит к повышению диагностической чувствительности тест-системы (100%) по сравнению с индивидуальной иммобилизацией синтетического пептида белка р19 gag HTLV-I (97%), что позволяет идентифицировать наличие или отсутствие антител к HTLV-I для каждой из контрольных сывороток.

П р и м е р 2. Опыт проводят аналогично примеру 1. Отличие заключается в том, что в случае Б применяют индивидуальное использование синтетического пептида (в концентрации 2 мкг/мл), соответствующего аминокислотной последовательности белка gp46 еnv HTLV-I. Результаты опыта представлены в табл.3. Результаты показывают, что индивидуальное применение синтетического пептида из белка gp46 env HTLV-I позволяет выявить антитела к HTLV-I только в 89% сывороток, содержащих антитела к HTLC-I. При этом, совместное применение двух пептидов из белков р19 gag и 46 env HTLV-I приводит к 100% диагностической чувствительности тест-системы при выявлении антител к HTLV-I.

Таким образом, предлагаемый способ определения антител к HTLV-I позволяет повысить диагностическую чувствительность иммунодиагностической тест-системы за счет суммации антигенных свойств нескольких использованных синтетических пептидов, происходящей по типу взаимодополнения. Предлагаемый способ позволяет в одном анализе определить суммарное присутствие антител к разным антигенным детерминантам HTLV-I, что упрощает и удешевляет проведение анализа.

Использование: медицина, иммунная биотехнология и лабораторная диагностика, способ для определения антител к Т-лимфотропному вирусу человека 1 типа HTLV-1. Цель: повышение эффективности способа. Сущность: при определении антител к HTLV-1 в качестве антигенного компонента, иммунодиагностической тест-системы в едином антигенном комплексе используют совместно несколько синтетических пептидов, соответствующих разным антигенным детерминантам белков HTLV-1 и обладающих иммунореактивность с анти-HTLV-1 антителами разной специфичности. Это позволяет в одном анализе определять в исследуемом образце биологической жидкости суммарное присутствие разноспецифичных антител, направленных против разных антигенных детерминант HTLV-1. Последнее повышает диагностическую чувствительность способа. 3 з. п. ф-лы, 3 табл.

1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К Т-ЛИМФОТРОПНОМУ ВИРУСУ ЧЕЛОВЕКА I ТИПА (HTLV-1), включающий контактирование исследуемого образца биологической жидкости с антигеном HTLV-1 с последующей регистрацией результатов иммунологической реакции, отличающийся тем, что исследуемый образец контактируют с антигенным комплексом, образованным несколькими антигенами, представляющими собой синтетические пептиды, соответствующие разным антигенным детерминантам белков HTLV-1 и обладающие иммунореактивностью с анти-HTLV-1 антителами разной специфичности. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что антигенный комплекс образуют из двух синтетических пептидов, соответствующих антигенным детерминантам структурных белков p19 gag HTLV-1 и gp 46 env HTLV-1. 3. Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что синтетические пептиды используют в диапазоне концентраций при иммобилизации от 0,1 до 100 мкг/мл. 4. Способ по пп. 1 3, отличающийся тем, что антигенный комплекс из синтетических пептидов иммобилизуют в лунках планшетов для иммуноферментного анализа.