Штамм бактерий КLевSIеLLа рNеUмоNIае, используемый для получения фимбрий Советский патент 1992 года по МПК C12N1/20 A61K39/02 

Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к биотехнологии, и может найти применение в технологическом процессе получения фимбрии. Последние могут быть использованы для получения специфических антисывороток и созданию на их основе диагностических препаратов.

Цель изобретения - изыскание штамма, стабильно продуцирующего фимбрии, использование которого упрощает способ получения фимбрий как антигенного препарата.

Отечественных аналогов зарегистрировано не было. Штамм К. pneumoniae был выделен из клинического материала больного диареей, депонирован в коллекции Государственного научно- исследовательского института стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов им. Л«А.Тз- расевича за № 206.

Свойства штамма К. pneumoniae № 206.

Морфологические признаки. Грамот- рицательные короткие палочки, неподвижны, жгутиков и опор не образуют При окраске в тушевом препарате по Бурри установлена продукция капсулы, размер которой достигает до 1/2 диаметра тела бактериальной клетки. Электронно-микроскопические данные: палочки с закругленными концами, размер клетки - длина 1,81±0,19 мкм при , ширина 1,04fO,03 мкм при т 95%. При просмотре более 2000 клеток жгутики не обнаружены.

Бактериальные клетки имеют фимбрии, процент клеток несущих фимбрии

-ч

|0 xl

Ы

317776

составляет 88,01-96,76 при р 0,05 ( J 95%, 0,1726). Фимбрии располагаются перитрихиально белее 100 на каждой клеткеоц

Культуральные признаки. На мясо- пептонном бульоне через 3 ч при 37°С наступает легкое диффузное помутнение среды, через 16-18 ч - помутнение с легкой пленкой. На плотных Q питательных средах через 18 ч при 37iO,5°C образуют колонии, которые выглядят следующим образом:

-на среде Эндо: колонии темно- розового цвета (лактозопозитивные) g с более темной окраской в центре, выпуклые с легким металлическим блеском, маслянистые диаметр колоний 1,,0 мм. Признаков диссоциации

нет.20

w на среде колонии светло-желтого цвета с более выраженной окраской в центре, куполообразные, маслянистые, диаметр колоний 1,0-1,5 мм. Признаков диссоциации нет.25

-на мясо-пептонном агаре: светлые полупрозрачные колонии, легко снимаются, диаметр 1,0-1,5 мм. Признаков диссоциации нет.

Физиолого-биохимические признаки. 30 Оптимум роста 37,0+0,5°С, оптимум рН среды - ,2, оптимальные условия - аэробные. Активно расщепляет глюкозу с образованием кислоты и газа, а также лактозу, маннит, сахаро- „ зу, мальтозу, адонит, инозит, сорбит, ксилозу, рамнозу, декарбоксилирует лизин, утилизирует цитрат и малоиат натрия, обладает уреазной активностью, дает положительную реакцию Фо- Q гес-Проскауэра. Не расщепляет дуль- цит, не образует сероводород и индол, в реакции метил-рот отрицательна, орнитиндекарбоксилаза, аргениндегид- ролаза и фенилаланиндезэминаза отсут- ствуют.

Агглютинируется К -сывороткой К-52 и К-54 (набор К-сывороток УНИИВиС им. И.И.Мечникова).

Чувствительность к антибиотикам. Штамм чувствителен к неомицину, мо- номицину, канамицину, полимиксину, гентамицину, устойчив к стрептомицину, эритромицину, метициллину, тетрациклину, ристомицину, пенициллину, оксациллину, карбенициллину, олеан- домицину, линкомицину, фузидину, доксйциклину.

Q

g

0

5

0 Q

0

5

Биологические свойства. Адгезивные свойства определяли по методу Брилис В„И. с соавт, ij с формали- низированными эритроцитами человека О (1) Rh(+) группы крови. Штамм обладает свойствами адгезии средней степени: индекс адгезии - b,k8 при коэффициенте участия эритроцитов - 78, средний показатель адгезии - 3,5.

Вырулентные свойства LD для белых мышей 4 млрд. м„т„

В реакции агглютинации на стекле, в пробирках, планшетах в макро- и микроварианте штамм К. pneuinoniae № 206 не агглютинирует эритроциты человека I, II, III, IV групп крови, а так же эритроциты барана, кролика, белой мыши, крысы, морской свинки, золотистого хомячка и петуха.

Фимбрии штамма К„ pneumoniae № 206 условно названы КФА-1 (клебси- елла, фимбрии продуцирующие адгезии 1).

Штамм К. pneumoniae № 206 является безжгутиковым стабильным продуцентом фимбрии - КФА-1.

Штамм используют следующим образом.

П р и м е р 1. Культуру штамма К. pneumoniae N° 206 засевают в чашки Петри с мясо-пептонным агаром или в пробирки со скошенным агаром (рН 7,0- 7,2) и выращивают при 37±0,5°С в течение 18 ч„ Одну петлю выросшей на поверхности среды культуры осторожно переносят в каплю стерильной водопроводной воды в чашке Петри и суспендируют. Полученную взвесь наносят на предметную сетку электронного микроскопа, покрытую формваровой пленкой, обрабатывают парами формалина, контрастируют 1,5%-ным раствором молиб- дата аммония и исследуют в электронном микроскопе при ускоряющем напряжении 80 кв и увеличении 18000- 21000 раз. На поверхности бактериальных клеток обнаруживают фимбрии расположенные перитрихиально,более 100 на каждой бактериальной клетке. Процент фимбрии образующих клеток составляет 9 -9б%„

П р и м е р 2„ Культуру штамма К. pneumoniae № 206 засевают в пробирку с 5 мл мясопептонного бульона (рН 7,0- 7,2) и выращивают при 37+0,5°С в течение 3 ч. Полученный таким образом инокулят вносят во флаконы объемом 0,5 л со 100 мл мясопептонного

5t

бульона. Флаконы помещают на шуттель аппарат роторного типа (60 циклов в мин, шаг платформы 45 мм) и культиви руют при 37iO,5°C в течение 18 ч. По окончании культивирования культуру инактивируют азидом натрия 1:10000. Далее препараты для электронно-микроскопических исследований получают аналогично примеру 1. Количество фим брий на каждой бактериальной клетке, расположенных перитрихиально, сос тавляет более 100, фимбрийобразующих клеток - 96%.

ПримерЗ- В колбу объемом 3 л, содержащую 300 мл питательной среды вносят 15 мл инокулята, представляющего собой смыв суточной агаровой культуры К. pneumoniae № 206 (5 млрд. м.т„ на 1 мл). Колбу помеща ют на шуттель-аппарат роторного типа (60 циклов в мин, шаг платформы 45 мм) и культивируют в течение 18 ч при 37±0,5°С. По окончании культивирования культуру инактивируют азидом натрия 1:10000. Препараты для электронно-микроскопических исследований получают как в примере 1. Количество фимбрийобразующих клеток составляет 98%, количество фимбрий на каждой клетке - более 100. Для отделения фимбрий от поверхности клеток биомассу вначале осаждают центрифугированием при 5000 об/мин в течение 30 мин при 4° С, затем осадок ресуспендируют в 0,05 М трис-НС1 буфере, рН 7,2 и подвергают обработке на механическом дезинтеграторе Virtus при 20000 Rpifl в течение 5 мин„ Клетки осаждают центрифугированием при 10000 в течение 30 мин при 4°С.

776076

Супернатант, содержащий фимбрий, подвергают исследованию в реакциях агглютинации с антифимбриальной сывороткой К. pneumoniae КФА-1 на стекле или в планшетах для иммунологических реакций с V- или U-образным дном. Для этого на предметное стекло наносят каплю супернатанта, сусIQ пендируют с каплей антисыворотки.

При положительной реакции наблюдает ся образование хлопьев и просветление жидкости, титр препарата 1:32- 1:64,

15 Пример. Изучение способности штамма К. pneumoniae № 206 стабильно продуцировать фимбрий проводили следующим образом: штамм хранят на полужидком голодном агаре под

20 слоем вазелинового масла при 4°С и

лиофильновысушенный, через каждые 6 мес. подвергают исследованию аналогично примеру 1. .

25 Как видно из данных таблицы., штамм К.pneumoniae f° 206 обладает способ- ностью стабильно продуцировать фимбрий

.КАА-1.

Таким образом, штамм К,pneumoniae 30 V 206 является стабильным продуцентом фимбрий КЛА-1, что может быть использовано в производстве фимбрий как ан тигена, необходимого для получения специфических антисывороток и созда- «с нию на их основе диагностических пре паратово

I

Фо рмула изобретения

40 Штамм бактерий Klebsiella pneunw-- niae ГИСК № 206, используемы для получения фимбрий.

Использование: медицинская микробиология, диагностический препарат, антисыворотка, фимбрии К. pneu- moniae. Сущность изобретения: новый штамм Klebsiella pneumoniae TUCK № 206 стабильно продуцирует фимбрин. Его использование упрощает способ получения фимбрий как антигенного препаратаГПолучают фимбрии путем выращивания на жидкой или плотной питательной среде осаждением биомассы, дезинтеграции на механическом дезинтеграторе и центрифугированием при 10000 в течение 30 мин. Супернатант содержит фимбрии КФА-1, дает реакцию агглютинации с антисывороткой в титре 1:32-1:64. 4 пр. 1 табл сл С

Стабильность продукции фимбрий штаммом К. pneumoniae S 206

96,6 96,5 97J 96,9

96,4 96,2 96,9 96,7

100 100 100

17776078

r Продолжение таблицы

96,8 97,

100 100

96,7 97,6

100 100