Штамм бактерий КLевSIеLLа рNеUмоNIае-продуцент рестриктазы Кр @ 378 1 Советский патент 1991 года по МПК C12N9/14 C12N1/20 

сл С

Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии. Целью изобретения является выявление штамма Klebslella pneumoniae ВКПМ В-4894 (378), нетребовательного к питательным средам, обеспечивающего более высокий выход рестриктазы, способный узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов CCGCGG. Штамм получен в результате поиска продуцентов рестриктаз, выделен из воздуха, растет на простой дешевой питательной среде отечественного производства, обеспечивает повышенный выход рестриктазы при более простом экономичном способе выделения фермента по сравнению с известным. Из 1 г влажной биомассы выделяют40000 ед акт. фермента с активностью 30000 ед акт/мл

Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии, в частности к получению рестриктазы, способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов CCGCGG.

Целью изобретения является выявление штамма Klebsiella pneumoniae ВКПМ В- 4894 (378), нетребовательного к питательным средам, обеспечивающего более высокий выход рестриктазы, способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов CCGCGG.,

Штамм Klebslella pneumoniae 378 выделен из воздуха в результате поиска штаммов - продуцентов рестриктаз.

Штамм Klebsiella pneumoniae 378 характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки Клетки в виде укороченных палочек часто овальной формы, неподвижные споры не образуют грамотрицательные, как правило имеют капсулу, длина и толщина клеток колеблются от 0,5 до 7 мкм и от 0,3 до 1,5 мкм соот- ветственно, располагаются клетки единично, парами, редко цепочками

Культурадьные признаки. На плотных питательных средах образует, как правило, белесые, выпуклые, блестящие колонии, непрозрачные, встречаются колонии отличные по морфологии от основного типа - мелкие суховатые, крупные прозрачные, отличающиеся друг от друга консистенцией колонии.

О

сл ю

00

о

Оптимальная температура роста штамма 30-37°С, предел от 12 до 43°С, оптимум рН 7,2.

Физиолого-биохимические признаки. Штамм Klebsiella pneumoniae 378 отличает высокая биохимическая активность: усваивает глюкозу, лактозу, маннит, сахарозу, дульцит, рамнозу, ксилозу, мальтозу, сорбит, арабинозу, рафинозу, глицерин, крахмал; восстанавливает нитраты, положителен по каталазе, лизиндекарбок- силазе, в реакции Фогес-Проскауэра; усваивает малонат, цитрат; не выделяет индол, сероводород; отрицателен по уреазе, орни- тиндекарбоксилазе, аргининдегидролазе, в реакции с метиловым красным, по оксидазе, не разжижает желатин. Соотношение Г + Ц 55,4 моль.%.

Штамм Klebsiella pneumoniae 378 обладает устойчивостью к пенициллину, эритромицину, олеандомицину, оксациллину. ристомицину, сульфатиазолу, менкомици- ну, чувствителен к тетрациклину, стрептомицину, мономицину, неомицину, левомицетину, канамицину, полимиксину, ампициллину, гентамицину, рифампицину, слабо чувствителен к карбенициллину.

Штамм хранится в жидкой питательной среде с добавлением глицерина до 15% при минус 60°С.

Продуцируемая предлагаемым штаммом рестриктаза Крп 378 1 характеризуется следующими свойствами: узнает и специфически расщепляет последовательность нук- леотидов CCGCGG; оптимальное значение рН для действия рестриктазы 7,5-8,5; для проявления активности рестриктазы требуются ионы Мд2+, оптимальная концентрация 10 мМ, оптимальная концентрация NaCI в реакционной смеси 50-70 мМ; оптимальная температура 37°С.

Для поддержания штамма Klebsiella Р378 используют рыбный питательный агар (РПА).

Для культивирования и ферментации К. pneumoniae 378 применяют питательную среду следующего состава, г/л дистиллированной воды:

Пептон10

Дрожжевой экстракт5

NaCI5

Глюкоза добавляется перед засевом до 1%.

Культивирование проводят при 30 С с хорошей аэрацией (200 об/мин) на качалке в течение 15-16 ч.

Выход биомассы: 8-12 г/л культураль- ной жидкости.

Выход рестриктазы Крп 3781:40000 ед.акт/г биомассы.

Пример. Культивирование штамма и получение биомассы.

Клетки Klebsiella pneumoniae 378 размораживают при 37°С и высевают в жидкую питательную среду, содержащую пептон (10 г), экстракт (5 г), NaCI (5 г) и дистиллированную воду до 1 л. Глюкозу добавляют перед засевом до 1%. После 24 ч инкубирования в термостате при 30°С

0 штамм высевают на плотную среду с РПА для получения отдельных колоний. Выращивают при тех же условиях. Выросшие клетки переносят петлей с агара в колбы с 50 мл жидкой питательной среды для получения

5 инокулята. Инкубируют на качалке (200- 220 об/мин) 24 ч при 30°С.

Полученным инокулятом засевают объем среды (качалочные колбы по 250 мл среды), предназначенный для ферментации, из

0 расчета 1,0 мл инокулята (стационарной культуры) на 100 мл среды. Инкубируют при тех же условиях в течение 20 ч. После охлаждения клетки собирают центрифугированием при 5000 об/мин. Выход биомассы 9 г

5 влажных клеток на 1 л среды.

Выделение и очистка рестриктазы. 4 г клеток суспендируют в 10 мл буфера А, содержащего 10 мМ трис-HCI, рН 7.6, 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 0,1 мМ ЭДТА, и

0 разрушают на ультразвуковом дезинтеграторе. Обломки клеток удаляют центрифугированием (18000 об/мин, 40 мин при 2°С). Надосадочную жидкость собирают, добавляют к ней 2 М KCI до конечной концентра5 ции 0,1 М и 10%-ный полиэтиленимин до конечной концентрации 0,1%. Смесь тщательно перемешивают и выдерживают во льду в течение 30 мин, затем центрифугируют (6000 об/мин, 10 мин при 2°С). Надоса0 дочную жидкость отбирают и добавляют сульфат аммония до 70%-ного насыщения (при перемешивании на магнитной мешалке). Смесь выдерживают во льду в течение 30 мин, затем центрифугируют

5 (6000 об/мин, 10 мин при 2°С). Супернатант отбрасывают, осадок растворяют в 10 мл буфера А и диализу ют против 300 мл буфера А в течение 2 ч, Далее раствор белков наносят на колонку (2x20 см) с ДЕАЕ-целлюло0 зой (ДЕ-52) и промывают буфером А до исчезновения УФ-поглощающего материала в элюате. Адсорбированный материал элюируют 400 мл линейного градиента КС) (0-0,8 М) в буфере А. Аликвоты из каждой

5 фракции (по 2 мкл) анализируют на содержание рестриктаэы, инкубируя 30 мин при 37°С с 1 мкг ДНК фага А,и анализируют электрофорезом в геле агарозы. Фракции, содержащие фермент, объединяют (общий объем 30 мл) и наносят на колонку (1, см)

с гидроксилапатитом. Колонку промывают буфером Б, содержащим 10 мМ фосфата калия, рН 7,6, 10 мМ 2-меркаптоэтанола и 0,1 мМ ЭДТА, до исчезновения УФ-погло- щающего материала в элюате. Адсорбиро- ванный материал элюируют 150 мл линейного градиента фосфата калия, рН 7,6 (0,01-0,6 М) в буфере Б. Аликвоты из каждой фракции (по 2 мкл) анализируют на содержание рестриктазы. Фракции, содержащие рестриктазу Крп 378 1, объединяют (общий объем 15 мл) и диализуют в течение 16 ч против 150 мл буфера А, содержащего 50%- ный глицерин, и хранят при -20°С.

Выход продукта 40000 ед.акт. на 1 г биомассы. Полученный препарат имеет концентрацию 30000 ед.акт./мл.

Активность фермента определяют в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 10 мМ трис-HCI, рН 8.0,10 мМ MgCIa, 50 мМ NaCI, 10 мМ 2-меркаптоэтанола и 1 мкгДНК фага А,при 37°С. За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного специфического расщепления 1 мкг ДНК фага Я за 1 ч при 37°С.

Полученный ферментный препарат свободен от значительных примесей неспецифических нуклеаз и фосфатаэ. При инкубации 120 ед. акт. фермента с 1 мкг ДНК фага Я в течение 2 ч при 37°С наблюдается стандартный набор фрагментов ДНК. При

инкубации 5 ед.акт. фермента с 1 мкг ДНК фага Я в течение 1 ч при 37°С фрагменты ДНК сшиваются ДНК-лигазой и повторно гидролизуются рестриктазой Крп 378 1.

Для определения последовательности нуклеотидов узнаваемой рестриктазой Крп 378 1 проводят гидролиз ДНК фага Яре- стриктазами Крп 378 1 и Sst II, а также совместный гидролиз этими рестриктазами.

Наблюдаемая картина полного совпадения фрагментов, полученных при гидролизе ДНК рестриктазами Крп 378 1 и Sst II порознь и совместно, указывает на то, что рестриктаза Крп 378 1 является изошизоме- ром рестриктазы Sst II, узнает и расщепляет последовательность нуклеотидов CCGCGG.

Полученный штамм по сравнению с известным обеспечивает повышенный выход целевого фермента, составляющий 40000 ед.акт/г биомассы.

Для культивирования предлагаемого штамма используется простая среда из доступных компонентов.

Поскольку рестриктаза Крп 378 1 имеет сайт узнавания CCGCGG. идентичный сайту узнавания Sst II и известного, она может заменить эти рестриктазы во всех генно-инженерных работах.

Формула изобретения Штамм бактерий Klebsiella pneumonlae

ВКПМ В-4894 - продуцент рестриктазы Крп

3781.