СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ УСТОЙЧИВОСТИ УРОКИНАЗЫ К НАГРЕВАНИЮ Российский патент 1996 года по МПК C12N9/96 C12N9/72 

Изобретение относится к энзимологии, конкретно к способу повышения устойчивости фермента урокиназы к нагреванию, и может быть использовано для инактивации вирусов, присутствующих в препарате.

Известно, что препараты урокиназы, являющиеся активатором плазминогена, получаемые из мочи или внутренних органов человека [1, 2] обычно контаминированы вирусами, в том числе вирусом гепатита В, что может вызывать нежелательные последствия при использовании этих препаратов в качестве тромболитических средств.

Известно, что урокиназа, являясь белковым веществом, быстро инактивируется при нагревании и потому тепловая стерилизация растворов этого фермента невозможна [3]
Известен способ повышения устойчивости урокиназы к нагреванию для инактивации вирусов [4] принятый за прототип, согласно которому урокиназу растворяют в воде, добавляют 0,1-5% желатина на 1000 ЕД фермента в качестве вещества, повышающего вязкость раствора, и нагревают раствор при 50-70^оС в течение 8-12 ч.

Однако при такой обработке происходит частичная (до 8-10%) потеря исходной активности урокиназы.

Задача изобретения повышение устойчивости урокиназы к нагреванию.

Это достигается тем, что в способе повышения устойчивости урокиназы к нагреванию, включающем растворение этого фермента и добавление к раствору вещества, повышающего вязкость, в качестве растворителя используют 1-5%-ный раствор динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты, который берут из расчета 5-10 мл на 1000 ЕД урокиназы, а в качестве вещества, повышающего вязкость, используют гиалуроновую кислоту из расчета 0,05-0,1 г на 1000 ЕД урокиназы.

Предлагаемый способ позволяет полностью сохранить исходную активность урокиназы и приводит к полное инактивации вирусов. При этом длительность тромболитического эффекта препаратов урокиназы увеличивается до 10-12 ч вместо 4-6 ч по известному способу.

Можно полагать, что такой результат достигается за счет растворения фермента не в воде, а в растворе динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты, которая стабилизирует структуру белков.

Кроме того, гиалуроновая кислота в значительно большей степени, чем желатин, повышает вязкость растворов урокиназы, что также способствует предохранению молекул урокиназы от разрушения при термообработке и пролонгирует ее терапевтическое действие.

Изобретение поясняется чертежом, где
А. Динамика сохранения тромболитической активности препаратов урокиназы при термообработке: кривая 1 известный способ, 60^оС; кривая 2 предлагаемый способ, 60^оС; кривая 3 предлагаемый способ, 80^оС; кривая 4 известный способ, 80^оС.

Б. Динамика пролонгации тромболитического действия урокиназы, полученной по известному способу (кривая 5) и по предлагаемому способу (кривая 6).

П р и м е р 1. 1000 ЕД препарата урокиназы (использовали препарат урокиназы фирмы "Sigma" (США) из почек человека с удельной активностью 10 ЕД/мг) растворяли в 5 мл 1%-ного раствора динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты, к раствору добавляли 0,05 г гиалуроновой кислоты (использовали препарат гиалуроновой кислоты фирмы "Sigma" (США) из петушиных гребней) и смесь нагревали при 75^оС в течение 4 ч. Получали раствор урокиназы, полностью сохранивший исходную активность и не содержащий активных форм вирусов.

П р и м е р 2. 1000 ЕД препарата урокиназы растворяли в 7,5 мл 2,5%-ного раствора динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты, к раствору добавляли 0,075 г гиалуроновой кислоты и смесь нагревали при 80^оС в течение 5 ч. Получали раствор урокиназы, полностью сохранивший исходную активность и не содержащий активных форм вирусов.

П р и м е р 3. 1000 ЕД препарата урокиназы растворяли в 10 мл 5%-ного раствора динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты, к раствору добавляли 0,1 г гиалуроновой кислоты, нагревали при 85^оС 6 ч и получали раствор урокиназы, полностью сохранивший исходную активность и не содержащий активных форм вирусов.

Сопоставительный анализ технико-экономических показателей известного способа и заявленного объекта приведен в таблице.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет полностью сохранить исходную активность урокиназы при нагревании при 75-80^оС в течение 4-6 ч, что приводит к надежной дезактивации вирусов в препарате, в то время как по известному способу нагревание растворов фермента при 50-70^оС в течение 8-12 ч или при 75-80^оС в течение 4-6 ч приводит к потере соответственно 8 и 35% исходной активности урокиназы. При этом использование в предлагаемом способе в качестве вещества, повышающего вязкость раствора, гиалуроновой кислоты, позволяет пролонгировать тромболитическое действие фермента до 10-12 ч.

Использование: в биотехнологии и энзимологии, для инактивации вирусов, присутствующих в препарате. Сущность изобретения: 1000 ЕД препарата урокиназы растворяют в 7,5-10 мл 1,0-5%-ного раствора динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты, к полученному раствору добавляют 0,05-0,1 г гиалуроновой кислоты и нагревают при 75-85^oС в течение 4-6 ч. Полученный раствор фермента полностью сохраняет исходную активность и не содержит активных форм вирусов. 1 ил., 1 табл.

Способ повышения устойчивости урокиназы к нагреванию, включающий растворение фермента и добавление к раствору вещества, повышающего вязкость, отличающийся тем, что в качестве растворителя используют 1 5%-ный раствор динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты, который берут из расчета 5 10 мл на 1000 ЕД урокиназы, а в качестве вещества, повышающего вязкость, используют гиалуроновую кислоту из расчета 0,05 0,1 г на 1000 ЕД урокиназы.