Штамм бактерий КLевSIеLLа рNеUмоNIае, используемый для получения липополисахарида Советский патент 1993 года по МПК C12N1/00 C12R1/22 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологической промышленности в процессе .технологического производства липополи- сахарида (ЛПС) как антигена.

Штамм Klebsiella pneumoniae выделяют из клинического материала больного диареей, он депонирован в коллекции Государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им Л.А.Тарасевича под номером 211 и характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки: грамотри- цательные палочки, спор и жгутиков не имеют, неподвижные.; при окраске в тушевом препарате по Бурой установлена продукция капсулы, размер которой достигает до 1/2

диаметра тела бактериальной клетки. Электронно-микроскопические признаки: палочки с закругленными концами, размер клетки - длина 2,01 + 0,21 мкм при , ширина 1,24 + 0,08 мкм при т 95%, При просмотре более 1000 клеток жгутики неЪбнаружены.

Культуральные признаки: на мясопеп- тонном бульоне через 3 ч при +37 ±0,5°С наступает легкое диффузное помутнение среды, через 16-18 ч - помутнение с пленкой на поверхности среды с наслоением на стенки пробирки. На плотных питательных средах образуют через 18-24 ч при +37- ±0,5°С колонии, которые выглядят следующим образом.

Рост на среде Эндо: колонии темно-розового цвета с более темной окраской в центре, выпуклые с легким серо-металлическим

Х|

00

00

ю о ел

СО

блеском,.маслянистые, .диаметр колоний 1,0-1,5 мм, признаков диссоциации нет.

Рост на среде К-2: колонии светло-желтого цвета, с более выраженной окраской в центре, куполообразные, маслянистые, диаметр колоний 1.0 - 1.5 мм. признаков диссоциации нет.

Рост на среде Ворфеля-Фергюсона: колонии прозрачные, беловатого цвета, выпуклые, маслянистые, диаметр колоний 1,5-2,0 мм, признаков диссоциации нет.

Рост на мясопептонном агаре: светлые полупрозрачные колонии, легко снимаются, диаметр 1.0-1.5 мм, признаков диссоциации нет.

Факультативный анаэроб, оптимальные условия роста-аэробные; рост в диапазоне температур 12-43°С, оптимум +37°С.

Оптимум рН питательной среды 6,8-7,0.

Биохимические признаки:

Штамм K.pneumoniae211 ферментирует с образованием кислоты и газа глюкозу, лактозу, маннит, сахарозу, мальтозу, дульцит, адонит, инозит, сорбит и глицерин; до кислоты - ксилозу и рамнозу. Неподвижный. Утилизирует малонат натрия, цитрат «озера и Симонса . Не образует сероводород и индол. Обладает положительной уреазной активностью. Дает положительную реакцию Фогес-Проскауэр и отрицательную с метиловым красным, что свидетельствует о ферментации глюкозы с образованием ацетилметилкарбинола (ацетоина). Обладает лизиндекарбоксилазой и не обладает орни- тиндекарбоксилазой, аргининдегидролазой и фенилаланиндезаминазой.

Антигенная структура: серотипирова- ние проводят с использованием набора сывороток по капсульному (К) антигену ВНИИ ВС им. С.Мечникова.

Штамм Klebsiella pneumoniae 211 серо- типирован по Е-антигену, как К.pneumonia К16. .

5. Чувствительность к антибиотикам:. .

По результатам исследования методом стандартных дисков штамм чувствителен к неомицину, канамицину, гентамицину, тетрациклину, доксициклину, рифампицину; устойчив: к монОмицину, стрептомицину, зритромицину, метилиллину, левомицетину, ристоми-цину, полимиксину, бензлипени- циллину, оксациллину, карбенициллину, олеамдомицину, ампициллину, линкомици- ну, фузидину.

Способ, условия и состав питательных сред для хранения штамма.

Способы хранения могут быть следующие.

Лифоильно высушенные штаммы в ампулах на сахарозожелатиновой г.педе хранят в холодильнике при +А°С.

На полужидком голбдном агаре следующего состава:

Бульон питательный, содержащий 0,6- 0,9% общего азота,

рН 7,2-7,4 1000мл; Агар 2-4 г.

Способ приготовления среды: агар расплавляют в горячем бульон е, фильтруют, разливают по 8-10 мл в пробирки, стерилизуют при 121°СЗОмин.

Культуру засевают 2-3 уколами в столбик среды, помещают в термостат (37°С) и после 18-20 часового инкубирования заливают 1,0 мл стерильного вазелинового масла. Хранят при+4°С в течение 2-3 мес.

Пример. Штамм Klebsiella

pneumoniae находится в ампулах в лиофиль- но высушенном состоянии. Для производственного процесса производят оживление культуры. С этой целью ампулу вскрывают, содержимое разводят в 2,0 мл мясопептонного бульона. Затем культуру инкубируют в термостате при 37°С - Зч. Живая культура дает диффузно-мутящий рост.

В качестве инокулята используют смыв суточной агарово й культуры плотностью 5-6

млрд м.т./мл. Культивирование проводят при37,1 ± 0,1°С на стационарной установке с емкостью реактора 10 л в течение 4-6 ч. Скорость вращения мешалки 400 об/мин, скорость подачи воздуха 0,2 л/мин. Используют четыре среды: мясопептонный бульон с различными добавками (МПБ)(3 варианта) - среды с белковой основной, среду Ворфеля-Фергюсона - с углеводной основой. Объем питательных сред - 5л, рН 7,2 ±0,1.

Результаты культивирования штамма представлены в табл.1.

. Стабильная урожайность штамма в среднем составляет 4,5 г сухой массы на 5 л бульонной культуры.

Бактериальную массу ресуспендируют в дистиллированной воде (t 65-68°С) в 2,5-кратном объеме к весу осадка, затем приливают эквивалентный объем 90% водного раствора фенола, подогретого до 6568°С. Водно-фенольную эмульсию бактериальной массы выдерживают на водяной бане при той же температуре.в течение 30 мин, после чего охлаждают до 4°С и диализуют против проточной холодной воды 3 сут. Диализат центрифугируют (6000 об/мин 30 мин). В супернатанте содержится ЛПС и нуклеиновые кислоты. Нуклеиновые кислоты (Н К) осаждают цетавлоном, 2%-ный водный раствор цетавлона прибавляют к супернатанту, содержащему ЛПС и НК, в соотношении 1:1. Суспензию выдерживают 30-40 мин при +4°С и затем осаждают центрифугированием (6000 об/мин - 30 мин).

В полученном супернатанте содержится ЛПС, в осадке -- НК.

Лиофильно высушенный препарат ЛПС взвешивают и определяют процент выхода липополисахарида от исходного количества сухой бактериальной массы.

Выход целевого продукта в пересчете на 1 л питательной среды составляет 150 мг сухого вещества. Наибольший выход ЛПС отмечен на среде МПБ с 0,25% глюкозы и набором микроэлементов.

Пример 2. В полученных сериях ЛПС (см. пример 1) определяют общее содержание липидов сульфованилиновым методом и углеводов феноловым методом.

Результаты представлены в табл.2.

Как видно из данных табл.2 количественное соотношение общих липидов и углеводов в 1 г сухого вещества целевого продукта различных серий стабильно. Это соотношение находится в пределах 1:0,02- 1:0,04. .

П р и м е р 3. Отбирают серию ЛПС, полученную из биомассы бактерий, накопленной на мясопептонном бульоне с 25% глюкозы и набором микроэлементов. Отобранным препаратом ЛПС иммунизируют

лабораторных животных (кроликов породы Шиншилла, белых крыс) с полным адьюван- том Фрейнда. Затем о преде л я ют титр антител к ЛПС по Ухтерлони.

РезультатьГпредставлены в табл.3.

Как свидетельствуют данные в табл.3, отобранная серия ЛПС обладает стабильными антигенными свойствами с колебаниями титров антител в пределах не ниже 1:16.

Пример 4. Проводят контрольные серии культивирования штамма на мясопептонном бульоне с 0.25% глюкозы и набором микроэлементов. Результаты представлены в табл.4.

Как следует из данных, представленных в табл.4, проведенные исследования в 1987 г. ив 1988 г. позволяют сделать вывод о том, что штамм K.pneumoniae № 211 при культивировании на мясопептонном бульоне с

0,25% глюкозы и набором микроэлементов характеризуется стабильным выходом биомассы, при этом образующийся ЛПС обладает стабильными биологическими свойствами. Таким образом, полученный

штамм может быть эффективно использован в производственном процессе для получения ЛПС.

Формула изобретения Штамм бактерий Klebslella pneumonlae

ГИСК № 211, используемый для получения липополисахарида.

Т а б л и ц а 1

Использование: биотехнология, диагностика инфекционных заболеваний. Сущность изобретения: получение нового штамма Klebsiella pneumoniae, стабильно продуцирующего лимополисахарид (ЛПС). Штамм Kl.pneumoniae выделен из клинического материала больного диареей. Наиболее благоприятной питательной средой для культивирования штамма служит мясопеп- тонный бульон с 0,25% глюкозы и набором микроэлементов. Урожайность штамма на этой среде составляет 5,42 г сухой массы на 5 л бульонной культуры. Выход целевого продукта в пересчете на 1 л питательной среды составляет 150 мг сухого вещества. Полученный ЛПС оЕ-ладает стабильными антигенными свойствами. При иммунизации лабораторных животных титр образующихся антител составляет 1:16- 1:32. 4 табл. (/т с

Мясопептонный бульон 5, 0 л рН - 7,2 ± 0,1

Мясопептонный бульон с 0,25 глюкозы

с комплексом микроэлементов МПБ с добавками: - 0,02%, 0,2% HgSO,, - 0,022, K2S( -.0,025 МЦС1 - 0,08, СаС1г - 0,01% FeSO - 0,01%, MnSO,, - 0,2% CuSO - 0,04%, Had - 0,5%

ЭДТА-Na - 0,08% Среда Ворфепя-фергосона

NaCl - 0,2%, KtSO - 0,1% MgSO -THjO - 0,025% сахароза - 2%

дрожжевой экстракт - 0,2% сухой

5,42

0,562

10,4

4,56

0,750

16,45

3,71

0,44812,1

2,220,3

13,5

Лаборатоные животные

Доза иммунизации, мг/кг

Кролик серия ЛПС-2

Кролик серия. ЛПС-2

Крысы белые серия ЛПС-2-6

:,/.. .. : . ..ШТ.

Крысы белые серия ЛПС-2-6 шт.

Крысы белые серия ЛПС 2-6 шт.

Таблица 2

Таблица 3

Титр антител в реакции деой- ной диффузии в геле

:32 : 16

: 16 :32 :32

Таблица 4