Изобретение относится к области биотехнологии, генной инженерии, иммунологии и может быть использовано для проведения серодиагностики HTLV-I.
Вирус Т-клеточного лейкоза человека I типа (human T-cell leukemia virus type I, HTLV-I) относится к семейству Retroviridae, подсемейство Oncovirinae, группа (HTLV-BLV).
HTLV-I является типичным Т-лимфотропным ретровирусом I типа со специфической аффинностью к CD4+ лимфоцитам (хелперы). Вирус вызывает неопластическую трансформацию этой субпопуляции клеток.
Установлено, что вирус этиологически ассоциирован с HTLV-I зависимыми Т-клеточными лейкозами/лимфомами взрослых (ATLL) (Yokota T. et al., 1989; Srivastava В. I. et al., 1990). Кроме того, делетированный HTLV-I провирус был найден при некоторых клинических проявлениях кожных Т-клеточных лимфом, при микозных поражениях, синдроме Сезари и, возможно, играет непрямую роль в этиологии различных В-клеточных лимфом.
HTLV-I также ассоциирован с рядом воспалительных заболеваний, не связанных с возникновением новообразований и подразделяющихся на состояния, характеризующиеся лимфоцитарными инфильтратами и ослаблением функций иммунитета. Сюда относятся HTLV-I - ассоциированная миелопатия/тропический спастический парапарез (HAM/TSP). Это острое заболевание, переходящее в хроническую стадию с высокой летальностью. Другими воспалительными состояниями, ассоциированными с HTLV-I инфекцией, по-видимому, являются альвеолит, полимиозит, увеит, артрит.
Т-клеточный лимфотропный вирус человека 1 типа является эндемиком на Юго-Востоке Японии, Восточной Африке, Центральной Африке, Меланезии и состоит из субтипов М (Melanesian), CA (Central African) и C (Cosmopolitan); последний делится на субтипы A, B, C. Высокий уровень инфицированности вирусом показан для некоторых изолированных популяций, таких как индейцы Южной Америки, Австрало-Меланизийские аборигены, религиозные сегрегации евреев в Иране и пигмеи Центральной Африки. (Vidal A.U. et. al., 1994; Miura T. et al., 1994; Switzer W.M et. al., 1995).
На данной стадии развития ретровирусологии важным этапом при исследовании распределения HTLV-l на территории России и сопредельных с ним государств является типирование вирусных изолятов. Для более корректного обследования сывороток людей, проживающих на территории России на содержание антител к HTLV-I, антигены для подложки иммуноферментных систем необходимо производить при использовании плазмид, полученных на основе отечественных изолятов. В данном изобретении используется полипептид, полученный при помощи плазмиды, содержащей область env HTLV-I. Вирусный материал для получения плазмиды был выделен от инфицированного донора на территории России.
Область env HTLV-I локализуется в районе 5202-6668 пар нуклеотидов (п.н. ) генома и кодирует основной гликопротеид оболочки вируса HTLV-I. Продукт гена env - предшественник белков оболочки вируса с молекулярной массой 61 кДа обнаруживается только в инфицированных клетках. Этот предшественник процессируется клеточными ферментами на два функциональных домена: наружная гликопротеиновая часть (gp46) и трансмембранная часть (р21).
Сущность данного технического решения состоит в том, что предложен новый, оригинальный, искусственно созданный полипептид, состоящий из продукта экспрессии фрагмента гена env HTLV-I, слитый с бета-галактозидазой E.coli, связывающий антитела, к продукту гена env HTLV-I, фрагмент ДНК ATLE 495, штамм E. coli HB101, трансформированный рекомбинантной плазмидой pATLE 495, содержащей фрагмент ДНК ATLE 495.
Штамм-продуцент характеризуется следующими признаками:
клетки прямые, палочковидной формы, подвижные с перитрихиальными жгутиками, грамотрицательные, неспороносные. Клетки хорошо растут на среде LB и других питательных средах, используемых для культивирования Escherichia coli, и простых питательных средах, содержащих 30-50 мкг/мл ампициллина. При росте на жидких средах клетки образуют ровную интенсивную муть.
При выращивании на питательных агаризованных средах при 37oC колонии клеток гладкие, круглые, блестящие, серые, мутные, прижатые, края ровные. Клетки хорошо растут в пределах от 4 до 45oC при оптимуме pH от 6,8 до 7,5. В качестве источника азота клетки используют как минеральные соли в аммонийной и нитратной форме, так и органические формы в виде пептона и аминокислот. Нитраты восстанавливают до нитритов. В качестве источника углерода, используют глюкозу и фруктозу. Желатину не разжижают, мальтозу не сбраживают, индол не образуют, ацетат не усваивают; уреазная активность не обнаружена.
Трансформация компетентных клеток E.coli HB101 плазмидой с промотром LacZ оперона проведена по стандартным методикам. Полученные клоны клеток с плазмидами выращивают на среде LB при температуре 37oC. Продуктивность штамма при использовании плазмидного вектора экспрессии pUR291 с lac-промотором составляет около 200-350 мкг рекомбинантного белка на 1 мл клеточной суспензии при плотности культуры 1х10 млн.кл в мл. Рекомбинантный белок с молекулярной массой 133 килодальтона стабилен при температуре 4oC в течение 5-6 месяцев.
Выделенный и очищенный из штамма-продуцента полипептид Е 495, иммобилизованный на твердом носителе, связывает антитела к продуктам гена env HTLV-I в сыворотках крови и других биологических жидкостях. Штамм депонирован в музее НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН.
Пример 1. Получение фрагмента ДНК ATLE 495.
В качестве источника HTLV-I-env-специфических нуклеотидных последовательностей использовали мононуклеарные клетки, полученные от HTLV-I-инфицированного донора. Мононуклеары выделяли из гепаринизированной крови донора с помощью центрифугирования в градиента фиколл/гипак. 10 мкл клеток ресуспендировали в 100 мкл лизирующего буфера, содержащего 10 мМ трис-HCl, pH 8,3; 1,0 мM EDTA: 0,5% NP-40; 0,5% Tween-20 и протеиназу К в концентрации 200 мкг/мл. Лизис клеток осуществляли в течение двух часов при 56oC. Затем лизат инкубировали 10 мин при 85oC для инактивации протеиназы.
Фрагмент ДНК (использована нуклеотидная последовательность, опубликованная Seiki M. et al., 1983), соответствующий области гена env HTLV-I и кодирующей гликопротеин gp46 с координатами 5694 - 6120 п.н. был амплифицирован в цепной полимеразной реакции (PCR, ) с использованием полимеразы BIOTAQ (Биомастер ЛТД, Россия) и двух пар праймеров:
для первого раунда:
5"-TTATTCTTCCCAGTTCTGCC-3'(5229-5246)
5'-GCTTGGTTTACAGGGATGAC-3'(6656-6675) (публикация J.of Virology, V.64, N. 3, p. 1278-1282, 1990),
и для второго раунда, содержащие сайты рестрикции SalGI:
5'-CTAGTCGACGCTCCAGGATATGAC-3'
5'-GGAGTCGACTAGGGTGGGAACAGGTGA-3'
Олигонуклеотиды получены на синтезаторе "Applied Biosystems 381A DNA" фосфорамидатным методом и очищены с применением картриджа (Applied Biosystems Inc.).
Все реакции при постановке PCR проведены в объеме 100 мкл, содержащим по 50 pmol каждого праймера, 50 mМ Трис-HCl (pH 8,8), 10 mM MgC14, 10 mМ (NH4)2SO4, 10 мкл лизата, содержащего вирус-специфическую ДНК, 2,5 U ДНК-полимеразы из Thermus aquaticus (BIOTAQ, Биомастер ЛТД, Россия), 2,5 mM каждого из нуклеотидтрифосфатов и 50 мкл минерального масла (Sigma, USA). Реакция проведена в 30 циклов по следующей схеме:
94oC - 1 мин; 60oC - 1 мин; 72oC - 2 мин.
Затем 5 мкл реакционной смеси переносили в пробирку, содержащую внутреннюю пару праймеров, и реакцию продолжали еще в течение 30 циклов.
Анализ PCR-продукта.
Порции по 4 мкл от каждого продукта PCR-реакции смешивали с 4 мкл буфера образца, наносили на 1,5% агарозный гель на трис-ацетатном буфере pH 8,0 и проводили электрофорез. Необходимый фрагмент вырезали под мягким ультрафиолетом, а выделение ДНК из брусочков агарозного геля осуществляли с применением набора Gene Clean, как описано в прилагаемой инструкции.
Пример 2. Конструирование плазмиды pATLE 495.
Рекомбинантная плазмида pATLE 495 получена путем лигирования с использованием ДНК-лигазы фага Т4 фирмы "Boehringer mannheim" (ФРГ) ДНК амплифицированного фрагмента (размером 426 п.н.), выделенного из агарозного геля и гидролизированного ферментом SalGI фирмы "Boehringer mannheim" в присутствии буфера для этого фермента с линеаризированной (гидролизом SalGI) формой ДНК плазмидного вектора pUR291. После соответствующей инкубации трансформировали полученным препаратом компетентные (обработанные CaCl2) клетки Е.coil НВ101. Отбор трансформированных клеток осуществляли по способности трансформантов расти на среде, содержащей ампициллин. Были отобраны клоны, содержащие плазмиду размером 5,4 тыс. п.н. Плазмиду со вставкой в прямой ориентации, относительно бета-галактозидазы, отбирали по ее способности синтезировать рекомбинантный полипептид величиной 133 кДа. Полученная плазмида, в которой ориентация гена env HTLV-I совпадала с рамкой считывания гена бета-галактозидазы была обозначена pATLE 495. Рекомбинантный белок получали в виде телец включения.
Все манипуляции проводили с использованием стандартных биотехнологических методик, опубликованных в сборнике (Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. , Москва 1984).
Ниже приведена нуклеотидная последовательность плазмиды pATLE 495 и аминокислотная последовательность гибридного белка, синтезируемого под контролем данной плазмиды.
Бета-галактозидаза: начало полилинкера pUR291
последовательность gp46 HTLV-I (фрагмент ATLE 495)
конец полилинкера pUR291
Vai Asp Leu Gln Pro Ser Leu Ser Met
...GTC GAC CTG CAG CCA AGC TTA TCG ATG
Пример 3. Анализ уровня синтеза гибридного белка E 495, обладающего антигенными свойствами HTLV-I.
Анализ белков в лизатах клеток E. coli HB101, содержащих гибридную плазмиду pATLE 495, проводили методом электрофореза в полиакриламидном геле 6% концентрации (Laemmli U.K., 1970). В лизатах бактерий, содержащих плазмиду pATLE 495, обнаружен дополнительный белок, с молекулярной массой 133 кДа. Антигенную активность белка с молекулярной массой 133 кДа анализировали с помощью метода иммуноблота, используя гели 12% концентрации. Полученный гибридный белок обладал антигенной активностью HTLV-I. Уровень синтеза гибридного белка составляет не менее 20% от тотального клеточного белка, что позволяет получать с 1 л клеточной суспензии 200-350 мг белка, обладающего антигенными свойствами HTLV-I.
Полный аминокислотный профиль гибридного белка, состоящего из 495 аминокислот, представлен в следующем ассортименте: 340 а.к. бета-галактозидазы (полная последовательность бета-галактозидазы); 3 а.к., кодируемые начальным фрагментом полилинкерной последовательности векторной плазмиды pUR291; 142 а. к. , кодируемые амплифицированным участком гена env HTLV-I, а именно, иммуногенный фрагмент белка gp46; - 10 а.к., кодируемые заключительным фрагментом полилинкера pUR291 (терминатор), что представлено в примере 2.
Пример 4. Демонстрация возможности использования целевого продукта для создания диагностикума на HTLV-I.
Препараты белков, приготовленные по методике, изложенной в примере 3, разделяли методом электрофореза в ПААГе и анализировали методом иммуноблота и использованием ряда сывороток пациентов, инфицированных HTLV-I. В препарате белков, полученных из клеток, содержащих гибридную плазмиду pATLE 495, обнаружена дополнительная полоса, специфически реагирующая с антителами к HTLV-I. В препарате, использовавшемся в качестве контроля, приготовленном из клеток, содержащих исходный вектор pUR291, такая полоса не идентифицирована.
Таким образом, плазмида pATLE 495 детерминирует в клетках E.coli синтез белков, обладающих антигенными свойствами белков HTLV-I. Следовательно, созданную плазмиду и штамм-продуцент гибридного белка возможно использовать для создания тест-систем на выявление антител к HTLV-I.
Список цитируемой литературы:
1. Маниатис Т. , Фрич Э. и Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. Пер.англ. - М. 1984. 2. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins duing the assembly of the head of baoteriophage T4. //Nature. - 1970, - Vol. 227. N. 5259, - P. 680-685.
3. Miura Т., Fukunaga Т., Igarashi Т. et al. //Phylogenetic subtypes of human T-lymphotropic virus type I and their relations to the anthropological background.//PNAS USA. - 1994. - Vol., 91. - P. 1124-1127.
4. Seiki M., Hattori S., Hirayama Y. and Yoshida М. Human adalt. T-cell leukermia virus: compiete nucleotide sequence of the provirus genome integrated in leukemia cell DNA.// Proc. Natl. Acad.Sci. - 1983. - Vol. 80, - P. 3618-3622.
5. Srivastava B.I., Gobzales C., Loffus R., Fitzpatrick J.E. and Saxibger C. W. Examination of HTLV-I ELISA-positive leukemia/lymphoma patiens by western blotting gave mostly negative or indeterminate reaction.// 1990, - Vol. 6, N. 5, - P. 617-627.
6. Switzer W. M., Pieniazek D., Swanson P. et al. Philogenetic relationship and geographic distribution of multiple human T-cell lymphotropic virus type II subtypes.//J.of Viroiogy. - 1995. - Vol. 69, - N 2, - P. 621-632.
7. Vidal A.U., Gessain A., Yoshida M. et al. Molecular epidemiology of HTLV type I in Japan: Evidence for two distinct ancestral lineages with a particular geographical distribution.//AIDS Research and human retroviruses. - 1994. - Vol. 10. - N 11. - P. 1557-151556.
8. Yokota Т., Min-JiCho, Tachibana N. The prevalence of antibody to p42 of HTLV-I amang ATLL patients in comparison with healthy carriers in Japan. //Int. J. Cancer. - 1989, - Vol.43, - P. 970-974.
Изобретение предполагает получение нового оригинального искусственно созданного полипептида, состоящего из продукта экспрессии фрагмента гена env HTLV-I, слитого с бета-галактозидазой Е.соli и связывающего антитела к продукту гена env HTLI-I, фрагмента ДНК ATLE 495, штамма E.coli НВ101, трансформированного рекомбинантной плазмидой pATLE 495, содержащей фрагмент ДНК ATLE 495. Изобретение позволяет получать с 1 л суспензии клеток E.coli 200-350 мг гибридного белка, содержащего специфическую последовательность полипептида, кодируемого областью env генома HTLV-I, и может быть использовано для проведения серодиагностики HTLI-I. 3 с.п. ф-лы.
2. Рекомбинатная плазмидная ДНК рАТLE 495 размером 5, 6 т.п.н., содержащая SalGI-Bam HI фрагмент вектора pUR 291 и кодирующая полипептид Е 495 с мол. м. 133 кДа, предназначенный для определения антител к вирусам Т-клеточного лейкоза человека 1 типа, состоящий из бета-галактозидазы, двух аминокислотных остатков Arg, Gly, Ser и Val, кодируемых полилинкерной областью, и вирусспецифической части, кодируемой геном env, содержащим фрагмент по п. 1.
| RU 93058018, 27.10.1996. |
