СПОСОБ ИЗМЕРЕНИЯ УЗКОПОЛОСНЫХ СПЕКТРОВ ВОЗБУЖДЕНИЯ И ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ Российский патент 1996 года по МПК G01N21/64 

Изобретение относится к технологии измерения узкополосных спектров флуоресценции и возбуждения биообъектов, в частности биотканей, и может быть использовано при диагностике патологий в биотканях.

Известен способ измерения узкополосных спектров поглощения и флуоресценции молекул, находящихся в кристаллических матрицах при низких температурах, называемый методом Шпольского (Шпольский Е.В. Ильина А.А. Климова Л. А. Доклады АН СССР, 17,235, 1952).

Недостатками этого метода являются кристаллическая анизотропная структура среды, в которую внедряются исследуемые молекулы, а также неоднородное уширение линий в спектре.

Известен способ измерения резонансных ремановских спектров веществ (Spiro Т. G. Streakas Т.С. Resonance Raman Spectra of Heme Proteins. Еffect of Oxidation and Spin State. Journal of the American Chemical Society, vol. 96. 1974, р. 338-345.

Недостатками этого способа являются, как правило, нагромождение большого количества линий в спектрах и сложность анализа измеренных спектров. Однако этот способ имеет преимущества по сравнению с другими способами, например он применим также к непрозрачным и к нефлуоресцирующим веществам.

Известен способ измерения инфракрасных спектров поглощения веществ (Ogoshi H. Saito Y. Nakamoto K. Infrared Spectra and Normal Coordinate Analisis of metalloporphins. J. Сhem. Phys. 57, 1972, р. 4194 4202).

Недостатком этого способа является его применимость только к прозрачным веществам, т.е. как правило, к растворам чистых веществ.

Наиболее близким к заявляемому по технической сущности и достигаемому результату является способ измерения узкополосных спектров возбуждения и флуоресценции молекул в аморфных матрицах при селективном лазерном возбуждении (Романовский Ю.В. Рыковская Л.А. Персонов Р.И. Тонкоструктурная люминесценция этио-, копро- и мезопорфирина при селективном лазерном возбуждении. Биофизика, т. 26, вып. 4, 1981, с. 624-627). Этот способ, а также все описанные выше способы подробно рассмотрены в кн. Соловьев К.Н. Гладков Л.Л. Старухин А. С. Шкирман С.Ф. Спектроскопия порфиринов: колебательные состояния. Минск; Наука и техника, 1985). Сущность этого способа состоит в том, что вещество, растворенное в органическом растворителе, замораживают до температуры жидкого гелия 4,2 К, а возбуждение лазерным лучом осуществляется в область 0-0 полосы поглощения или в область первого вибронного повторения 0-0 полосы в спектре поглощения этого раствора. Энергетическая схема селективного лазерного возбуждения флуоресценции вещества изображена на фиг.1. Если возбуждение флуоресценции образца лазерным лучом осуществляется в область 0-0 полосы поглощения вещества (лазер 1, фиг.1), то получается очень качественный узкополосный спектр флуоресценции. Узкие полосы спектра характеризуют частоты нормальных колебаний молекулы вещества в основном электронном состоянии. При возбуждении в область первого вибронного повторения 0-0 перехода (лазер 2, фиг.1) в спектре флуоресценции, как правило, преобладает одна узкая линия, поэтому в данном случае удобнее рассматривать спектр возбуждения вещества. Узкие линии в спектре возбуждения характеризуют частоты нормальных колебаний молекулы вещества в возбужденном электронном состоянии.

Недостатком прототипа является его применимость к искусственно синтезированным веществам (модельным системам) либо к веществам, экстрагированным из биотканей (системам in vitro). Таким образом, биомолекулы исследуются обособлено от их естественных сред, значит, этот метод пригоден для исследования физических свойств только чистых веществ.

Технической задачей изобретения является исследование биологических молекул в их естественных средах, т.е. в биотканях, способом, близким к прототипу. Этот способ позволит исследовать не только молекулы, но и среды, в которых они находятся, т.е. биоткани, так как частоты нормальных колебаний молекул зависит от сред, в которых они находятся.

Поставленная задача достигается путем применения специального теплообменника для замораживания образцов биотканей. Сущность изобретения заключается в том, что применение теплообменника позволяет заморозить образец биоткани до температуры жидкого гелия 4,2 К. Охлаждение биотканей происходит более сложным образом, чем охлаждение растворов молекул. Дело в том, что в биотканях существует так называемая "связная вода" вода, которая не кристаллизуется даже при низких температурах. Например, в 1 г мышцы лягушки не вымораживается 0,2 г воды даже при охлаждении до температуры -130^оС (Франк Г. М. Биофизика мышечного сокращения. М. Наука, 1966, с. 228). Можно предположить, что применение теплообменника позволяет заморозить и кристаллизовать большее количество воды в образце биоткани, вследствие чего становится возможным селективное лазерное возбуждение флуоресценции образца. Без применения теплообменника получить узкополосные спектры не удается.

При охлаждении образца поток теплоты от образца к среде описывается формулой (Яворский Б.М. Детляф А.А.) Справочник по физике, М. 1977)
Q_о α_oS_o (Т₁ Т_o), (1) где Т_о температура среды; Т₁ температура образца; S_o площадь поверхности образца; α_o коэффициент теплопередачи на границе образца со средой. Для увеличения потока тепла, очевидно, можно увеличить величины S_о и α_о. Для увеличения S_o можно поместить образец в металлический, предпочтительно в медный или латунный, теплообменник, а для увеличения α_o можно сделать образец биоткани как можно более плоским. Форма теплообменника может быть произвольной, но для примера выберем теплообменник в форме двух металлических пластин площади S₁ и толщины d, между которыми зажимается срез биоткани площадью S_o (S₁ > >S_o), тогда поток тепла от образца к среде описывается формулой
Q₁= α_oS₁(T₃-T_o) K α₁S_o(T₂-T₁)
(2) где Т₃ температура теплообменника на границе теплообменника со средой; Т₂ температура теплообменника на границе теплообменника с образцом; К коэффициент теплопроводности металла; α_о коэффициент теплопередачи на границе металл среда полагаем равным α_o образец среда в выражении (1); α₁ коэффициент теплопередачи на границе образец металл. Тогда, исключая арифметическим путем величины Т₂ и Т₃ из уравнения (2), получим формулу для потока тепла от образца к среде с применением теплообменника:
Q₁= (3)
Если образец достаточно плотно прижат к металлической поверхности теплообменника, то на границе металл образец нет скачка температур Т₁ Т₂, кроме того, в знаменателе формулы (3) d/K<< 1/α_oS₁ (К≈100-400 Вт/м ·град.α _o ≈10 Вт/м² ·град. d≈10^-3 10^-2 м, S₁≈10^-3 10^-2 м). Тогда формула (3) преобразуется в вид
Q₁ α_o · S₁ (Т₁ Т_о) (4)
Таким образом, сравнивая формулы (4) и (1), получаем, что применение теплообменника позволяет увеличить поток теплоты:
Q₁/Q_o S₁/S_o. (5)
Рассматривая динамику замораживания образца, необходимо учитывать не только граничные условия (4), но и условия распространения тепла внутри образца. Считая задачу одномерной, уравнение теплопроводности внутри образца можно представить в виде
(6) где K₁, ρ и С коэффициент теплопроводности, плотность и удельная теплоемкость образца соответственно.

Решение уравнения (6) с граничными условиями (4) сложно, поэтому ограничимся рассмотрением упрощенных случаев.

Если K₁/d₁ >> α_o S₁, тогда (d₁ толщина среза образца) температуру во всех точках образца можно считать одинаковой в любой момент времени, и динамика охлаждения образца описывается уравнением
α₁S_oТdt -cmdТ; Т Т₁ Т_о, (7) где m масса образца. Тогда решение уравнения (7) представится в виде
T T_o+T₁-Texp- ; τ где Т₁ начальная температура образца; Т_о температура среды. В этом случае скорость охлаждения образца зависит главным образом от произведения α₁ · S_o.
Если K₁/d₁ << α_oS₁, тогда температура образца у границы образец металл быстро достигает температуры среды. В этом случае начальное распределение температуры внутри образца можно считать гауссовым:
TX,O T_o+T₁-Texp-
Тогда решение уравнения (6) представится в следующем виде:
TX,t T_o+T₁-T exp-
где а коэффициент температу- ропроводности образца, а охлаждение внутреннего слоя образца (х 0) описывается формулой
TO, t T_o+T₁-T которая при достаточно больших временах t >> принимает вид
TO, t T_o+T₁-T из которой следует, что охлаждение внутренних слоев образца обратно пропорционально
На основании рассмотренных выше случаев не имеет смысла численно вычислять время охлаждения образца, так как параметры уравнений могут сильно зависеть как от абсолютной температуры, так и от разности температур образца и среды (Фрост У. Теплопередача при низких температурах. М. Мир, 1977), поэтому ошибка в численной оценке времени может быть непредсказуемой. Однако на основании полученных результатов можно сделать полезные выводы об оптимальных размерах и конфигурации образца и теплообменника. Например, масса и толщина образца должны быть насколько это возможно минимальными, а площадь поверхности теплообменника должна быть достаточно большой.

Таким образом, указанное отличие, а именно способ установки образца при наличии теплообменника, приводит к замораживанию образца в гелиевом криостате до температуры, достаточной для селективного лазерного возбуждения образца и получения узкополосных спектров. Причем без использования теплообменника и при недостаточно тонких образцах возбудить селективно образец не удается. Поэтому указанное отличие является существенным.

П р и м е р 1. Измерение узкополосных спектров флуоресценции порфиринов в мышечной ткани белой крысы. На фиг. 2, 3 и 4 представлены спектры флуоресценции мышечных тканей трех разных крыс при температуре 4,2 К, замороженных описанным выше способом. Пунктирными линиями показаны спектры флуоресценции тканей при неселективном возбуждении фиолетовой линией лазера. В области 625-635 нм неселективных спектров видны побочные максимумы, которые обусловлены 0-0 полосой флуоресценции порфиринов. Сплошными линиями показаны спектры флуоресценции тканей при возбуждении лазерным лучом в область 575-590 нм, т.е. в область вибронного повторения 0-0 полосы поглощения. Узкая линия флуоресценции в области 625-635 нм спектра получается вследствие селективного возбуждения группы молекул порфиринов в ткани. Вычисляя разность частот возбуждения и вершины узкой линии флуоресценции, можно получить одну из частот нормальных колебаний молекулы порфиринов. На фиг.5 показано изменение формы узкой линии флуоресценции спектра при разных частотах возбуждения. Спектры сдвинуты таким образом, чтобы частоты возбуждения оставались на одной вертикальной линии. Видно, что при изменении частоты возбуждения вершина узкой линии флуоресценции следует за частотой возбуждения, затем появляется вторая вершина узкой линии. При дальнейшем изменении частоты возбуждения обе вершины следуют за частотой возбуждения, но первая вершина постепенно уменьшается, а вторая растет. Таким образом, изменяя частоту возбуждения, удается вычислить наиболее интенсивные частоты нормальных колебаний молекул порфиринов.

П р и м е р 2. Измерение узкополосных спектров возбуждения порфиринов в мышечной ткани белой крысы. На фиг.6 изображен узкополосный спектр возбуждения образца мышечной ткани крысы при температуре 4,2 К. В данном случае регистрация флуоресценции производится на частоте 15850 см^-1, а длина волны возбуждения плавно сканируется от 565 до 615 нм. Узкие линии в спектре характеризуют частоты нормальных колебаний молекул порфиринов. Частоты нормальных колебаний вычисляются как разность частот возбуждения и регистрации. В данном случае спектр возбуждения более информативен, чем спектр флуоресценции, так как возбуждение производится в область вибронного повторения 0-0 полосы поглощения. Спектр возбуждения измерен без поправки на мощность лазерного излучения, так как в данном случае в этом нет необходимости.

Описанный способ отличен от прототипа главным образом его предназначением. Если способ-прототип используется, как правило, с целью исследования биологических и других молекул, то описанный здесь способ предназначен для исследования натуральных сред, в которых содержатся биомолекулы, т.е. биотканей. Поэтому этот метод может стать новым методом диагностики биотканей. Дальнейшие исследования покажут возможность и практическую целесообразность применения этого метода в биологии и медицине.

Использование: в аналитической химии. Сущность изобретения: способ измерения узкополосных спектров возбуждения и флуоресценции биологических объектов сходен со способами селективного лазерного возбуждения флуоресценции тем, что образец замораживают до температуры 4,2 К. Возбуждают в нем флуоресценцию лазерным лучом с длиной волны, близкой к 0 - 0 переходу исследуемого вещества. Перед охлаждением плоский образец биоткани толщиной не более 1 мм зажимают между металлическими пластинами с силой, достаточной для уменьшения толщины образца не менее чем на 20%. Суммарная площадь поверхности металлических пластин должна быть как минимум в 10 раз больше площади образца биоткани. В одной из пластин предварительно изготовлено отверстие диаметром 3 - 5 мм для возбуждения флуоресценции образца лазерным лучом и снятия спектров. 6 ил.

СПОСОБ ИЗМЕРЕНИЯ УЗКОПОЛОСНЫХ СПЕКТРОВ ВОЗБУЖДЕНИЯ И ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ, включающий охлаждение образца до 4,2 К, облучение возбуждающим лазерным излучением с длиной волны из области 0 - 0 полосы спектра поглощения образца или из области первого вибронного повторения 0 - 0 полосы в спектре поглощения образца, регистрацию и измерение узкополосных спектров возбуждения и флуоресценции образца, отличающийся тем, что перед охлаждением плоский образец биоткани толщиной не более 1 мм зажимают между металлическими пластинами с силой, достаточной для уменьшения толщины образца не менее чем на 20%, при этом суммарная площадь пластин превышает минимум в 10 раз площадь образца биоткани, а в одной из пластин предварительно выполняют отверстие диаметром 3 - 5 мм, через которое проводят облучение и регистрацию спектров образца.